זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

המחקר שלי מפתח שיטות מיקרוסקופיה אופטית לשימור תכונות תאיות בלמלה קריוגנית במהלך מילינג בקרן יונים ממוקדת, ומאפשרות ניתוח מפורט באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית לחשיפת ארגון ביולוגי טבעי. מיקרוסקופיה אופטית שולבה במערכות CryoFIB-SEM, אך לעיתים נדירות באותו מיקום כמו ה-FIB. דבר זה מחייב גישות הנחיות מבוססות רישום לשימור מטרות מסומנות פלואורסצנטיות בלמלה הסופית.

כדי להתחיל, קרר ידנית את תחנת ההעברה באמצעות חנקן נוזלי כאשר השלב הגיע לטמפרטורות קריוגניות. טען אוטוגריד אחד עם קליפ לקלטת הדגימה שתוכננה למערכת מיקרוסקופיית אור קריוגנית. ודא שהרשת האוטומטית ממוקמת בין החלקה המודבקת לבין המרווח.

הדק את בורג הטבעת כדי לסגור את הקסטה ולהכניס אותו לחריץ בתחנת ההעברה. חבר את תחנת ההעברה למערכת המיקרוסקופיה של האור הקריוגני. השתמש במצלמת התא הפנימי כדי להנחות את קלטת הדגימה אל שלב הדגימה.

בתוכנת מיקרוסקופ אור, העבר את שלב הדגימה ממצב הטעינה למיקום מוגדר מראש עם שלוש קרניים. בתוכנת FIB-SEM, הגדר את ההגדלה ל-100X ולחץ על החלון השמאלי העליון. בלשונית היישור של תוכנת מיקרוסקופיית האור, לחץ על ה-Z ובחר בפונקציית Play כדי לקבל אטלס SEM של הרשת.

זהה אזור ריבועי עם שכבת פחמן שבורה ולחץ עליו פעמיים כדי להעביר את שלב הדגימה לאותו מיקום. חזור לממשק התוכנה. הפעל את ה-FIB וקבל תמונה.

כוון את ההגדלה באמצעות תפריט הנפתח בפינה השמאלית העליונה. לחץ על Play כדי להציג את תמונת FIB. לאחר מכן קבע את גודל הצעד באמצעות סרגל ההחלקה.

כעת לחץ על Z ו-Z כדי לכוון את מיקום השלב Z עד שהקו האופקי שנמצא ביון ובתמונות האלקטרונים יתיישרו עם אותה תכונה. בחר בלשונית SEM בתוכנת מיקרוסקופיית האור. השתמש בכפתורי X ו-Y של או כדי ליישר תכונה משותפת בין ה-SEM לתמונות היון.

עכשיו תדליק את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. בחר בלשונית FLM, הגדר תנאי הדמיית אור מוחזר, ובחר ב-Play. לאחר מכן יישר את תמונת האור המוחזר עם תמונת SEM.

התקרב לתמונה ולחץ על אפשרות המלבן כדי להגדיר דפוס חירום לקרן היונים. לחץ על Start Pattern בתצוגה 2 כדי ללטף תבנית קטנה באמצעות קרן יונים ממוקדת. ודאו שהדפוס המעובד נראה הן בקרן היונים הממוקדת והן בתצוגות המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.

בתוכנת המיקרוסקופיה האורית, עברו ללשונית הלוקליזציה והפעילו את התנאים המתאימים להגדרת תעלות הפלואורסצנטיות. הקצו כל פלואורופור לערוץ נפרד וכללו ערוץ נוסף ל-brightfield. כוון את עוצמת ה-LED וזמן החשיפה לכל ערוץ פלואורסצנטי כדי לזהות את היעד הרצוי.

כאשר הפרמטרים מספקים, יש לרכוש סטאק פלואורסצנטי של Z לפני מילינג על ידי מעבר בכיוון הצירי. ואז לסמן את היעד כאזור עניין. עבור לתוכנת FIB-SEM וצייר למלה באזור העניין.

בצע מילינג גס כדי להסיר את החומר הנפחי תוך שמירה על מיקרוסקופ הפלואורסצנציה כדי לעקוב אחר שינויים באות. פתח את ערכת הכלים האינטרפרומטרית מבוססת Python מהטרמינל כדי לנטר אות פלואורסצנטי במהלך דילול למלה. דללו את התשואה לכ-2 מיקרומטרים באמצעות מצב חתך הניקוי.

