Summary
Målet med denne protokol er at præsentere en standard metode til at udføre intravenøs glukose tolerance test (IVGTTs) for at vurdere glykæmisk kontrol i ikke-humane primater og vurdere deres metaboliske status fra sundt at dysmetabolic.
Abstract
Den intravenøse glucose tolerance test (IVGTT) spiller en central rolle i karakterisering af glukose homøostase. Når det tages sammen med serum biokemiske profiler, inklusive blodsukkerniveauet i både fodres og fastende tilstand, HbA1c, insulin niveauer, klinisk historie kost, kropssammensætning og kropsvægt status, en vurdering af normal og unormal glykæmisk kontrol kan foretages . Fortolkning af en IVGTT sker gennem målingen af ændringer i glucose- og insulinniveauer over tid i forhold til dextrose udfordring. Kritiske komponenter, der skal overvejes, er: peak glucose og insulin niveauer nået i forhold til T0 (slutningen af glukose infusion), glucose clearance K afledt fra hældningen af hurtige glukose clearance i de første 20 min (T1 til T20), den tid, at vende tilbage til glucose baseline, og arealet under kurven (AUC). Disse IVGTT foranstaltninger viser karakteristiske ændringer som glucosehomeostase bevæge sig fra en sund toa syg metaboliske tilstand 5. Heri beskriver vi karakteriseringen af humane primater (rhesus og Cynomolgus makakaber), som er mest relevante dyremodel for type II-diabetes (T2D) hos mennesker og IVGTT og kliniske profiler af disse dyr fra et magert sundt, at fede dysmetabolic, og T2D tilstand 8, 10, 11.
Introduction
Den IVGTT er en bekvem funktionelt assay, der rutinemæssigt anvendes til at bestemme β-cellefunktion hos mennesker ved forskellige metaboliske tilstande 5, 7. I dyremodeller af T2D, det er godt anerkendt som et redskab til at karakterisere dyr, der viser metabolisk sygdomsprogression fra en sundt at en dysmetabolic hyperglykæmisk tilstand 8, 9. Den nærmeste dyremodel af T2D demonstreres i ikke-humane primater (menneskelige primater), hvoraf rhesus og cynomolgus makakaber er bemærkelsesværdige eksempler. Disse dyr naturligt udvikle T2D med de samme risikofaktorer alder og fedme bidrager til forekomsten som hos mennesker 10. Endvidere er der en lignende sygdomsprogression og pancreas patologi viser amyloidaflejringer som dysmetabolic sygdommen skrider 11.
Her rapporterer vi på vores standard metode til at udføre en IVGTT i NHP'er som en del af vores koloni karakterisering af metaboliske status i disse dyr. Denne metode erlet at udføre i forhold til andre, mere tidskrævende og kostbare teknikker 2. Den IVGTT er nyttig til karakterisering en stor koloni af dyrene hurtigt og ofte. Når det tages i betragtning med niveauet for glyceret hæmoglobin (HbA1c), dyrets kost og fødeindtagelse historie, samt deres procent mager masse og kropsfedt, den IVGTT er normalt tilstrækkeligt til at karakterisere et dyrs metaboliske status og progression mod åbenlys diabetes 6 , 8.
HbA1C repræsenterer den gennemsnitlige glykæmiske niveau over livet i en røde blodlegemer, hvilket giver en pålidelig måling af blodsukkerniveauet i de foregående seks uger til tre måneder. Målt fra fastende baseline blodprøve af IVGTT, denne værdi giver et vindue til glykæmisk kontrol i løbet af måneder mellem procedurer. Hvis dyret har skiftet fra dysmetabolic til diabetisk siden deres sidste IVGTT, ville en HbA1C-værdi langt højere end deres tidligere værdi angiverat overgangen begyndte kort efter deres sidste IVGTT, mens en HbA1C værdi tættere på deres tidligere værdi tyder på, at de først for nylig har skiftet. Generelt i makakaber, HbA1C-værdier større end 6%, betragtes unormal, og indikerer dårlig glykæmisk kontrol 10, 23.
