Preparazione del campione di microscopia a fogli luce: montaggio di embrioni zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine

Overview

Questo articolo descrive la preparazione del campione per la microscopia a fluorescenza a fogli leggeri. Dimostra anche un metodo per montare embrioni di zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine, che consente la registrazione di film a lunga decadere di embrioni vivi in condizioni quasi fisiologiche.

Protocol

1. Preparazione del campione

1. Preparazione del mix di agarosio
   1. 15 minuti prima della fabbricazione della miscela di agarosio, sciogliere un'aliquota di 1 ml di agarosio a basso punto di fusione dell'1% (sciolto in mezzo E3) in un blocco riscaldante impostato a 70 °C. Una volta che l'agarosio è completamente fuso, trasferire 600 μl in un tubo fresco da 1,5 ml, aggiungere 250 μl di mezzo E3, 50 μl di 0,4% MS-222 e 25 μl di soluzione di stock di perline vortexate.
      NOTA: Questo rende 925 μl della miscela, mentre altri 75 μl vengono calcolati per il liquido aggiunto in seguito insieme agli embrioni.
   2. Tenere il tubo in un secondo blocco riscaldante a 38-40 °C o assicurarsi che l'agarosio sia molto vicino al suo punto di gelata prima di metterlo embrioni campione.
2. Montaggio degli embrioni
   1. Prendere cinque capillari di vetro di 20 μl di volume (con un segno nero, ~1 mm di diametro interno) e inserire i pistoni a punta di Teflon corrispondenti in essi. Spingere lo stantuffo attraverso il capillare in modo che la punta del Teflon si trova nella parte inferiore del capillare.
   2. Trasferire cinque embrioni (un numero che può essere montato contemporaneamente) con una pipetta di vetro o plastica nel tubo di miscela di agarosio caldo a vortice a 37 °C.
      NOTA: Cerca di trasportare un volume minimo di liquido insieme agli embrioni.
   3. Inserire il capillare nel mix e succhiare un embrione all'interno tirando su lo stantuffo. Assicurarsi che la testa dell'embrione entri nel capillare prima della coda. Evitare bolle d'aria tra lo stantuffo e il campione. Ci dovrebbero essere ±2 cm di agarosio sopra l'embrione e ±1 cm sotto di esso. Ripetere per gli embrioni rimanenti.
   4. Attendere che l'agarosio si solidifichi completamente, cosa che avviene in pochi minuti e quindi conservare i campioni in mezzo E3, attaccandoli alla parete di un becher con plastilina o nastro adesivo. L'apertura inferiore del capillare deve essere appesa libera nella soluzione consentendo lo scambio di gas sul campione.
      NOTA: Un protocollo simile alle sezioni 1.1 e 1.2 può essere trovato anche sulla pagina wiki OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Posizionamento del campione

1. Gruppo portacampioni
   1. Inserire 2 maniche di plastica della giusta dimensione (nere) l'una contro l'altra nello stelo del portacampioni. I loro lati fessurati devono essere faccia verso l'esterno. Attaccare la vite del morsetto liberamente ruotandola 2-3 colpi. Inserire il capillare attraverso la vite del morsetto e spingerlo attraverso il supporto fino a quando la fascia di colore nera diventa visibile sull'altro lato. Evitare di toccare lo stantuffo.
   2. Stringere la vite del morsetto. Spingere l'eccesso di 1 cm di agarosio sotto l'embrione dal capillare e tagliarlo. Inserire lo stelo nel disco portacampioni.
   3. Verificare nel software che lo stadio del microscopio sia in posizione di carico. Utilizzare guide guida per far scivolare l'intero supporto con il campione verticalmente verso il basso al microscopio. Ruotarlo, in modo che il disco del supporto magnetico si blocchi in posizione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/ MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillarie	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor