All'inizio del XX secolo, un batteriologo britannico di nome Frederick Griffith stava lavorando con il batterio che causa la polmonite Streptococcus pneumoniae. Ha eseguito un semplice esperimento utilizzando due ceppi diversi. Un ceppo è noto come ceppo S a causa di una capsula protettiva che fa apparire lisce le colonie o i grumi che forma e lo rende anche virulento o dannoso. Il secondo era il ceppo R, una versione dei batteri priva della capsula protettiva, che dava alle colonie un aspetto ruvido e le rendeva non virulente.
In primo luogo, Griffith ha preso alcuni dei batteri del ceppo S e li ha riscaldati, producendo una versione uccisa dal calore del ceppo S. Poi, ha raccolto alcuni topi e li ha divisi in quattro gruppi. Iniettò nel primo gruppo il ceppo S virulento e nel secondo il ceppo R non virulento. Ha dosato il terzo gruppo con il ceppo S ucciso a caldo e, infine, ha combinato insieme il ceppo S ucciso a caldo e il ceppo R, e ha iniettato questa miscela nel quarto gruppo. Come previsto, i topi del primo gruppo sono morti e quelli del secondo e del terzo gruppo sono sopravvissuti. Ma con sorpresa di Griffith, anche i topi dell'ultimo gruppo sono morti.
Quando pubblicò il suo studio nel 1928, chiamò questo misterioso processo di trasformazione, poiché ipotizzò la presenza di un principio trasformante sottostante, che permise al ceppo precedentemente non virulento di diventare mortale. Più tardi, nel 1943, Avert, MacLeod e McCarty riferirono che questo principio trasformante era probabilmente l'acido desossiribonucleico, o DNA, che ora sappiamo essere il materiale ereditario. Essenzialmente ciò che è accaduto nell'esperimento di Griffith è stato che quando i batteri sono stati combinati, un po' di DNA è fuoriuscito dal ceppo S ucciso dal calore e nelle cellule del ceppo R, trasformando questi batteri non virulenti e passando le informazioni per creare la capsula protettiva, trasformando il ceppo R in uno virulento, ora in grado di uccidere gli animali del quarto gruppo.
Gli scienziati hanno sviluppato un modo molto più semplice per studiare la trasformazione batterica, utilizzando i batteri E. coli e piccoli anelli circolari di DNA chiamati plasmidi. Di solito, il plasmide utilizzato negli esperimenti di trasformazione include un gene per una funzione speciale, come la resistenza agli antibiotici. Gli E. coli sono un ottimo soggetto per la trasformazione perché possono mostrare una proprietà chiamata competenza, la capacità di assorbire il DNA dall'ambiente. In sostanza, ciò significa che in determinate condizioni ambientali, come una sostanza chimica o uno shock elettrico o termico, la parete cellulare dell'E. coli può diventare temporaneamente permeabile e consentire l'assorbimento del DNA dall'ambiente. Una volta che il plasmide si trova all'interno dell'E. coli, può rimanere nel citoplasma della sua nuova cellula ospite ed essere replicato ed espresso nel corso delle generazioni insieme al genoma, oppure può incorporarsi completamente nel genoma dell'ospite. Se i batteri perdono il plasmide in qualsiasi momento, anche la cellula perderà la sua resistenza agli antibiotici, e quindi gli scienziati coltivano i batteri in un terreno contenente l'antibiotico per garantire che gli unici sopravvissuti siano quelli che contengono il plasmide di interesse.
In questo laboratorio imparerai come trasformare le cellule di E. coli con un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici, mentre pratichi tecniche microbiologiche sterili.
Sfondo
All'inizio del XX secolo, la polmonite era responsabile di gran parte dei decessi per malattie infettive1. Al fine di sviluppare un vaccino efficace contro la polmonite, Frederick Griffith si mise a studiare due diversi ceppi di Streptococcus pneumoniae: un ceppo non virulento con un aspetto ruvido (ceppo R) e un ceppo virulento con un aspetto liscio (ceppo S) a causa di una capsula polisaccaridica esterna2. Questo strato esterno dei batteri del ceppo S ha permesso loro di resistere al sistema immunitario dell'ospite, portando infine a una malattia pericolosa per la vita. Quando Griffith iniettò separatamente nei topi batteri uccisi dal calore di entrambi i ceppi, i topi sopravvissero. Tuttavia, quando ha iniettato nei topi una combinazione del ceppo S ucciso dal calore con il ceppo R vivo, i topi sono morti2. Quando ha analizzato i campioni ottenuti da topi morti iniettati con la combinazione, ha osservato la presenza di batteri vivi del ceppo S. Nel 1928, Griffith notò che doveva essersi verificato un processo di "trasformazione" per cambiare i batteri non virulenti nel ceppo virulento. Come prima scoperta nota della trasformazione batterica, la sua scoperta ha aperto la strada allo sviluppo di uno strumento essenziale nell'ingegneria genetica: la trasformazione3.
La trasformazione è il cambiamento genetico in una cellula dovuto all'assunzione di DNA dall'ambiente. Nell'esperimento di Griffith, il DNA che codifica il rivestimento protettivo in polisaccaridi dei batteri del ceppo S non si è scomposto a causa dello shock termico ed è stato introdotto nel ceppo R, consentendo a quest'ultimo di bypassare il sistema immunitario del topo. Mentre questo processo avviene costantemente in natura tra organismi e persino specie diverse, gli scienziati trasformano i batteri in ambienti di laboratorio per scopi di ricerca4.
Trasformazione batterica con plasmidi
I batteri sono gli organismi ideali per la trasformazione in quanto possono facilmente assorbire materiale genetico esogeno nel loro genoma e amplificarlo rapidamente3,5. Hanno un cromosoma circolare e più piccoli pezzi circolari di DNA a doppio filamento chiamati plasmidi all'interno del citoplasma. Questi plasmidi possono replicarsi indipendentemente dal DNA cromosomico e generalmente forniscono alcuni benefici funzionali, come la resistenza agli antibiotici6,7. Nel loro ambiente naturale, i batteri subiscono una "trasformazione batterica" assorbendo plasmidi da altri batteri in un processo chiamato coniugazione8. Inoltre, quando si moltiplicano, ciascuno dei loro discendenti riceve una copia del nuovo plasmide.
I plasmidi utilizzati per scopi sperimentali sono chiamati vettori plasmidici. In un ambiente di laboratorio, gli scienziati possono creare artificialmente "plasmidi ricombinanti" lunghi circa 5.000-10.000 coppie di basi inserendo frammenti di DNA in un vettore plasmidico. Questi plasmidi ricombinanti di solito hanno alcuni componenti: un'origine di replicazione (ORI), un gene di resistenza agli antibiotici, un sito di clonazione multiplo, un promotore, un marcatore di selezione e il gene di interesse. L'origine della replica è il punto in cui inizia la replica. Il gene della resistenza agli antibiotici consente ai batteri che assorbono il plasmide di sopravvivere sulle piastre in presenza di un determinato farmaco antibiotico. Sebbene i plasmidi siano pezzi di DNA relativamente piccoli, gli scienziati devono trattare le cellule ospiti per consentire la penetrazione del plasmide attraverso la membrana cellulare. Quindi, l'efficienza della trasformazione è direttamente correlata alla porosità della membrana ospite. Un approccio comune consiste nello shock termico dei batteri che sono stati trattati con una soluzione di cloruro di calcio9. I batteri che non incorporano il plasmide non si trasformano e quindi non hanno resistenza per sopravvivere sulla piastra ed essere visibili. I siti di clonazione multipli aiutano l'inserimento del DNA contenendo siti per gli enzimi di restrizione per tagliare il plasmide dove il gene di interesse può essere inserito e legato. Il promotore guida la trascrizione del gene di interesse. È etichettato da un marcatore, di solito una proteina fluorescente come una proteina fluorescente verde (GFP), o può essere un gene aggiuntivo di resistenza agli antibiotici. Il gene della resistenza agli antibiotici e gli altri marcatori di selezione ci aiutano a determinare se i batteri raccolti contengono il plasmide di interesse.
Applicazioni
Metodi di trasformazione efficaci hanno permesso agli scienziati di isolare e profilare geni e prodotti genici e hanno portato a molti progressi nelle scienze della vita e nella medicina, come lo sviluppo di farmaci efficaci, la generazione di colture geneticamente modificate e strumenti diagnostici avanzati10. Inoltre, con i progressi tecnologici, sono emersi nuovi metodi di trasformazione. Ad esempio, il Gateway Cloning consente l'inserimento di più frammenti di DNA in diversi vettori e il trasferimento di sequenze di DNA tra plasmidi11. Inoltre, le ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)-Cas9 sono una tecnica di editing genetico che modifica direttamente i nucleotidi nel genoma e non richiede l'uso di plasmidi12. Dopo la trasformazione, i ricercatori spesso isolano e profilano il gene di interesse e i suoi prodotti. Successivamente, l'intero processo di clonazione genetica ha aperto un nuovo campo di manipolazione genetica. Grazie alla clonazione genetica, i ricercatori possono manipolare i batteri per produrre grandi quantità di proteine umane specifiche, come l'insulina, per il trattamento dei pazienti diabetici10. La clonazione ha anche svolto una grande importanza nell'agricoltura moderna. Gli organismi geneticamente modificati (OGM) sono il risultato diretto della clonazione genetica e della trasformazione batterica10. Ad esempio, gli scienziati stanno lavorando per generare colture geneticamente modificate con geni che fissano l'azoto incorporati nel loro genoma per aumentare la produzione alimentare e ridurre l'uso di fertilizzanti, diminuendo così l'impatto economico e ambientale dei fertilizzanti. In sintesi, la trasformazione batterica è il primo passo della biotecnologia moderna e il fondamento delle future scoperte della ricerca.
Referenze
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All'inizio del XX secolo, un batteriologo britannico di nome Frederick Griffith stava lavorando con il batterio che causa la polmonite Streptococcus pneumoniae. Ha eseguito un semplice esperimento utilizzando due ceppi diversi. Un ceppo è noto come ceppo S a causa di una capsula protettiva che fa apparire lisce le colonie o i grumi che forma e lo rende anche virulento o dannoso. Il secondo era il ceppo R, una versione dei batteri priva della capsula protettiva, che dava alle colonie un aspetto ruvido e le rendeva non virulente.
In primo luogo, Griffith ha preso alcuni dei batteri del ceppo S e li ha riscaldati, producendo una versione uccisa dal calore del ceppo S. Poi, ha raccolto alcuni topi e li ha divisi in quattro gruppi. Iniettò nel primo gruppo il ceppo S virulento e nel secondo il ceppo R non virulento. Ha dosato il terzo gruppo con il ceppo S ucciso a caldo e, infine, ha combinato insieme il ceppo S ucciso a caldo e il ceppo R, e ha iniettato questa miscela nel quarto gruppo. Come previsto, i topi del primo gruppo sono morti e quelli del secondo e del terzo gruppo sono sopravvissuti. Ma con sorpresa di Griffith, anche i topi dell'ultimo gruppo sono morti.
Quando pubblicò il suo studio nel 1928, chiamò questo misterioso processo di trasformazione, poiché ipotizzò la presenza di un principio trasformante sottostante, che permise al ceppo precedentemente non virulento di diventare mortale. Più tardi, nel 1943, Avert, MacLeod e McCarty riferirono che questo principio trasformante era probabilmente l'acido desossiribonucleico, o DNA, che ora sappiamo essere il materiale ereditario. Essenzialmente ciò che è accaduto nell'esperimento di Griffith è stato che quando i batteri sono stati combinati, un po' di DNA è fuoriuscito dal ceppo S ucciso dal calore e nelle cellule del ceppo R, trasformando questi batteri non virulenti e passando le informazioni per creare la capsula protettiva, trasformando il ceppo R in uno virulento, ora in grado di uccidere gli animali del quarto gruppo.
Gli scienziati hanno sviluppato un modo molto più semplice per studiare la trasformazione batterica, utilizzando i batteri E. coli e piccoli anelli circolari di DNA chiamati plasmidi. Di solito, il plasmide utilizzato negli esperimenti di trasformazione include un gene per una funzione speciale, come la resistenza agli antibiotici. Gli E. coli sono un ottimo soggetto per la trasformazione perché possono mostrare una proprietà chiamata competenza, la capacità di assorbire il DNA dall'ambiente. In sostanza, ciò significa che in determinate condizioni ambientali, come una sostanza chimica o uno shock elettrico o termico, la parete cellulare dell'E. coli può diventare temporaneamente permeabile e consentire l'assorbimento del DNA dall'ambiente. Una volta che il plasmide si trova all'interno dell'E. coli, può rimanere nel citoplasma della sua nuova cellula ospite ed essere replicato ed espresso nel corso delle generazioni insieme al genoma, oppure può incorporarsi completamente nel genoma dell'ospite. Se i batteri perdono il plasmide in qualsiasi momento, anche la cellula perderà la sua resistenza agli antibiotici, e quindi gli scienziati coltivano i batteri in un terreno contenente l'antibiotico per garantire che gli unici sopravvissuti siano quelli che contengono il plasmide di interesse.
In questo laboratorio imparerai come trasformare le cellule di E. coli con un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici, mentre pratichi tecniche microbiologiche sterili.
All'inizio del XX secolo, un batteriologo britannico di nome Frederick Griffith stava lavorando con il batterio che causa la polmonite Streptococcus pneumoniae. Ha eseguito un semplice esperimento utilizzando due ceppi diversi. Un ceppo è noto come ceppo S a causa di una capsula protettiva che fa apparire lisce le colonie o i grumi che forma e lo rende anche virulento o dannoso. Il secondo era il ceppo R, una versione dei batteri priva della capsula protettiva, che dava alle colonie un aspetto ruvido e le rendeva non virulente.
In primo luogo, Griffith ha preso alcuni dei batteri del ceppo S e li ha riscaldati, producendo una versione uccisa dal calore del ceppo S. Poi, ha raccolto alcuni topi e li ha divisi in quattro gruppi. Iniettò nel primo gruppo il ceppo S virulento e nel secondo il ceppo R non virulento. Ha dosato il terzo gruppo con il ceppo S ucciso a caldo e, infine, ha combinato insieme il ceppo S ucciso a caldo e il ceppo R, e ha iniettato questa miscela nel quarto gruppo. Come previsto, i topi del primo gruppo sono morti e quelli del secondo e del terzo gruppo sono sopravvissuti. Ma con sorpresa di Griffith, anche i topi dell'ultimo gruppo sono morti.
Quando pubblicò il suo studio nel 1928, chiamò questo misterioso processo di trasformazione, poiché ipotizzò la presenza di un principio trasformante sottostante, che permise al ceppo precedentemente non virulento di diventare mortale. Più tardi, nel 1943, Avert, MacLeod e McCarty riferirono che questo principio trasformante era probabilmente l'acido desossiribonucleico, o DNA, che ora sappiamo essere il materiale ereditario. Essenzialmente ciò che è accaduto nell'esperimento di Griffith è stato che quando i batteri sono stati combinati, un po' di DNA è fuoriuscito dal ceppo S ucciso dal calore e nelle cellule del ceppo R, trasformando questi batteri non virulenti e passando le informazioni per creare la capsula protettiva, trasformando il ceppo R in uno virulento, ora in grado di uccidere gli animali del quarto gruppo.
Gli scienziati hanno sviluppato un modo molto più semplice per studiare la trasformazione batterica, utilizzando i batteri E. coli e piccoli anelli circolari di DNA chiamati plasmidi. Di solito, il plasmide utilizzato negli esperimenti di trasformazione include un gene per una funzione speciale, come la resistenza agli antibiotici. Gli E. coli sono un ottimo soggetto per la trasformazione perché possono mostrare una proprietà chiamata competenza, la capacità di assorbire il DNA dall'ambiente. In sostanza, ciò significa che in determinate condizioni ambientali, come una sostanza chimica o uno shock elettrico o termico, la parete cellulare dell'E. coli può diventare temporaneamente permeabile e consentire l'assorbimento del DNA dall'ambiente. Una volta che il plasmide si trova all'interno dell'E. coli, può rimanere nel citoplasma della sua nuova cellula ospite ed essere replicato ed espresso nel corso delle generazioni insieme al genoma, oppure può incorporarsi completamente nel genoma dell'ospite. Se i batteri perdono il plasmide in qualsiasi momento, anche la cellula perderà la sua resistenza agli antibiotici, e quindi gli scienziati coltivano i batteri in un terreno contenente l'antibiotico per garantire che gli unici sopravvissuti siano quelli che contengono il plasmide di interesse.
In questo laboratorio imparerai come trasformare le cellule di E. coli con un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici, mentre pratichi tecniche microbiologiche sterili.
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