Glykæmiske niveauer bør fortolkes i sammenhæng med den adfærd og generelle sundhed af dyret som helhed. Diabetiske makakaber - ligesom mennesker - udstille hyperfagi, polydipsi og polyuri. Gruppe opstaldning af dyr giver væsentlige udfordringer for måling af disse indikatorer og det individuel pleje kræves til dysmetabolic og diabetiske aber. Vi anbefaler enkeltvis boliger dyrene for at mere personlig pleje kan leveres, og adfærdsmæssige markører for sundhed aben lettere overvåges 8. Derudover vil diabetiske makakaber udviser vægttab, samt en forhøjet lipidprofil (øgetkolesterol, hypertriglyceridæmi) og forstyrret mineralmetabolismen i serum kemi. Det er vigtigt at måle markører for lever- og nyrefunktion i serum kemi, som skade på disse organer er ofte komplikationer af fremrykkende stofskiftesygdom / diabetes, og kan co-determinanter for glykæmisk, lipid og mineralske ubalancer 9, 11, 18, 24 .
Når du bruger denne metode, de historiske værdier genereret fra flere, hyppige karakteriseringer løbet af livet af en abe er af særlig værdi. Hvis andre procedurer, såsom en glukose clamp eller gradueret glukose infusion (GGI), er nødvendige for at vurdere et dyrs sundhed, er det almindeligt ved første karakterisering når deres historie er ikke tilgængelig. Men når en baseline er blevet etableret, gentagne IVGTTs af en frekvens på hver tredje måned normalt tilstrækkelige til at spore et dyrs udvikling. Dette er især vigtigt, når dyrene er tilmeldt i flere studier i hele enkalenderår baseret på deres metaboliske status. Mens deres helbred kan forblive relativt stabil i år ad gangen, når den metaboliske status af et dyr forværres, kan en dramatisk stigning i insulinresistens og glucoseintolerans forekomme meget hurtigt. HbA1C værdier tillader nogle interpolation af faldet eller forbedring af sundhedstilstanden af dyret mellem procedurer planlagt tre måneders mellemrum. Af denne grund er denne metode ideel til karakterisering dyr anvendt i multiple, langsgående undersøgelser i løbet af deres naturlige levetid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af David H. Murdock Research Institute IACUC ligger på North Carolina Research Campus (NCRC), under protokol 14 til 017, Karakterisering af en ikke-human primat model af diabetes og prædiabetes / insulinresistens og effekt af lægemidler til at forbedre insulinfølsomhed og metabolisk funktion.
1. Animalske Valg og studieforberedelse
- Vælg kost og vægt stabile dyr baseret på månedlige fødeindtagelse og kropsvægt optegnelser.
BEMÆRK: Dyr, der er udstillet en seneste fald i appetit bør ikke karakteriseres indtil deres fødeindtagelse har stabiliseret.- For modne dyr (> 5 - 6 år), skal du ikke vælge dyr, hvis krop vægte mellem på hinanden følgende måneder afvige mere end 10% uden først at undersøge abe og udelukke andre end at ændre metaboliske status for det dramatiske ændring i vægt årsager.
- For glucose, insulin og c-peptide analytter, forberede K 2 EDTA prøvetagningsrør med proteasehæmmer (Aprotinin og DPP4I).
BEMÆRK: DPP4I + Aprotinin cocktail giver et bredt spektrum af proteaseinhibering bør dette være påkrævet for yderligere analytter (glucagon, GLP-1). I tilfælde af, at yderligere analytter ikke indsamles, bør blodet rør skal fremstilles på samme måde at sikre sammenhængen i prøvetagningen. Prøver til analyser ikke valideret til denne metode skal indsamles separat i henhold til fabrikantens anvisninger.- Forbered proteaseinhibitorcocktail ved blanding 100 mg lyofiliseret Aprotinin med 10 ml DPP4I. Tilsæt 10 pi af Aprotinin + DPP4I blanding til hver blod rør for hver milliliter blod opsamlet.
- Tilføj yderligere 10 pi af proteaseinhibitoren cocktail til hvert rør for mulig indsamling overdosering. Opbevar behandlede blod rør ved -20 ° C indtil anvendelse. Hold rør på våd is under Procedure og centrifugering ved 4 ° C.
- Brug en serum separator rør til at indsamle en blodprøve ved baseline for standard serum kemi analyse. For Complete blodlegemer (CBC), bruge en standard K 2 EDTA uden proteasehæmmere. Brug kryoglas til alikvot plasma og serum efter blodprøverne er blevet centrifugeret.
- Mærk blodet rør og de kryoglas passende med dyret identifikation, dato, procedure, tidspunkterne, og prøvevolumen. Mærk kryoglas med analytten (r) i plasma til passende assay.
- Forbered hepariniserede saltopløsning flush ved at injicere 0,15 ml af 1.000 USP enheder pr ml heparin i en 250 ml pose med normalt saltvand. Opnå en opløsning af 0,06 mg heparin / ml. Tegn 40 - 60 ml af denne opløsning til en saltopløsning lås til skylning mellem prøverne. Tegn yderligere 1 ml og 5 ml i separate sprøjter til skylning af dextrose infusionsport før og efter infusionen, hhv.
2.Animal Sedation og klargøring
- Fjern mad fra dyrets bur ikke mindre end 14 timer før proceduren, og ikke mere end 18 timer.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at dyrene fastet i proceduren for at undgå efter et måltid variation i glykæmiske værdier. Det er også en sikkerhedsforanstaltning for at undgå regurgitation og aspiration af maveindhold mens bedøvet. - Adstadig dyr til varigheden af IVGTT proceduren med ketamin gives intramuskulært som en generel anæstesi, ved 10 mg / kg. Administrere yderligere ketamin (5 - 10 mg / kg) ved intervaller på 20 - 30 minutter, eller efter behov, under proceduren.
- Vejes bedøvet dyr. Sende dyret i en til siden liggende stilling på en opvarmet procedure tabel.
- Overvåg kliniske parametre hver 15 til 20 min for at sikre, at dyret er i en stabil plan af anæstesi. Mål puls (100-200 bpm) og SPO 2 (> 92%) med et pulsoximeter. Måle respirationsfrekvens (20 - 50 vejrtrækninger / min) w ed et stopur, tælle respirations visuelt eller ved hånden over femten sekunder og gange med fire. Mål temperatur (> 97 ° F) rektalt. Overvåg farven af slimhinden omkring tandkødet og læber (fugtige, lyserød).
- Forbered to kanylen sites. Brug hårklippemaskiner at trimme hår fra området af interesse, hvor kateteret vil blive indsat, og sterilisere hele regionen med vekslende scrubs af chlorhexidin og 70% alkohol.
- Placer den ene kateter i regionen venstre eller højre cephalic eller saphenous vener og vedhæfte det til en heparin saltvand flush (0,06 mg heparin / ml) med en tre-vejs stophane. Dette er blodprøvetagningen draw site.
- Placer den anden kateter i en anden benet eller armen i området af de cephaliske eller saphenous vener og vedhæfte en havn. Brug dette site for dextrose infusion. Brug en lille, 1 ml flush hepariniseret saltvand for at holde kanylen patentet før dextrose infusion.
BEMÆRK: IVGTT procedure består af 8 blodprøve prøveudtagning tidspunkter (tabel 1).
- Tag basislinieprøven og bruge en håndholdt glucometer at måle fasteblodglucoseniveauet. Opnå en serumprøve for standard kemi analyse, samt en prøve af helblod for en CBC for at vurdere den generelle sundhed af dyret. Indsamle plasmaprøver til analyse af glukose og insulin niveauer fra basislinieprøven anvendelse af et kit valideret til anvendelse med makakaber i henhold til fabrikantens anvisninger 8, 9.
BEMÆRK: Det er vigtigt at have en pre-draw på 0,5 ml taget fra kanylen, før der træffes nogen prøve til blodprøvetagning for at fjerne resterende blod eller heparin i det døde rum af kanylen. - Efter opnåelse basislinieprøven, tilføre dosis på 50% dextrose (250 mg / kg) i løbet af 30 sek i dextrose infusion port.
