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1. Preparazione del campione
- Preparazione del mix di agarosio
- 15 minuti prima di preparare la miscela di agarosio, sciogliere 1 ml di aliquota di agarosio all'1% a basso punto di fusione (disciolto in terreno E3) in un blocco riscaldante impostato a 70 °C. Una volta che l'agarosio è completamente fuso, trasferire 600 μl in una provetta fresca da 1,5 ml, aggiungere 250 μl di terreno E3, 50 μl di MS-222 allo 0,4% e 25 μl di soluzione madre di perle vortexed.
nota: Questo fa 925 μl di miscela, mentre ulteriori 75 μl vengono calcolati per il liquido aggiunto successivamente insieme agli embrioni.
- Conservare la provetta in un secondo blocco riscaldante a 38-40 °C o assicurarsi che l'agarosio sia molto vicino al suo punto di gelificazione prima di inserire gli embrioni campione.
- Montaggio degli embrioni
- Prendere cinque capillari di vetro di 20 μl di volume (con un segno nero, diametro interno di ~1 mm) e inserire gli stantuffi della punta in teflon corrispondenti. Spingere lo stantuffo attraverso il capillare in modo che la punta in teflon si trovi nella parte inferiore del capillare.
- Trasferire cinque embrioni (un numero che può essere montato contemporaneamente) con una pipetta di vetro o di plastica nella provetta di miscela di agarosio caldo vortex a 37 °C.
nota: Cerca di portare con te un volume minimo di liquido insieme agli embrioni.
- Inserire il capillare nella miscela e aspirare un embrione all'interno tirando verso l'alto lo stantuffo. Assicurarsi che la testa dell'embrione entri nel capillare prima della coda. Evitare la formazione di bolle d'aria tra lo stantuffo e il campione. Dovrebbero esserci ±2 cm di agarosio sopra l'embrione e ±1 cm sotto di esso. Ripetere l'operazione per gli embrioni rimanenti.
- Attendere che l'agarosio si solidifichi completamente, cosa che avviene in pochi minuti, quindi conservare i campioni in terreno E3, incollandoli alla parete di un becher con plastilina o nastro adesivo. L'apertura inferiore del capillare deve essere sospesa libera nella soluzione consentendo lo scambio di gas con il campione.
NOTA: Un protocollo simile alle sezioni 1.1 e 1.2 può essere trovato anche sulla pagina wiki di OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.
2. Posizionamento del campione
- Assemblaggio del supporto del campione
- Inserire 2 manicotti di plastica della misura corretta (neri) l'uno contro l'altro nello stelo del portacampioni. I loro lati a fessura devono essere rivolti verso l'esterno. Fissare il clamp vite senza stringere ruotandolo di 2-3 giri. Inserire il capillare attraverso la vite di bloccaggio e spingerlo attraverso il supporto fino a quando la banda di colore nero diventa visibile sull'altro lato. Evitare di toccare lo stantuffo.
- Serrare la vite di fissaggio. Spingere fuori dal capillare l'eccesso di 1 cm di agarosio sotto l'embrione e tagliarlo. Inserire lo stelo nel disco portacampioni.
- Verificare nel software che il tavolino del microscopio sia in posizione di carico. Utilizzare le guide per far scorrere l'intero supporto con il campione verticalmente verso il basso nel microscopio. Ruotarlo in modo che il disco del supporto magnetico si blocchi in posizione.