זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים
17 באוקטובר 2025
זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (<1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.
המחקר שלי מפתח שיטות מיקרוסקופיה אופטית לשימור תכונות תאיות בלמלה קריוגנית במהלך מילינג בקרן יונים ממוקדת, ומאפשרות ניתוח מפורט באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית לחשיפת ארגון ביולוגי טבעי. מיקרוסקופיה אופטית שולבה במערכות CryoFIB-SEM, אך לעיתים נדירות באותו מיקום כמו ה-FIB. דבר זה מחייב גישות הנחיות מבוססות רישום לשימור מטרות מסומנות פלואורסצנטיות בלמלה הסופית.
כדי להתחיל, קרר ידנית את תחנת ההעברה באמצעות חנקן נוזלי כאשר השלב הגיע לטמפרטורות קריוגניות. טען אוטוגריד אחד עם קליפ לקלטת הדגימה שתוכננה למערכת מיקרוסקופיית אור קריוגנית. ודא שהרשת האוטומטית ממוקמת בין החלקה המודבקת לבין המרווח.
הדק את בורג הטבעת כדי לסגור את הקסטה ולהכניס אותו לחריץ בתחנת ההעברה. חבר את תחנת ההעברה למערכת המיקרוסקופיה של האור הקריוגני. השתמש במצלמת התא הפנימי כדי להנחות את קלטת הדגימה אל שלב הדגימה.
בתוכנת מיקרוסקופ אור, העבר את שלב הדגימה ממצב הטעינה למיקום מוגדר מראש עם שלוש קרניים. בתוכנת FIB-SEM, הגדר את ההגדלה ל-100X ולחץ על החלון השמאלי העליון. בלשונית היישור של תוכנת מיקרוסקופיית האור, לחץ על ה-Z ובחר בפונקציית Play כדי לקבל אטלס SEM של הרשת.
זהה אזור ריבועי עם שכבת פחמן שבורה ולחץ עליו פעמיים כדי להעביר את שלב הדגימה לאותו מיקום. חזור לממשק התוכנה. הפעל את ה-FIB וקבל תמונה.
כוון את ההגדלה באמצעות תפריט הנפתח בפינה השמאלית העליונה. לחץ על Play כדי להציג את תמונת FIB. לאחר מכן קבע את גודל הצעד באמצעות סרגל ההחלקה.
כעת לחץ על Z ו-Z כדי לכוון את מיקום השלב Z עד שהקו האופקי שנמצא ביון ובתמונות האלקטרונים יתיישרו עם אותה תכונה. בחר בלשונית SEM בתוכנת מיקרוסקופיית האור. השתמש בכפתורי X ו-Y של או כדי ליישר תכונה משותפת בין ה-SEM לתמונות היון.
עכשיו תדליק את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. בחר בלשונית FLM, הגדר תנאי הדמיית אור מוחזר, ובחר ב-Play. לאחר מכן יישר את תמונת האור המוחזר עם תמונת SEM.
התקרב לתמונה ולחץ על אפשרות המלבן כדי להגדיר דפוס חירום לקרן היונים. לחץ על Start Pattern בתצוגה 2 כדי ללטף תבנית קטנה באמצעות קרן יונים ממוקדת. ודאו שהדפוס המעובד נראה הן בקרן היונים הממוקדת והן בתצוגות המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
בתוכנת המיקרוסקופיה האורית, עברו ללשונית הלוקליזציה והפעילו את התנאים המתאימים להגדרת תעלות הפלואורסצנטיות. הקצו כל פלואורופור לערוץ נפרד וכללו ערוץ נוסף ל-brightfield. כוון את עוצמת ה-LED וזמן החשיפה לכל ערוץ פלואורסצנטי כדי לזהות את היעד הרצוי.
כאשר הפרמטרים מספקים, יש לרכוש סטאק פלואורסצנטי של Z לפני מילינג על ידי מעבר בכיוון הצירי. ואז לסמן את היעד כאזור עניין. עבור לתוכנת FIB-SEM וצייר למלה באזור העניין.
בצע מילינג גס כדי להסיר את החומר הנפחי תוך שמירה על מיקרוסקופ הפלואורסצנציה כדי לעקוב אחר שינויים באות. פתח את ערכת הכלים האינטרפרומטרית מבוססת Python מהטרמינל כדי לנטר אות פלואורסצנטי במהלך דילול למלה. דללו את התשואה לכ-2 מיקרומטרים באמצעות מצב חתך הניקוי.
עבור מטרה עם רוחב צירי של מעל 300 ננומטר, בממשק המשתמש של פייתון בחרו את המטרה במיקרוגרף הפלואורסצנטי. התוכנה תתחיל אוטומטית לשרטט בהירות כפונקציה של הזמן עם כל פריים חדש. מעקב אחרי עוצמת הפלואורסצנציה דרך ערכת הכלים של פייתון.
לטחן את הדגימה באמצעות מצב חתך ניקוי כדי להסיר כל סרט תמיכה שנותר מתחת לאזור הרצוי. שימו לב לירידות פתאומיות בעוצמת הפלואורסצנציה כסימנים לשינוי כיוון המילינג. אם נראית ירידה חדה בעת הטחינה מלמטה למעלה, עצור והתחל לחרוט מלמעלה למטה.
לאחר סיום הטחינה מלמעלה למטה, לסיים את הלמלה על ידי טחינה מלמטה כלפי מעלה במצב חתך ניקוי עד לעובי הרצוי. לאחר מכן צלם תמונת פלואורסצנציה לאחר הטחינה של הלמלה. העבר את הדגימה ל-CryoTEM.
טען את תמונת הפלואורסצנציה הרב-ערוצית לאחר המילינג ואת תמונת ההקרנה CryoTEM לתוכנת הטרנספורמציה הפרויקטיבית המותאמת אישית לרישום אזורי עניין. כעת בחר שמונה עד עשר זוגות של נקודות ייחוס הנראות הן בתמונות פלואורסצנטיות והן במיקרוסקופ אלקטרוני כדי לחשב טרנספורמציה פרויקטיבית. השתמשו בתמונה המונחת כמדריך לבחירת אזור הדמיה.
לאחר מכן בחר פרמטרים מתאימים להגדלה ורכישה לסדרת ההטיה בהתאם לגודל מבנה היעד ולרזולוציה הרצויה. תאי מקרופאג מופרדים שסומנו ב-SiR-Tubulin הציגו נקר פלואורסצנטי בהיר יחיד, בקוטר של כ-מיקרומטר אחד, התואם ל-MTOC, יחד עם מבנים דמויי פיברו שקרנו לעבר פריפריית התא התואמים לרשת המיקרוטובולים. כאשר הדגימה טוחנה לעובי של כ-800 ננומטר, הנקן הפלואורסצנטי היחיד של MTOC התפרק לשני נקודות מובחנות, כל אחד בקוטר של כ-700 ננומטר.
עוצמת הפלואורסצנציה עלתה לאחר הסרת חומר לא פלואורסצנטי ושכבת התמיכה הסופגת, ואחריה ירידה חדה כאשר הלמלה דללה עוד יותר משני מיקרומטרים לפחות מ-200 ננומטר. פלואורסצנציה קריוגנית ומיקרוסקופ אלקטרונים מתואמים אפשרו מיקוד מדויק של מבנים במהלך הטחינה. טומוגרפיות משוחזרות ומודלים מקוטעים מראים שהצנטריולים מורכבים משלישיות מיקרוטובולות.
במקרים שבהם נשמר רק נקודה פלואורסצנטית אחת בלמלה הסופית, צופה צנטריול יחיד בטומוגרפיה המתאימה. דיוק הפלואורסצנציה המבוסס על מילמילינג מוגבל על ידי גישות רישום, הסובלות רבות מרזולוציה מוגבלת בדיפרקציה, חוסר התאמה במקדם השבירה וגם תנועה הנגרמת על ידי מילינג. מיקרוסקופיה אופטית סימולטנית וחריכת FIB מסירה שגיאות רישום על ידי שימוש במשוב בזמן אמת ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית להנחיית תהליך הטחינה.