BEMÆRK: Højere modeller dosis (500 mg / kg) kan anvendes,selvom dosen bør fastsættes tværs procedurer for at gøre langsgående sammenligninger.- Skyl infusion port med 5 ml hepariniseret saltvand for at sikre, at der ikke er dextrose tilbage i havn. I slutningen af infusionen er T0. Har teknikeren erstatte handsker, som resterende dextrose fra infusionen kan forurene efterfølgende blodprøver.
- Den første post-infusion prøve tidspunkt er på T3 min, fra slutningen af dextrose infusion, efterfulgt af T5 min, T7 min, T10 min, T15 min, T20 min og den sidste prøve tidspunkt er på T30 min. Saml plasma fra hvert tidspunkt til assay glucose og insulin niveauer med baseline prøven (se trin 3.1).
- På T3 min tidspunkt, bruge håndholdt glucometer til endnu engang at kontrollere blodsukkerniveauet.
BEMÆRK: De glucometer aflæsninger ved baseline og T3 kun at bekræfte infusion af dextrose. Blodglucoseniveauet på T3 min tidspunkt bør være ~ 100 mg / dl højere compared til fastende baseline plasma glukose niveau.
- På T3 min tidspunkt, bruge håndholdt glucometer til endnu engang at kontrollere blodsukkerniveauet.
4. Animal Recovery og prøve behandling
- Fjern kanyler og pres på de kateter websteder for hæmostase efter T30 min tid-point. Overvåg dyret indtil det har genvundet bevidsthed og sidder op. Offer foder, når dyret er fuldt tilbagebetalt.
- Anbring straks hver hele blodprøve i K 2 EDTA-rør på is. Centrifuge ved 3000 rpm ved en temperatur på 4 ° C inden for 10 min for indsamlingen. Alikvot plasmaprøver i kryohætteglas, fryse og opbevares ved -80 ° C indtil analyse.
- Tillad blodet ind i serum rør til standard serum kemi analyse at sidde ved stuetemperatur i mindst 20 minutter og ikke mere end 30 minutter før centrifugering ved 3.000 rpm ved stuetemperatur. Frys serumprøverne indtil analyseres inden 48 timer for indsamlingen.
BEMÆRK: køleskab hele blodprøver for CBC-analyse indtil såSayed inden 24 timer for indsamlingen.
- Tillad blodet ind i serum rør til standard serum kemi analyse at sidde ved stuetemperatur i mindst 20 minutter og ikke mere end 30 minutter før centrifugering ved 3.000 rpm ved stuetemperatur. Frys serumprøverne indtil analyseres inden 48 timer for indsamlingen.
5. Data Behandling
- Efter fastsættelse af plasma insulin og glucose kurver, fastlægge glukose clearance K fra hældningen af den naturlige logaritme af glukose værdier over baseline 16, 17.
BEMÆRK: Der kan forventes en sund NHP at have en glucose clearance rate K godt stykke over 1, ofte større end 2 eller mere, som et sundt dyr ofte vil vende tilbage til deres baseline glukoseværdier inden for 30 min. Som insulinproduktion dråber ud, vil glukose clearance rate K falde mere dramatisk, falder under 1. - Beregn AUC som helhed, som summen af summen af arealet af trapezoider repræsenterer arealet under kurven for hver linie mellem tidspunkter, gennem T30 16, 17.
BEMÆRK: Traditionelt er AUC for de første ti minutter af proceduren betragtes acute insulinrespons på glucose (AIR), mens AUC fra den sidste 20 min af proceduren betragtes som den sene insulin respons (LIR). Som dyret bliver mere dysmetabolic, vil insulin AUC stige, hvilket afspejler kompensation for stigende insulin ufølsomhed. Som dyret overgange til åbenlys diabetes vil imidlertid AUC falde, ofte først i den akutte insulin fase, fanget af luften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De i figur 1 resultaterne er demonstrative af typiske glucose og insulin Kurverne fra modne, sunde og diabetiske cynomolgus makakaber i løbet af en 30 min IVGTT. Data fra raske og avancerede diabetiske aber er vist for at kontrastere de indlysende forskelle mellem dyr fra begge yderste ender af rækken af metaboliske karakterisering. Denne IVGTT protokol er blevet anvendt med succes af forfatterne i rhesus makakaber med lignende resultater.
