Silencing<em> BRCA2</em> Zum Novel BRCA2-regulierten Biologische Funktionen in kultivierten menschlichen Zellen zu identifizieren
Summary
Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.
Abstract
Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins BRCA2 und seine Erkennung durch herkömmliche biochemische Analysen stellen eine große technische Herausforderung auf Grund der Größe des menschlichen BRCA2-Protein (etwa 390 kDa). Wir berichten Modifikationen von Standard siRNA-Transfektion und Immunoblotting Protokolle menschlichen BRCA2 endogenen BRCA2-Protein, bzw. in humanen epithelialen Zellinien auszuschalten und zu detektieren. Die wichtigsten Schritte sind, um eine hohe siRNA Transfektionsreagenz Verhältnis und zwei weiteren Runden von siRNA-Transfektion in demselben Experiment. Mit diesen und anderen Modifikationen an dem Standardprotokoll wir mehr als 70% Inaktivierung des menschlichen BRCA2 konsistent zu erreichen, wie durch Immunoblotting mit anti-BRCA2-Antikörpern beurteilt. Zusätzlich Denaturierung der Zelllysate auf 55 ° C anstatt der üblichen 70-100 ° C und anderen technischen Optimierungen des Immunoblotting Verfahren den Nachweis von intakten BRCA2-Protein selbst when sehr geringe Mengen an Ausgangsmaterial zur Verfügung stehen oder wenn BRCA2 Proteinexpressionsniveaus sehr niedrig sind. Effiziente Silencing von BRCA2 in menschlichen Zellen bietet eine wertvolle Strategie zur BRCA2-Funktion in Zellen mit intakten BRCA2, einschließlich Tumorzellen unterbrechen, um neue molekulare Signalwege und zellulären Funktionen, die durch pathogene BRCA2-Mutationen in Tumoren betroffen sein können, zu prüfen. Anpassung dieses Protokoll für die effiziente Schalldämpfung und Analyse von anderen "großen" Proteine wie BRCA2 sollte leicht erreichbar sein.
Introduction
Der BRCA2 (Brustkrebsanfälligkeit Gen-2) Gen kodiert für ein Protein, das Tumorsuppressor eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die Regelung der Funktion des Rekombinaseenzym Rad51 1 spielt. BRCA2 ist auch in der Modulation der Transkription und an der Zellzyklussteuerung 2 in Verbindung gebracht. Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen induzieren eine autosomal dominant Anfälligkeit für Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und Prostatakrebs bei Männern, als auch Veranlagung zu anderen Krebsarten 3,4. Trotz des erhöhten Risikos bei der Entwicklung von Krebs, BRCA2-Mutationen, die zu unterdrücken oder zu reduzieren BRCA2-Funktion können Krebszellen anfälliger für Chemotherapeutika, die DNA-Schäden verursachen 5-7 rendern. Sporadische Krebserkrankungen weisen eine niedrige Rate von BRCA2-Mutationen (<3%), obwohl reduzierte Mengen an BRCA2-Protein wurden bei einigen Krebsarten festgestellt, was darauf hindeutet, dass die BRCA2-Proteinkann während der Tumorgenese in sporadische Krebserkrankungen durch nicht-Mutationsabhängige Mechanismen 7,8 verloren. Somit ist es wichtig, BRCA2 Funktionen im Zusammenhang mit der Krebsbiologie sowie in anderen biologischen Systemen vollständig verstehen.
Ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Funktionen eines Gens in Säugetierzellen zu identifizieren, ist seine Expression unterdrücken. Als ein Beispiel hat Silencing BRCA2-Expression in einer Vielzahl von normalen Epithelzellen kürzlich zur Identifizierung eines neuartigen Funktion BRCA2 als Regulator der anoikis Beständigkeit ein wichtiger Schritt bei der Erfassung von Krebszell invasive und metastatische Fähigkeit 9 geführt. Gen-Silencing kann durch die Einführung in den Zellen entweder small interfering (si) RNA oder short hairpin (sh) RNA-Moleküle gezielt den spezifischen Gens erreicht werden. Die hohe Wirksamkeit der siRNA und seine Benutzerfreundlichkeit machen es die bevorzugte Werkzeug für Silencing-Experimente bei der Gewinnung neuer Erkenntnisse über kritische biologische Prozesse richtet einnd neue therapeutische Targets zu identifizieren. Jedoch kann effizient Zuschlags der Genexpression nicht für alle Gene leicht erreichbar sein und kann sehr unterschiedlich sein, je nach dem Zelltyp. Weil eine Abnahme der intrazellulären Proteinspiegel der relevanteste Phänotyp untersuchten, ist es wichtig, das Gen-Silencing durch Immunoblotting-Analyse des Genprodukts zu quantifizieren. In dieser Hinsicht stellt der BRCA2-Protein eine weitere Herausforderung: ein großes Protein (etwa 390 kDa), haben technische Schwierigkeiten bei herkömmlichen biochemischen Analyse, einschließlich Immunoblotting existieren.
Wir berichten hier über ein Protokoll für die effiziente Silencing von BRCA2 in humanen epithelialen Zelllinien und für die schnelle und erfolgreiche Detektion von BRCA2-Protein durch Immunoblotting-Analyse Knockdown optimiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da Keimbahnmutationen des BRCA2-Gen zu einem erhöhten Risiko für verschiedene Krebsarten, einschließlich der weiblichen und männlichen Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom und 3,4, eine Reihe von Studien durchgeführt, um die biologische Funktion zu verstehen, des BRCA2-Protein. Die meisten dieser Studien sind genetisch-basierte vor allem auf technische Schwierigkeiten bei der Analyse eines Riesenprotein wie BRCA2. Die zum Dämpfen und Analysieren BRCA2-Pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.
Materials
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
Riferimenti
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