זה מונע טעויות הנובעות מגבלת הדיפרקציה וחוסר התאמה במקדם השבירה, ומאפשר טחינה מדויקת ששומרת על מבנים מסומנים פלואורסצנטית לטומוגרפיית קריואלקטרונים בתוך הלמלה הסופית. המחקר שלנו מאפשר לראות מבנים תאיים שבעבר היה קשה להמחיש ישירות באמצעות קריו-ET, ובכך מאיר את המנגנונים המולקולריים שמאחורי ספקטרום רחב של מכונות מיקרומולקולריות מרכזיות.
סקירה כללית
תהליך זה מאפשר ייצור של למלות קריוגניות המכוונות למבנים ביולוגיים מסומנים בפלואורסצנציה שהם קטנים ונדירים. שילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, טחינה בקרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בעמדת פוקוס יחידה מאפשר צילום בו-זמני וטחינה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- שיטות מיקרוסקופיה אופטית הן חיוניות לשימור מאפיינים תאיים במהלך הטחינה.
- שילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית במערכות CryoFIB-SEM הוא נדיר.
- הנחייה מבוססת רישום נחוצה כדי לשמור על מטרות מסומנות בפלואורסצנציה.
- הבנת הארגון הביולוגי המקורי היא חיונית לניתוח מפורט.
מטרת המחקר
- לפתח שיטות לשימור מאפיינים תאיים בלמלות קריוגניות.
- לאפשר ניתוח מפורט באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית.
- לשפר את הדיוק של מיקוד מבנים פלואורסצנטיים במהלך הטחינה.
שיטות ששימשו
- קירור ידני של תחנת ההעברה באמצעות חנקן נוזלי.
- שילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מערכות FIB-SEM.
- רכישת סטקים של פלואורסצנציה טרום טחינה.
- ניטור עוצמת הפלואורסצנציה במהלך הטחינה באמצעות ערכת כלים של Python.
תוצאות עיקריות
- עוצמת הפלואורסצנציה גדלה לאחר הסרת חומר בסיסי שאינו פלואורסצנטי.
- פלואורסצנציה קריוגנית מתוזמנת עם מיקרוסקופיה אלקטרונית אפשרה מיקוד מדויק.
- טומוגרמות משוחזרות חשפו את מבנה הצנטריונים.
- הדמיה של צנטריול בודד הושגה במקרים מסוימים.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטות יעילות לייצור למלות קריוגניות.
- מיקוד מבוסס פלואורסצנציה משפר את הדיוק של ניתוח מבני.
- שילוב של טכניקות הדמיה משפר את ההבנה של הארגון הביולוגי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Simultaneous cryogenic fluorescence, electron, and ion beam microscopy enables precise, real-time targeting of rare cellular structures during lamella preparation for cryo-electron tomography. This workflow eliminates registration errors and enhances the preservation of disease-relevant subcellular features, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking. The approach supports higher predictive confidence in structural biology pipelines and facilitates risk-adjusted portfolio decisions for complex biological targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and preservation of fluorescently labeled subcellular targets during sample preparation.
- Reduces ambiguity in mechanistic studies by maintaining structural integrity of rare or small features.
- Improves predictive confidence for target validation by correlating fluorescence with ultrastructural data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lamellae for downstream high-resolution imaging and quantitative analysis.
- Supports reproducible sample preparation by integrating real-time fluorescence feedback during milling.
- Facilitates standardization of workflows for screening rare cellular events or phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural preservation with translational biomarker discovery when fluorescent labels mark disease-relevant features.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting correlative imaging strategies.
- De-risks advancement decisions by providing high-fidelity structural data on targets of interest.
Pipeline & Workflow Integration
This tri-coincident imaging workflow integrates at the interface of discovery biology and structural analysis, bridging early target validation with preclinical model characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of labeled structures during milling.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lamella preparation for downstream imaging assays.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence intensity measurements to guide and document sample processing.
- Translational Research: Maintains alignment between molecular labeling and ultrastructural readouts for biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for targeting diverse cellular structures across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of lamella preparation for high-resolution imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust structural data on rare targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct structural evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic microscopy, fluorescence imaging, and focused ion beam operation.
- Demands integrated instrumentation capable of simultaneous tri-modal imaging and milling.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and sample handling protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or labeling strategies.
- Practical limitations include fluorescence signal stability and potential milling-induced motion artifacts.