Fastende, baseline glukoseværdier af en sund makakaber (rhesus og cynomolgus) kan være så lav som 50 til 60 mg / dl 8. Som illustreret i figuren, den oprindelige glucoseekskursion - målt ved T3 - kan for et sundt NHP ikke klatre så højt som en typisk baseline glucose værdi for en diabetiker dyr, som ofte overstiger 200 mg / dl. I løbet af den følgende trediveminutter, glucoseniveauerne hos et sundt dyr ofte tilbage til deres hidtidige værdier, mens dysmetabolic og diabetiske dyr ikke (figur 1; optrukne linier). Den ledsagende insulin kurve for et sundt dyr udviser to toppe (figur 1; stiplet blå linie), som svarer til den oprindelige, hurtige fald i blodsukkeret (fase 1) medieret i større-end-normal del af perifere virkninger af insulin på glukose transport og optagelse 3, 4. omfanget af disse perifere virkninger, selv under den første fase af insulinresponset, ikke er lig med bidraget fra leveren til glucose sænkning, som under mindre, men mere vedvarende peak anden insulin (fase 2 ), har den største indflydelse på glykæmiske niveauer via undertrykkelse af endogene glukose produktion 1.
Som et dyr går fra sundt at dysmetabolic, der typisk en formindskelse af the første fase af insulin reaktion på dextrose bolus, som kan komme til udtryk i en reduceret AIR. Dog kan AUC forblive uændret, da der oftere vil være en samlet stigning i insulin produktion, giver for stort set uændrede glykæmiske niveauer i løbet af proceduren, som den øgede insulinproduktion kompenserer for faldet i følsomhed. Når et dyr er blevet åbenlyst diabetiker, insulinproduktion falder drastisk i afhængighed af dextrose bolus (figur 1; stiplet rød linje). Glykæmisk niveauer vil forblive forhøjet i løbet af proceduren, som hvad glukose clearance sker nu medieres næsten udelukkende af ikke-insulin-afhængige mekanismer (figur 1).
Figur 1: IVGTT Glukose Clearance og insulinproduktion Kurver for diabetisk og Healthy kontroldyr. Vist her er glukose (fuldt optrukket linie) og insulin (stiplet linie) kurver for sunde (blå linje) og diabetiske (rød linje) dyr. Disse værdier er gennemsnit af faktiske data indsamlet under IVGTTs udført på cynomolgus makakaber (diabetisk glukose: n = 27; sund glukose: n = 21; diabetisk insulin: n = 23; sunde insulin: n = 20; standard fejllinjer vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Clock Time | Tidspunkter (min) | Realtid | Blodprøve mængde (ml) | Prøve Assay | Glucose Meter Reading (mg / dl) | |
| Baseline | 5 ml | 1,5 ml SST - kemi 0,5 ml K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K2EDTA + 50 pi prot -. Glucose, insulin, C-Pep | ||||
| 0 | Dextrose infusion 250 mg / kg IV, givet over 30 sek, efterfulgt af 5 ml Heparin saltvandsskylning | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 pi Prot .: Glucose, Ins, C-Pep | ||||
Tabel 1:. IVGTT Procedure Tabel Vist her er en standard procedure rapport for en IVGTT, beskriver alle de relevante oplysninger fanget under proceduren. Klokketimer for prøven trækker efter dextroseinfusion bør beregnes fra slutningen af infusionen. Faktiske gange skal registreres for hver lodtrækning. Klik her for at downloade denne tabel som en Microsoft Word-dokument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den IVGTT vurderer kapaciteten af glucose-stimuleret insulinfrigivelse af en enkelt dextrose infusion baseret på kropsvægt 5, 12, 13. Fra assayet er fastende blodglucose og insulin niveau nås, og den muliggør en vurdering af dyrets evne til at frigive insulin og returnere den forhøjede glukose niveauet mod baseline. Dette giver brugeren oplysninger at karakterisere dyr som en normal glukose og insulin niveau sund kontrol, en hyperinsulinæmisk dysmetabolic dyr med normoglykæmi, eller en hyperglykæmisk insulinresistente diabetiker dyr.