עבור מטרה עם רוחב צירי של מעל 300 ננומטר, בממשק המשתמש של פייתון בחרו את המטרה במיקרוגרף הפלואורסצנטי. התוכנה תתחיל אוטומטית לשרטט בהירות כפונקציה של הזמן עם כל פריים חדש. מעקב אחרי עוצמת הפלואורסצנציה דרך ערכת הכלים של פייתון.

לטחן את הדגימה באמצעות מצב חתך ניקוי כדי להסיר כל סרט תמיכה שנותר מתחת לאזור הרצוי. שימו לב לירידות פתאומיות בעוצמת הפלואורסצנציה כסימנים לשינוי כיוון המילינג. אם נראית ירידה חדה בעת הטחינה מלמטה למעלה, עצור והתחל לחרוט מלמעלה למטה.

לאחר סיום הטחינה מלמעלה למטה, לסיים את הלמלה על ידי טחינה מלמטה כלפי מעלה במצב חתך ניקוי עד לעובי הרצוי. לאחר מכן צלם תמונת פלואורסצנציה לאחר הטחינה של הלמלה. העבר את הדגימה ל-CryoTEM.

טען את תמונת הפלואורסצנציה הרב-ערוצית לאחר המילינג ואת תמונת ההקרנה CryoTEM לתוכנת הטרנספורמציה הפרויקטיבית המותאמת אישית לרישום אזורי עניין. כעת בחר שמונה עד עשר זוגות של נקודות ייחוס הנראות הן בתמונות פלואורסצנטיות והן במיקרוסקופ אלקטרוני כדי לחשב טרנספורמציה פרויקטיבית. השתמשו בתמונה המונחת כמדריך לבחירת אזור הדמיה.

לאחר מכן בחר פרמטרים מתאימים להגדלה ורכישה לסדרת ההטיה בהתאם לגודל מבנה היעד ולרזולוציה הרצויה. תאי מקרופאג מופרדים שסומנו ב-SiR-Tubulin הציגו נקר פלואורסצנטי בהיר יחיד, בקוטר של כ-מיקרומטר אחד, התואם ל-MTOC, יחד עם מבנים דמויי פיברו שקרנו לעבר פריפריית התא התואמים לרשת המיקרוטובולים. כאשר הדגימה טוחנה לעובי של כ-800 ננומטר, הנקן הפלואורסצנטי היחיד של MTOC התפרק לשני נקודות מובחנות, כל אחד בקוטר של כ-700 ננומטר.

עוצמת הפלואורסצנציה עלתה לאחר הסרת חומר לא פלואורסצנטי ושכבת התמיכה הסופגת, ואחריה ירידה חדה כאשר הלמלה דללה עוד יותר משני מיקרומטרים לפחות מ-200 ננומטר. פלואורסצנציה קריוגנית ומיקרוסקופ אלקטרונים מתואמים אפשרו מיקוד מדויק של מבנים במהלך הטחינה. טומוגרפיות משוחזרות ומודלים מקוטעים מראים שהצנטריולים מורכבים משלישיות מיקרוטובולות.

במקרים שבהם נשמר רק נקודה פלואורסצנטית אחת בלמלה הסופית, צופה צנטריול יחיד בטומוגרפיה המתאימה. דיוק הפלואורסצנציה המבוסס על מילמילינג מוגבל על ידי גישות רישום, הסובלות רבות מרזולוציה מוגבלת בדיפרקציה, חוסר התאמה במקדם השבירה וגם תנועה הנגרמת על ידי מילינג. מיקרוסקופיה אופטית סימולטנית וחריכת FIB מסירה שגיאות רישום על ידי שימוש במשוב בזמן אמת ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית להנחיית תהליך הטחינה.

זה מונע טעויות הנובעות מגבלת הדיפרקציה וחוסר התאמה במקדם השבירה, ומאפשר טחינה מדויקת ששומרת על מבנים מסומנים פלואורסצנטית לטומוגרפיית קריואלקטרונים בתוך הלמלה הסופית. המחקר שלנו מאפשר לראות מבנים תאיים שבעבר היה קשה להמחיש ישירות באמצעות קריו-ET, ובכך מאיר את המנגנונים המולקולריים שמאחורי ספקטרום רחב של מכונות מיקרומולקולריות מרכזיות.