מודל רקמות תלת מימדי בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות ספי אלקטרופורציה

המחקר שלנו מתמקד בשימוש באלקטרופורציה, במיוחד פולסים דו-קוטביים של מיקרו-שנייה, על מנת לטפל בסרטן. כרגע אנו בוחנים אבלציה של רקמות רכות, אך אנו גם עוברים לטרנספקציה in vivo באמצעות פולסים אלה. הפרוטוקול שלנו למעשה מאפשר לך לראות בצורה יעילה יותר את ספי האלקטרופורציה הבלתי הפיכים וההפיכים.

זה גם יכול להיות קצת יותר טוב ממערכת מבוססת קוביות מכיוון שהיא מאפשרת לנו לראות בתלת מימד ולא בסביבה דו-ממדית. וסביבה תלת-ממדית תהיה הרבה יותר דומה למה שהיינו רואים ברקמות. בעתיד, ננסה לתרגם את מה שאנחנו רואים במודל הזה in vivo, ומה שהמודל הזה באמת עושה זה ליידע את בחירות הפרמטרים שאנחנו הולכים לעשות כשאנחנו מנסים לספק דברים כמו חיסוני DNA, כימותרפיה, כמו גם מערכות CRISPR-Cas9.

כדי להתחיל, הנח את תרחיף התאים ואת הריאגנטים הנדרשים בארון בטיחות ביולוגית. מערבבים היטב את תרחיף התאים המוכן עם תמיסת קולגן בקר מסוג 1 ביחס של 1:1. מניחים את התערובת על קרח או באמבט חרוזים קר כדי למנוע פילמור מוקדם.

לאחר מכן, פיפטה 500 מיקרוליטר מהתמיסה המשולבת לציפוי תחתית כל באר של צלחת בת 12 בארות. סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שהג'ל ייגע בקירות של כל באר. דגרו את הג'לים באינקובטור לח המוגדר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 6 שעות או עד שהג'לים הופכים ליציבים.

לאחר מכן, הטה את צלחת הבאר והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר מדיום תרבית לכל באר, ותן לה להחליק במורד דופן הצלחת. הסר את חיבור הפיתוי הפלסטי משתי מחטי מזרק קהות 1.64 מילימטר 304 נירוסטה. הניחו מחט אחת בצד כדי לשמש כאלקטרודת הסיכה.

עבור המחט השנייה, שטח את 5 המילימטרים האחרונים של קצה אחד. לאחר מכן, חותכים קטע של צינור נירוסטה 316 בקוטר 19 מילימטר ארוך מספיק כדי לשבת צמוד לתחתית צלחת באר כדי ליצור את אלקטרודת הטבעת. תכנן מחזיק אלקטרודה באמצעות תוכנת CAD שיתאים לרכיבי האלקטרודה.

הכנס את אלקטרודות הטבעת והסיכה למחזיק האלקטרודה כדי להרכיב את האלקטרודה ולחץ על התקן המחט עם הקצה השטוח לתוך המחזיק כדי לאבטח את אלקטרודת הטבעת. בארון בטיחות ביולוגית, הטה את הצלחת המוכנה ושאב 400 מיקרוליטר מדיום תרבית מכל באר. הוסף 20 מיקרוליטר של 5 מיקרוגרם למיקרוליטר תמיסת פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק לבארות השאיפה.

סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שהתמיסה מתפזרת באופן שווה על פני שטח הג'ל. דגרו את הג'לים באינקובטור לח המוגדר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכנס את בדיקת טמפרטורת הסיב האופטי לאלקטרודת הסיכה והתחל לרשום את הטמפרטורה.

חבר את הכבל החיובי של האלקטרופורטור לאלקטרודת הסיכה ואת המוליך השלילי למחט, ואבטח את אלקטרודת הטבעת. כעת הפעל את הפלטה החמה וחמם את הג'לים כדי לשמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכנס את הטבעת המורכבת ואלקטרודת הסיכה עם בדיקת הטמפרטורה לבאר וודא שהג'ל הגיע לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הפעל את האלקטרופורטור כדי לספק את הטיפול. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל ג'ל שנראה יבש והמשיך לאלקטר כל ג'ל לא מטופל. לאחר סיום כל הטיפולים, דגרו את הג'לים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה מוסיפים בעדינות 500 מיקרוליטר מדיום תרבות לכל באר לאורך דופן הצלחת. דגרו שוב את הג'לים בחממה הלחה למשך 24 שעות. הטה את הצלחת ושאף את מדיום התרבות מכל באר.

לאחר מכן, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר PBS לכל באר לאורך קירות הצלחת. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 5 דקות. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מכל באר.

הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר PBS לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת. סובב בעדינות את הצלחת, ואז הטה אותה ושאף את ה- PBS מכל באר. כעת, הוסף 100 מיקרוליטר PBS טרי לכל באר כדי לשמור על לחות הג'לים להדמיה.

לאחר מכן, דמיין את הצלחת באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות סטנדרטיות. לאחר ההדמיה מוסיפים 500 מיקרוליטר מדיום תרבית לכל באר בצלחת ודוגרים למשך 24 שעות. חזור על זרימת העבודה המלאה של ההדמיה והשחזור עבור כל נקודת זמן מוגדרת.

לאחר יצירת מודל חישובי, השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי למדוד את הקוטר של הקצוות החיצוניים והפנימיים של האזור בצורת טורוס לאורך הציר האנכי והאופקי. ממוצע את הקוטר החיצוני והפנימי בהתאמה וחלק ב-2 כדי לחשב את הרדיוסים המתאימים. לבסוף, באמצעות טבלת החיפוש שנוצרה קודם לכן, נגזר את עוצמת השדה החשמלי ברדיוסים הנמדדים.

הרדיוס החיצוני של האזור הטרנספטקט שימש לכימות האלקטרופורציה ההפיכה או סף ה-RE על ידי מתאם עם עוצמות השדה החשמלי ממודל חישובי. בעוד שהרדיוס הפנימי שימש לקביעת האלקטרופורציה הבלתי הפיכה או סף ה-IRE. כל שלושת פרוטוקולי הדופק הדו-קוטביים של מיקרו-שנייה הביאו לאזורי טרנספקציה בצורת טורוס עם גבולות RE ו-IRE הנראים בבירור.

מבין צורות הגל שנבדקו, צורת הגל המאוזנת של 2-1-1 יצרה את סף ה-IRE הגבוה ביותר, בעוד שצורת הגל הלא מאוזנת 2-1-1 הראתה את הנמוכה ביותר. פרוטוקול אלקטרופורציה חד-קוטבי סטנדרטי המשתמש ב-420 וולט הביא לאזור טרנספקציה מעגלי עם סף RE של 642 וולט לסנטימטר, אך לא הצליח לייצר מוות תאי, ומנע קביעת סף IRE. עיוות רקמות לאורך זמן עקב פירוק ג'ל גרם לאזורים שעברו טרנספטציה לאבד את צורתם המעגלית, מה שהקשה על כימות מדויק של RE ו-IRE.

חוסר יישור של אלקטרודות הטבעת והסיכה עם קרקעית הבאר יצר גם דפוסי טרנספקציה לא מעגליים אסימטריים, מה שסיבך את מדידת הסף.