מודל רקמות תלת מימדי בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות ספי אלקטרופורציה
19 באוגוסט 2025
פרוטוקול זה משתמש במודלים חישוביים כדי לכמת ספי אלקטרופורציה הפיכים ובלתי הפיכים באמצעות התפלגות מרחבית של תאים שעברו טרנספטציה בתוך חיקוי רקמה תלת מימדי לניתוח תפוקה גבוהה של פרוטוקולי אלקטרופורציה.
המחקר שלנו מתמקד בשימוש באלקטרופורציה, במיוחד פולסים דו-קוטביים של מיקרו-שנייה, על מנת לטפל בסרטן. כרגע אנו בוחנים אבלציה של רקמות רכות, אך אנו גם עוברים לטרנספקציה in vivo באמצעות פולסים אלה. הפרוטוקול שלנו למעשה מאפשר לך לראות בצורה יעילה יותר את ספי האלקטרופורציה הבלתי הפיכים וההפיכים.
זה גם יכול להיות קצת יותר טוב ממערכת מבוססת קוביות מכיוון שהיא מאפשרת לנו לראות בתלת מימד ולא בסביבה דו-ממדית. וסביבה תלת-ממדית תהיה הרבה יותר דומה למה שהיינו רואים ברקמות. בעתיד, ננסה לתרגם את מה שאנחנו רואים במודל הזה in vivo, ומה שהמודל הזה באמת עושה זה ליידע את בחירות הפרמטרים שאנחנו הולכים לעשות כשאנחנו מנסים לספק דברים כמו חיסוני DNA, כימותרפיה, כמו גם מערכות CRISPR-Cas9.
כדי להתחיל, הנח את תרחיף התאים ואת הריאגנטים הנדרשים בארון בטיחות ביולוגית. מערבבים היטב את תרחיף התאים המוכן עם תמיסת קולגן בקר מסוג 1 ביחס של 1:1. מניחים את התערובת על קרח או באמבט חרוזים קר כדי למנוע פילמור מוקדם.
לאחר מכן, פיפטה 500 מיקרוליטר מהתמיסה המשולבת לציפוי תחתית כל באר של צלחת בת 12 בארות. סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שהג'ל ייגע בקירות של כל באר. דגרו את הג'לים באינקובטור לח המוגדר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 6 שעות או עד שהג'לים הופכים ליציבים.
לאחר מכן, הטה את צלחת הבאר והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר מדיום תרבית לכל באר, ותן לה להחליק במורד דופן הצלחת. הסר את חיבור הפיתוי הפלסטי משתי מחטי מזרק קהות 1.64 מילימטר 304 נירוסטה. הניחו מחט אחת בצד כדי לשמש כאלקטרודת הסיכה.
עבור המחט השנייה, שטח את 5 המילימטרים האחרונים של קצה אחד. לאחר מכן, חותכים קטע של צינור נירוסטה 316 בקוטר 19 מילימטר ארוך מספיק כדי לשבת צמוד לתחתית צלחת באר כדי ליצור את אלקטרודת הטבעת. תכנן מחזיק אלקטרודה באמצעות תוכנת CAD שיתאים לרכיבי האלקטרודה.
הכנס את אלקטרודות הטבעת והסיכה למחזיק האלקטרודה כדי להרכיב את האלקטרודה ולחץ על התקן המחט עם הקצה השטוח לתוך המחזיק כדי לאבטח את אלקטרודת הטבעת. בארון בטיחות ביולוגית, הטה את הצלחת המוכנה ושאב 400 מיקרוליטר מדיום תרבית מכל באר. הוסף 20 מיקרוליטר של 5 מיקרוגרם למיקרוליטר תמיסת פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק לבארות השאיפה.
סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שהתמיסה מתפזרת באופן שווה על פני שטח הג'ל. דגרו את הג'לים באינקובטור לח המוגדר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכנס את בדיקת טמפרטורת הסיב האופטי לאלקטרודת הסיכה והתחל לרשום את הטמפרטורה.
חבר את הכבל החיובי של האלקטרופורטור לאלקטרודת הסיכה ואת המוליך השלילי למחט, ואבטח את אלקטרודת הטבעת. כעת הפעל את הפלטה החמה וחמם את הג'לים כדי לשמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכנס את הטבעת המורכבת ואלקטרודת הסיכה עם בדיקת הטמפרטורה לבאר וודא שהג'ל הגיע לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הפעל את האלקטרופורטור כדי לספק את הטיפול. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל ג'ל שנראה יבש והמשיך לאלקטר כל ג'ל לא מטופל. לאחר סיום כל הטיפולים, דגרו את הג'לים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות.
