מידול זיהום מתמשך של Pseudomonas aeruginosa בזחלי דג זברה פצועים

זיהום כרוני הנגרם על ידי החיידק Pseudomonas aeruginosa סובלני לאנטיביוטיקה וקשה מאוד לטיפול. מטרתנו היא לפתח מודל in vivo שיאיץ את גילוי הטיפולים היעילים. תרופות אנטיבקטריאליות נבדקות לרוב במבחנה, ובדיקת תרופות בעכברים נגועים כרוניים היא אתגר מורכב. כדי למלא את הפער בין שתי הגישות הללו, אנו מציעים מודל פרה-קליני חלופי באמצעות זחלי דג זברה פצועים. המודל שלנו לזיהום מתמשך בדגי זברה המבוסס על שימוש בזן קליני של Pseudomonas aeruginosa משחזר עמידות לאנטיביוטיקה. בעוד שהזרקת מיקרו משמשת בדרך כלל להדבקת זחלי דג הזברה, שיטת הפציעה שלנו משקפת מצב זיהום טבעי ומתאימה היטב לסינון תרכובות טיפוליות.

[קריין] כדי להתחיל, הנח מחטים בגודל 25 על גבי שני מקלות אכילה כדי להקל על הטיפול. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, זהה והסר עוברים המראים התפתחות לא תקינה או שאינם ברי קיימא. הזיזו את הצלחת בתנועה סיבובית כדי לאסוף את העוברים הנותרים במרכז. כעת, השתמש בשתי מחטים בכיוון אנכי כדי לבודד כל עובר, ומקם את המחט השמאלית בזנב כדי לשמור על הגוף ישר. בעזרת המחט הימנית, בצע חתך בודד בקצה החריץ כדי להסיר את הסנפיר. השלם כל חיתוך במהירות, וודא שכל העוברים טובלים בתמיסת חיידקים תוך 10 דקות. עבור הליך ההדבקה, מערבל את תמיסת Pseudomonas aeruginosa מתחת לארון בטיחות ביולוגי מסוג 2, והוסף אותו בערך פעם 10 בחזקת שבע יחידות יוצרות מושבה למיליליטר לצלחת של שש בארות. השתמש בפיפטה פסטר חד פעמית מזכוכית כדי לאסוף את העוברים הפצועים, ולהעביר אותם לתמיסת החיידקים. דגרו את צלחת שש הבארות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות. לאחר הדגירה, יש להחזיר את העוברים הנגועים ולהניח אותם תחת הבטיחות המיקרוביולוגית לשטיפה. כעת, העבירו את העוברים עם פיפטת זכוכית ל -10 מיליליטר מי דגים ללא מתילן כחול, מזערו את הנפח המועבר ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את העוברים שוב עם פיפטה מזכוכית לארבעה מיליליטר מי דגים ללא מתילן כחול, ודגרו לזמן קצר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, העבירו את העוברים הנגועים בנפרד לצלחת של 24 בארות, והוסיפו מיליליטר אחד של מי דגים ללא מתילן כחול לכל באר. מניחים את צלחת 24 הבארות באינקובטור המוגדר על 28 מעלות צלזיוס. הכן צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עם 95 מיקרוליטר של 1X PBS לכל זחל נגוע. העבירו את הזחלים לצלחת בת שש בארות המכילה ארבעה מיליליטר מי דגים ללא מתילן כחול כדי לשטוף ולהסיר חיידקים פלנקטוניים. מניחים כל עובר שטוף בצינור מיקרו-צנטריפוגה עם PBS, ומעבירים כמה שפחות נוזלים. כעת, השתמשו בעלי כדי לרסק כל עובר כנגד הצד של צינור המיקרו-צנטריפוגה, והשאירו את העלי בתוך הצינור לאחר מכן. לאחר מכן, הרם את העלי והוסף 100 מיקרוליטר של 2% PBS Triton כדי לשטוף שאריות חיידקים מהעלי, ולהשיג ריכוז סופי של 1%. מערבל את הצינור ודוגר למשך 10 דקות. לאחר מכן, חלקו שלוש טיפות של 10 מיקרוליטר של ליזאט לא מדולל מכל עובר על צלחות אגר LB. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לדלל באופן סדרתי כל ליזאט בצלחת של 96 בארות עד 10 בחזקת דילול מינוס שלוש. לבסוף, חלקו שלוש טיפות של 10 מיקרוליטר מהדילולים ליד הכתמים הלא מדוללים. ולדגור לילה ב-37 מעלות צלזיוס. כל ארבעת המבודדים של סיסטיק פיברוזיס Pseudomonas aeruginosa היו פחות אלימים באופן משמעותי במודל העובר הפגוע בהשוואה לזן הייחוס PAO1. בעוברים שנדבקו בשני מבודדים, העומס החיידקי הופחת באופן ניכר במשך שלושה ימים, מה שמעיד על חיסול חיידקים. לעומת זאת, שני המבודדים האחרים, B6513 ו-RP73, שמרו על עומס חיידקים יציב יחסית בין 18 ל-65 שעות לאחר ההדבקה לאחר ירידה ראשונית, מה שמרמז על התמדה. טיפול קצר של 30 דקות בטוברמיצין 1.5 שעות לאחר ההדבקה הפחית באופן דרסטי את העומס החיידקי בעוברים שנדבקו בבידוד B6513. לטוברמיצין לא הייתה השפעה משמעותית על העומס החיידקי כאשר ניתן 24 או 48 שעות לאחר ההדבקה, מה שהפגין עמידות בשלבי הדבקה מתמשכים.