Overview
Denne artikkelen beskriver prøvepreparering for lysark fluorescensmikroskopi. Det demonstrerer også en metode for å montere levende sebrafiskembryoer for langsiktig avbildning, noe som gjør det mulig å registrere lange tidsforløpfilmer av levende embryoer i nesten fysiologiske forhold.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Klargjøre Agarose Mix
- 15 min før du lager agaroseblandingen, smelter en 1 ml aliquot på 1% lavt smeltepunkt agarose (oppløst i E3 medium) i en varmeblokk satt til 70 °C. Når agarose er helt smeltet, overfør 600 μl til et friskt 1,5 ml rør, tilsett 250 μl E3 medium, 50 μl 0,4% MS-222 og 25 μl vortexed perle lagerløsning.
MERK: Dette gjør 925 μl av blandingen, mens ytterligere 75 μl beregnes for væsken som tilsetts senere sammen med embryoene. - Oppbevar røret i en annen varmeblokk ved 38-40 °C, eller sørg for at agarose er svært nær gelepunktet før du legger prøveembryoer i den.
- 15 min før du lager agaroseblandingen, smelter en 1 ml aliquot på 1% lavt smeltepunkt agarose (oppløst i E3 medium) i en varmeblokk satt til 70 °C. Når agarose er helt smeltet, overfør 600 μl til et friskt 1,5 ml rør, tilsett 250 μl E3 medium, 50 μl 0,4% MS-222 og 25 μl vortexed perle lagerløsning.
- Montering av embryoer
- Ta fem glasskapillærer på 20 μl volum (med et svart merke, ~ 1 mm indre diameter) og sett de matchende Teflon-spissstemplerne inn i dem. Skyv stempelet gjennom kapillæren slik at Teflon-spissen er på bunnen av kapillæren.
- Overfør fem embryoer (et tall som kan monteres samtidig) med en glass- eller plastpipette inn i røret med virvelert 37 °C varm agaroseblanding.
MERK: Prøv å bære over et minimumsvolum av væske sammen med embryoene. - Sett kapillæren inn i blandingen og suge ett embryo inni ved å trekke stempelet opp. Pass på at embryohodet kommer inn i kapillæren før halen. Unngå luftbobler mellom stempelet og prøven. Det skal være ±2 cm agarose over embryoet og ±1 cm under det. Gjenta for de resterende embryoene.
- Vent til agarose størkner helt, noe som skjer i løpet av få minutter og lagre deretter prøvene i E3-medium, ved å stikke dem til veggen av et beger med plasticine eller tape. Den nederste åpningen av kapillæren skal henge fritt i løsningen som tillater gassutveksling til prøven.
MERK:En lignende protokoll som avsnittene 1.1 og 1.2 finnes også på OpenSPIM wiki-siden http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.
2. Prøveposisjonering
- Montering av prøveholder
- Sett 2 plasthylser av riktig størrelse (svart) mot hverandre i prøveholderstammen. Deres spaltede sider må vende utover. Fest klemskruen løst ved å dreie den 2-3 omg. Sett kapillæren gjennom klemskruen og skyv den gjennom holderen til det svarte fargebåndet blir synlig på den andre siden. Unngå å berøre stempelet.
- Trekk til klemskruen. Skyv overflødig 1 cm agarose under embryoet ut av kapillæren og kutt den. Sett stammen inn i prøveholderplaten.
- Bekreft i programvaren at mikroskopstadiet er i lasteposisjon. Bruk styreskinner til å gli hele holderen med prøven vertikalt nedover i mikroskopet. Vri den slik at den magnetiske holderskiven låses på plass.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/ MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| 20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillarie | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