לאחר הדגירה מוסיפים בעדינות 500 מיקרוליטר מדיום תרבות לכל באר לאורך דופן הצלחת. דגרו שוב את הג'לים בחממה הלחה למשך 24 שעות. הטה את הצלחת ושאף את מדיום התרבות מכל באר.
לאחר מכן, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר PBS לכל באר לאורך קירות הצלחת. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 5 דקות. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מכל באר.
הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר PBS לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת. סובב בעדינות את הצלחת, ואז הטה אותה ושאף את ה- PBS מכל באר. כעת, הוסף 100 מיקרוליטר PBS טרי לכל באר כדי לשמור על לחות הג'לים להדמיה.
לאחר מכן, דמיין את הצלחת באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות סטנדרטיות. לאחר ההדמיה מוסיפים 500 מיקרוליטר מדיום תרבית לכל באר בצלחת ודוגרים למשך 24 שעות. חזור על זרימת העבודה המלאה של ההדמיה והשחזור עבור כל נקודת זמן מוגדרת.
לאחר יצירת מודל חישובי, השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי למדוד את הקוטר של הקצוות החיצוניים והפנימיים של האזור בצורת טורוס לאורך הציר האנכי והאופקי. ממוצע את הקוטר החיצוני והפנימי בהתאמה וחלק ב-2 כדי לחשב את הרדיוסים המתאימים. לבסוף, באמצעות טבלת החיפוש שנוצרה קודם לכן, נגזר את עוצמת השדה החשמלי ברדיוסים הנמדדים.
הרדיוס החיצוני של האזור הטרנספטקט שימש לכימות האלקטרופורציה ההפיכה או סף ה-RE על ידי מתאם עם עוצמות השדה החשמלי ממודל חישובי. בעוד שהרדיוס הפנימי שימש לקביעת האלקטרופורציה הבלתי הפיכה או סף ה-IRE. כל שלושת פרוטוקולי הדופק הדו-קוטביים של מיקרו-שנייה הביאו לאזורי טרנספקציה בצורת טורוס עם גבולות RE ו-IRE הנראים בבירור.
מבין צורות הגל שנבדקו, צורת הגל המאוזנת של 2-1-1 יצרה את סף ה-IRE הגבוה ביותר, בעוד שצורת הגל הלא מאוזנת 2-1-1 הראתה את הנמוכה ביותר. פרוטוקול אלקטרופורציה חד-קוטבי סטנדרטי המשתמש ב-420 וולט הביא לאזור טרנספקציה מעגלי עם סף RE של 642 וולט לסנטימטר, אך לא הצליח לייצר מוות תאי, ומנע קביעת סף IRE. עיוות רקמות לאורך זמן עקב פירוק ג'ל גרם לאזורים שעברו טרנספטציה לאבד את צורתם המעגלית, מה שהקשה על כימות מדויק של RE ו-IRE.
חוסר יישור של אלקטרודות הטבעת והסיכה עם קרקעית הבאר יצר גם דפוסי טרנספקציה לא מעגליים אסימטריים, מה שסיבך את מדידת הסף.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה משתמש במידול חישובי כדי לכמת ספי thresholds של אלקטרופורציה הפיכה ובלתי הפיכה, באמצעות ההתפלגות המרחבית של תאים שעברו טרנספקציה בתוך דמוי רקמה תלת-ממדי, לצורך ניתוח של פרוטוקולי אלקטרופורציה בתפוקה גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופורציה
- מידול מחשוב
- הנדסת רקמות
רקע
- אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת להגברת חדירותן של קרומי תאים.
- הבנת ספי השכיבה של אלקטרופורציה היא חיונית לאופטימיזציה של יעילות הטרנספקציה.
- דמויי רקמה תלת-ממדיים יכולים לספק ייצוג מדויק יותר של מערכות ביולוגיות.
- ניתוח בסביבה בעלת תפוקה גבוהה (High-throughput analysis) מאפשר הערכה מהירה של פרוטוקולי אלקטרופורציה שונים.
מטרת המחקר
- לכימות ספי electroporation בסביבה מבוקרת.
- לשיפור ההבנה של דינמיקת transfection של תאים.
- להקל על פיתוח פרוטוקולי electroporation יעילים יותר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות מידול חישובי לסימולציה של אלקטרופורציה.
- ניתוח של ההתפלגות המרחבית של תאים שעברו טרנספקציה.
- שימוש בחיקויי רקמה תלת-ממדיים לצורך תיקוף ניסיוני.
- סריקה בתושבה גבוהה (High-throughput) של תנאי אלקטרופורציה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי ספים ספציפיים עבור אלקטרופורציה הפיכה ובלתי הפיכה.
- הדגמה של יעילות המודל החישובי.
- תובנות לגבי ההפצה המרחבית של תאים שעברו טרנספקציה.
- המלצות לאופטימיזציה של פרוטוקולי אלקטרופורציה בהתבסס על הממצאים.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת להבנת ספי electroporation.
- מידול חישובי יכול לשפר באופן משמעותי את תכנון הניסויים.
- עבודות עתידיות יכולות להתבסס על ממצאים אלו כדי לשפר שיטות טרנספקציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות ספי השראת אלקטרופורציה במודל רקמה תלת-ממדי בעוצמה גבוהה (high-throughput) נותן מענה לבקבוץ קריטי באופטימיזציה של הובלת מקרו-מולקולות לפיתוח טיפולי. גישה זו מגבירה את הביטחון בניבוי עבור תרגום למצב in vivo ומאיצה את שכלול הפרוטוקולים עבור אסטרטגיות של העברת גנים ואבלציה של רקמות. היעילות והרלוונטיות הפיזיולוגית של המודל תומכות בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון לאורך שלבי הגילוי והפיתוח הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה שיטתית של פרמטרי אלקטרופורציה לצורך הפחתת סיכונים ביולוגיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מנגנוני הובלה במערכות תלת-ממדיות (3D) רלוונטיות פיזיולוגית.
- מסייע בהערכה חזוית של יעילות הפרוטוקול להשגת מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה עם תפוקה גבוהה להערכה מהירה של תנאי אלקטרופורציה.
- מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של יעילות הטרנספקציה וחיוניות התאים.
- מסטנדרטת את תנאי הבדיקה עבור סריקות המשך ואופטימיזציה של הפרוטוקול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים in vitro לרלוונטיות in vivo באמצעות חיקוי רקמות בתלת-ממד.
- מאפשר בחירה של פרוטוקולי אלקטרופורציה המותאמים לסיכון לצורך תיקוף פרה-קליני.
- תומך ברצף תרגומי על ידי מידול תגובות ברמת הרקמה לשדות חשמליים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
מודל רקמה תלת-ממדי זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני בכך שהוא מאפשר בדיקה חסונה של היפותזות ואופטימיזציה של פרוטוקולים עבור מערכות הובלה מבוססות אלקטרופורציה.
- ביולוגיה של תגליות: מכמת את ספי electroporation ההפיכות והבלתי הפיכות כדי להבהיר את מנגנוני ההחדרה.
- סריקה: מציע הערכה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של פרמטרים ותוצאות הפרוטוקול.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות עם רזולוציה מרחבית של אוכלוסיות תאים שעברו טרנספקציה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ביצועי הפרוטוקול in vitro ל-in vivo באמצעות מידול רלוונטי פיזיולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להרחבה לפיתוח שוטף של פרוטוקולים וסטנדרטיזציה בין תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית באופטימיזציה של מערכות הובלה.
- ערך תפעולי: משפר את התפוקה, את השחזוריות ואת הסטנדרטיזציה של הערכת פרוטוקול האלקטרופורציה.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות יעילה של go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של אסטרטגיות הובלה מותאם סיכון לאורך תוכניות טיפוליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות רקמה תלת-ממדיות ובמכשור אלקטרופורציה.
- דורש גישה לתשתיות דימוי כמותי ואנליזה לביצוע ניתוח מרחבי.
- מפיק תועלת מפרוטוקולים סטנדרטיים להבטחת הדירות בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים ולדמי רקמה באמצעות התאמות ספציפיות לפרוטוקול.
- מגבלות עשויות לכלול הגבלות ספציפיות למודל בנוגע למורכבות הרקמה וליכולת ההרחבה (scalability).