Det er vigtigt, at blodprøver, især fra de tidlige tidspunkter, efter infusion af dextrose, er tegnet og behandles rettidigt og konsekvent. Dette vil reducere variabilitet inden for og mellem fag, og mindske mulighederne for fejl i den tidsmæssige rækkefølge af data. Timingen af T3 er af afgørende betydning, fordi den udflugt of plasmaglucose fra baseline til tre minutter efter infusion af dextrose er et af de endepunkter, der bruges til at karakterisere den metaboliske status af dyrene. Der er et fald i glukose clearance i de første 7 - 10 min efter dextrose infusion, som kan blive savnet, hvis de blod trækker tages ikke til tiden. Det er arealet under denne del af både glucose og insulin kurver, der anvendes som et slutpunkt, understreger betydningen af disse tidlige tidspunkter. Hvis en blodudtagning efter T3 er taget sent, kan proceduren fortsætte, men den faktiske tid af lodtrækningen skal rapporteres for at bevare den sande kurvens form så meget som muligt. Det er særlig vigtigt, at afvigelser på mere end et minut indfanges og rapporteres. Efter de første ti minutter, glucose clearance har tendens til at blive mere gradvis og kan ikke vende tilbage til basislinien inden for 30 min (figur 1). Proceduren kan forlænges ved prøveudtagning hver 10 min efter T30 tilerobre, hvor lang tid det tager dyret til at vende tilbage til baseline.
IVGTTs er begrænset af deres evne til direkte at måle insulinfølsomhed. Det er primært nyttigt som en metode til vurdering insulinproduktion og glucose clearance. Imidlertid kan hepatisk insulin ekstraktion fra forsyningen portalblodet kompromiser målinger af "insulinsekretion" fra det systemiske blodforsyning. Dette kan delvis overvindes imidlertid ved måling c-peptid, som udskilles i ækvimolære mængder fra pancreas, men fjernes ikke af leveren før indtastning generelle blodforsyning. Dette giver et klarere billede af insulin produktion til bedre at vurdere β-celle funktion 16. Også, IVGTTs ikke skelne mellem insulinafhængige mekanismer glucose clearance og ikke-insulinafhængig mekanismer 1, 6. Mens insulinfølsomhed kan vurderes indirekte gennem minimal modellering af data fra et IVGTT, kan opnås mere pålidelige målinger gennem the anvendelse af procedurer som f.eks Graded Glucose Infusion (GGI), som tilvejebringer en β-celle dosisresponskurve 14, 15.
Dog er insulinfølsomheden stadig vurderes kun indirekte med GGI. En standard insulindosis kan administreres til dyret under IVGTT at forbedre estimering af insulinfølsomhed, men der vil maskere endogen insulinproduktion, kompromittere vurdering af β-cellefunktion. Den hyperglycemic og hyperinsulinæmisk Clamp teknikker måler direkte glukose regulering via kontrolleret eksponering insulin. Ulempen ved både GGI og klemmen teknikker er, at de er dyre at udføre og kræver mere personale og tid til at fuldføre (undertiden så længe som seks til otte timer, afhængigt af udformningen af de procedurer) 16. The IVGTT, på den anden side, kan udføres under en time og med minimal arbejdskraft.
Almindeligvis vil et sundt dyr bortskaffe glucose meget hurtigly, ofte vender tilbage til deres basislinieværdier inden for 30 min, og deres insulin kurve vil udvise to distinkte toppe for de akutte og sene insulin responser. Som et dyr bliver mere dysmetabolic, deres fastende glucose og deres glucoseekskursion i de første tre minutter efter infusion kan stige. Dog kan disse værdier variere meget mellem sunde dyr, og er mest informative af sygdomsprogression sammenlignet med historiske værdier fra det samme dyr. Alt i alt dog, glucose clearance af en dysmetabolic dyr må ikke afvige meget fra, når de var raske. De første tegn på sygdomsprogression vil være tydeligst i insulinet kurve. Mens fastende insulin niveau kun kan være let forhøjet, vil insulin AUC typisk stige dramatisk i dysmetabolic dyr, hvilket afspejler kompensation for udviklingslandene insulin ufølsomhed. Som β-cellefunktion aftager dog en afstumpning af den akutte fase insulin respons kan ses. Thans vil blive afspejlet i en nedsat AIR, som, når normaliseret til baseline, kan henvende 0 i en diabetiker abe. Dette efterfølges af et samlet fald i insulin produktion og et dramatisk fald i glukose feltet 8, 9, 10, 11.
