Preparação da amostra de microscopia da folha de luz: montagem de embriões de zebrafish vivos para imagens de longo prazo

Overview

Este artigo descreve a preparação da amostra para microscopia de fluorescência de folha de luz. Também demonstra um método para montar embriões de zebrafish vivos para imagens de longo prazo, o que permite a gravação de filmes de longo tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas.

Protocol

1. Preparação da amostra

1. Preparando o Mix Agarose
   1. 15 min antes de fazer a mistura de agarose, derreta uma alíquota de 1 ml de 1% de ponto de fusão baixo (dissolvida em média E3) em um bloco de aquecimento definido para 70 °C. Uma vez que a agarose esteja completamente derretida, transfira 600 μl em um tubo fresco de 1,5 ml, adicione 250 μl de média E3, 50 μl de 0,4% MS-222 e 25 μl de solução de estoque de contas vórtices.
      NOTA: Isso faz com que 925 μl da mistura, enquanto 75 μl adicionais são calculados para o líquido adicionado mais tarde junto com os embriões.
   2. Mantenha o tubo em um segundo bloco de aquecimento a 38-40 °C ou certifique-se de que a agarose está muito perto de seu ponto de gelagem antes de colocar embriões amostrais nele.
2. Montando os Embriões
   1. Pegue cinco capilares de vidro de 20 μl de volume (com uma marca preta, ~1 mm de diâmetro interno) e insira os dembos de ponta teflon correspondentes neles. Empurre o êmbolo através do capilar para que a ponta Teflon esteja na parte inferior do capilar.
   2. Transfira cinco embriões (um número que pode ser montado de uma só vez) com uma pipeta de vidro ou plástico para o tubo de vórtice 37 °C de mistura de agarose quente.
      NOTA: Tente carregar um volume mínimo de líquido junto com os embriões.
   3. Insira o capilar na mistura e chupe um embrião dentro puxando o êmbolo para cima. Certifique-se de que a cabeça do embrião entre no capilar antes da cauda. Evite bolhas de ar entre o êmbolo e a amostra. Deve haver ±2 cm de agarose acima do embrião e ±1 cm abaixo dele. Repita para os demais embriões.
   4. Aguarde até que a agarose se solidifique completamente, o que acontece em poucos minutos e, em seguida, armazene as amostras em meio E3, colocando-as na parede de um béquer com plasticine ou fita. A abertura inferior do capilar deve ser pendurada livremente na solução permitindo a troca de gás para a amostra.
      NOTA: Um protocolo semelhante às seções 1.1 e 1.2 também pode ser encontrado na página wiki do OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Posicionamento amostral

1. Montagem do titular da amostra
   1. Insira 2 mangas plásticas do tamanho certo (preto) umas contra as outras na haste do suporte da amostra. Seus lados cortados têm que enfrentar para fora. Coloque o parafuso do grampo solto girando-o 2-3 balas. Insira o capilar através do parafuso do grampo e empurre-o através do suporte até que a faixa de cor preta se torne visível do outro lado. Evite tocar no êmbolo.
   2. Aperte o parafuso do grampo. Empurre o excesso de 1 cm de agarose abaixo do embrião para fora do capilar e corte-o. Insira a haste no disco do suporte da amostra.
   3. Confirme no software que o estágio do microscópio está na posição de carga. Use trilhos orientadores para deslizar o suporte inteiro com a amostra verticalmente para baixo no microscópio. Gire-o, de modo que o disco do suporte magnético se posicione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/ MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillarie	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor