כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

מחקר זה מתמקד בחומרים ביולוגיים רכים ומטרתו לחקור את המנגנונים הפיזיקליים הבסיסיים המווסתים צורה וארגון וחומרים בהשראת תאים ביולוגיים.

מערכות ביולוגיות ומודלים במבחנה הן מורכבות מטבען עם מלכודות רבות, והכנת הדגימות היא קריטית לשחזור שלהן. פרוטוקול זה נועד לשפר את יכולת השחזור במערכות אלה.

תוצאות אלה סוללות את הדרך לזיהוי, אפיון והבנת התפקוד של כוחות פיזיקליים וביו-חומרים. זה עשוי להיות ניתן להכללה לביופולימרים ואברונים שונים.

[קריין] כדי להתחיל, הכינו את הדגימה לטעינה על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר של מאגר 10XF בצינור מיקרו צנטריפוגה והוסיפו נפח של מים מזוקקים נטולי יונים כך שנפח הדגימה הסופי יהיה 50 מיקרוליטר לאחר הוספת שאר הרכיבים. פיפטה מיקרוליטר אחד של 25% בטא-מרקפטואתנול, מיקרוליטר אחד של 225 מיליגרם למיליליטר גלוקוז, מיקרוליטר אחד של תערובת של גלוקוז אוקסידאז ו-85,000 יחידות למיליליטר זרז לתמיסה. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של 25 מילי-מולרי ATP ו-10 מיקרוליטר של 2%, 15 סנטיפואז מתיל צלולוז, ומערבבים היטב על ידי פיפטינג. כדי להתחיל בפילמור אקטין, מערבבים אקטין ללא תווית עם אקטין מסומן ומוסיפים את תערובת האקטין לתמיסת חיץ F המוכנה. פיפטו את התמיסה למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב נכון. השאירו את האקטין להתפלמר בטמפרטורת החדר בצינור המיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, כדי להכין תא זרימה, הניחו שתי חתיכות של סרט דו צדדי במקביל זו לזו לרוחב שקופית המיקרוסקופ כדי ליצור את גבולות תעלת תא הזרימה. מקם את החלקת הכיסוי מעל תעלת הסרט וודא שהיא בניצב לשקופית המיקרוסקופ. לחץ כלפי מטה על אזור החלקה של הכיסוי שנמצא במגע עם הסרט הדו-צדדי כדי ליצור אטימה טובה ולמנוע כיסי אוויר. בעזרת סכין גילוח, חתוך כל סרט עודף משקופית המיקרוסקופ והחלקת הכיסוי כך שהסרט הגלוי היחיד נמצא בתוך תעלת הדגימה. כדי להכין תא דגימת צילינדר לשתי דגימות משטח, שטפו תחילה את החלקת הכיסוי באתנול, מים ואתנול. יבש אותו באוויר מסונן. מרחו שכבה דקה של אפוקסי של חמש דקות כדי להדביק את גליל שיבוט הזכוכית להחלקת הכיסוי. הוסף 3.5 מיקרוליטר של תמיסת פעילי שטח שמן לצינור מיקרו צנטריפוגה שקוף או בהיר. מבלי לערבב, פיפטה חמישה מיקרוליטר מתמיסת האקטין על החלק העליון של שכבת פעילי השטח של השמן. סגור את הצינור. החזק את החלק העליון של צינור המיקרו צנטריפוגה והחלק את הקצה התחתון ליצירת קצף ראשוני עם תחליב גלוי והמשך להחליק עד ליצירת מיקרו אמולסיות אחידות. לפני טעינת תא הזרימה, מערבבים כמות קטנה של אפוקסי של חמש דקות. כדי לטעון תא זרימה, פיפטה 1 עד 3 מיקרוליטר של תמיסת פעילי שטח שמן לתוך תעלת הדגימה של תא הזרימה כדי ליצור פקק קטן שמרטיב את התעלה. הטה את תא הזרימה כדי להסיר כל פער אוויר שנוצר עקב נסיגת המניסקוס של פעילי השטח בשמן לפני הוספת הדגימה. פיפטה מיד את תרחיף תחליב תמיסת הדגימה לכניסה של תא הזרימה כדי למלא את התעלה. אטום כל צד של תעלת תא הזרימה באפוקסי של חמש דקות. כדי לטעון את תא דגימת הצילינדר עבור דגימות שאינן תחליב, פיפטה חמישה מיקרוליטר של תמיסת פעילי שטח שמן לתחתית תא גליל הזכוכית. הטה וסובב לאט את החלקת הכיסוי כדי לצפות את המשטח ואת הגליל התחתון בתמיסת פעילי שטח. הסר עודפי תמיסת פעילי שטח של שמן באמצעות פיפטה לקבלת שכבה דקה תוך מניעת אידוי מוחלט של השמן. הוסף מיד את תמיסת המדגם לתא. מכסים את החדר בחתיכה קטנה של פוליטטרפלואורואתילן, או סרט PTFE, כדי למנוע אידוי וזרימה. התקן את הדגימה על שלב המיקרוסקופ. התחל הדמיית זמן-lapse של אקטין באמצעות מטרה של 20x, 40x, 60x או 100x עם טבילה בשמן או במים כדי להבטיח צמצם מספרי גבוה מספיק להדמיה ברזולוציה גבוהה. אם מתפלמרים בתא דגימה, אפשר פילמור למשך כ-30 דקות או עד שאין התארכות נימה או תנועה נראית לעין. הוסף מקשר צולב לדגימה, ולאחר מכן הוסף מיוזין כחוטים מפולימרים מראש על ידי פיפטינג איטי של כמחצית מהנפח הכולל לתוך הדגימה. לבסוף, התחל את הדמיית הזמן. תמונת הקרינה הקונפוקלית המייצגת של רשת האקטין השזורה מוצגת כאן. רשת האקטין הסבוכה מפוזרת באופן אחיד על פני השטח. כתמים בהירים בתמונה זו מייצגים חפיפות חוטים, בעוד שאזורים כהים מצביעים על נוכחות אקטין מינימלית. תנודות תרמיות מובילות לשינויי עוצמה מקומיים וכיפוף גלוי של חוטי אקטין. תוספת של מיוזין II גורמת לכיפוף וארגון מחדש של רשת האקטין עם הצטברות גלויה של מיוזין פונקטה בזמנים ארוכים. התכווצות הרשת תלויה בריכוז המיוזין ובריכוז ה-ATP. ברשתות אקטין צולבות, התכווצות הנגרמת על ידי מיוזין מובילה לתנועה מתואמת בקנה מידה ארוך יותר בהשוואה לרשתות שזורות.