Den metaboliske status af et dyr kan være svært at afgøre med en enkelt IVGTT. Dette kan være tilfældet, når de forsøger at skelne et dyr, som enten tidlig dysmetabolic eller præ-diabetes. Når bliver gradvist mere dysmetabolic, at insulin produktionen stiger opretholde euglykæmi. Mens fastende glukose værdier kan blive lidt forhøjet, er nedsat glukose bortskaffelse ikke blive meget tydelig indtil β-celle funktion er blevet kompromitteret og insulinproduktion begynder at falde 18, 20. For en periode, før åbenlys diabetes har sat i, insulin værdier kan ligne kurven for en tidlig dysmetabolic dyr i hvem den første fase respons er blevet kompromitteret, men nogle insulin er still produceres ovenfor fastende, baselineværdierne. På grund af dette, kan AUC for insulin kurve for en tidlig dysmetabolic og prædiabetiske dyr være meget ens. I denne situation, idet en forhøjet glucose kurve, påvirket af både insulin-afhængig og ikke-insulin-afhængige mekanismer, ikke er tilstrækkeligt til at adskille dyret enten tidlig dysmetabolic eller præ-diabetes. Denne skelnen kan foretages ved at udføre en hyperinsulinæmisk / euglykæmisk klemme, som direkte vil vise insulinfølsomhed 19. Alternativt kan denne skelnen skal ske ved at udføre en anden IVGTT på dyret efter flere måneder. I sidstnævnte tilfælde, hvis AUC for insulin gror, Dyret kan anses for at have været tidligt dysmetabolic på tidspunktet for den første procedure. Hvis AUC formindskes imidlertid dyrets status dysmetabolic kan anses for at have været fremført / prædiabetiske på tidspunktet for den første karakterisering. En prædiabetiske tilstand kan også accompanIED af vægttab og øget væskeindtagelse i den tidsperiode intervenerende de to IVGTT procedurer. Disse forhold illustrerer, hvorfor IVGTT er et særligt nyttigt redskab, når de ses i lyset af en historie af sådanne procedurer i modsætning til at blive brugt som et øjebliksbillede af et dyrs sundhed.
Brugen af stolen tilbageholdenhed med bevidste dyr har vist sig at producere en betydelig stigning i blodsukkerniveauet under glukosetolerance test 25. Af denne grund, er dyrene bedøvet til denne procedure. Dog skal der udvises forsigtighed ved valg af bedøvelsesmiddel. Det er blevet rapporteret, at brugen ofα2-adrenoceptor agonister såsom xylazin og dexmedetomidin til sedation kan øge blodsukkerniveauet i ikke-humane primater 17, 21. Metoden rapporterede her kun bruger ketamin til sedation, som ikke forårsager blodsukkeret til at stige 22. Til tider kan et dyr udvisersådan stivhed og spænde at teknikeren kan føle en afslappende er nødvendig. I sådanne tilfælde har Diazepam og telazol blevet påvist at have en langt mindre dybtgående effekt på insulin produktion og glukosemetabolismen derefter α2-adrenoceptoragonister 21. Derfor er det vigtigt at overveje den bedøvende regime i metaboliske tests, såsom IVGTT. Sammenfattende IVGTT er en simpel metabolisk funktionstest, der rutinemæssigt udføres NHP-indhold, men det kan give værdifulde oplysninger til at kategorisere dyr inden for en koloni i forskellige metaboliske tilstande, dermed informere deres dyrs pleje og sundhed ledelse, samt deres potentielle nytte i modeller for metabolisk sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er tilknyttet med en kontrakt forskning organisation (Crown Bioscience) aktive inden for metaboliske sygdomme.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den stærke støtte fra DHMRI CLAS dyr plejepersonalet, Facility manager Mr. Daniel Peralta og deltage dyrlæge, Dr. Glicerio Ignacio, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
