Işık Tabakası MikroskopiSi Numune Hazırlama: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Montajı

Overview

Bu makalede, ışık tabakası floresan mikroskopisi için örnek hazırlık açıklanmaktadır. Ayrıca, canlı embriyoların fizyolojik koşullara yakın koşullarda uzun süreli filmlerinin kaydedilmesini sağlayan uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem göstermektedir.

Protocol

1. Numune Hazırlama

1. Agarose Karışımını Hazırlama
   1. Agarose karışımını yapmadan 15 dakika önce, % 1 düşük erime noktası agarose (E3 ortamında çözünmüş) bir 1 ml aliquot'unu 70 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda eritin. Agarose tamamen eridikten sonra, 600 μl'yi taze 1,5 ml'lik bir tüpe aktarın, 250 μl E3 ortamı, 50 μl% 0,4 MS-222 ve 25 μl girdaplı boncuk stok çözeltisi ekleyin.
      NOT: Bu, karışımın 925 μl'si olurken, daha sonra embriyolarla birlikte eklenen sıvı için ek 75 μl hesaplanır.
   2. Tüpü 38-40 ° C'de ikinci bir ısıtma bloğunda tutun veya içine örnek embriyolar koymadan önce agarose'un jelleşme noktasına çok yakın olduğundan emin olun.
2. Embriyoların Montajı
   1. 20 μl hacimde beş cam kılcal damar alın (siyah işaretli, ~1 mm iç çaplı) ve eşleşen Teflon uç pistonlarını içine yerleştirin. Pistonu kılcal damardan geçirin, böylece Teflon ucu kılcal damarın dibindedir.
   2. Beş embriyoyu (aynı anda monte edilebilen bir sayı) bir cam veya plastik pipetle girdaplı 37 °C sıcak agarose karışımının tüpüne aktarın.
      NOT: Embriyolarla birlikte minimum miktarda sıvı taşımaya çalışın.
   3. Kılcal damarı karışıma yerleştirin ve pistonu yukarı çekerek bir embriyoyu içine emin. Embriyonun başının kuyruk öncesi kılcal damara girdiğinden emin olun. Piston ve numune arasında hava kabarcıklarından kaçının. Embriyonun üzerinde ±2 cm ve altında ±1 cm agarose olmalıdır. Kalan embriyolar için tekrarlayın.
   4. Agarose tamamen katılanınceye kadar bekleyin, bu birkaç dakika içinde gerçekleşir ve daha sonra örnekleri plastik veya bantlı bir kabın duvarına yapıştırarak E3 ortamında saklayın. Kılcal damarın alt açıklığı, numuneye gaz değişimine izin vermek için çözeltide serbest bırakılmalıdır.
      NOT: 1.1 ve 1.2 bölümlerine benzer bir protokol http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation OpenSPIM wiki sayfasında da bulunabilir.

2. Örnek Konumlandırma

1. Numune Tutucu Montajı
   1. Numune tutucu gövdesine birbirine doğru boyutta (siyah) 2 plastik kovan yerleştirin. Yarık tarafları dışa doğru yüzleşmek zorunda. Kelepçe vidasını 2-3 tur çevirerek gevşek bir şekilde takın. Kılcal damarı kelepçe vidasının içinden geçirin ve siyah renk bandı diğer tarafta görünene kadar tutucudan geçirin. Pistona dokunmaktan kaçının.
   2. Kelepçe vidasını sıkın. Embriyonun altındaki fazla 1 cm'lik agaroseyu kılcal damardan dışarı itin ve kesin. Gövdeyi numune tutucu diskine yerleştirin.
   3. Yazılımda mikroskop aşamasının yük konumunda olduğunu onaylayın. Numune dikey olarak mikroskopa doğru süzülmek için kılavuz rayları kullanın. Manyetik tutucu diskin konuma kilitlenmesi için çevirin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/ MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillarie	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor