Summary
Målet med detta protokoll är att presentera en standardmetod för att utföra intravenösa glukostoleranstest (IVGTTs) för att bedöma den glykemiska kontrollen hos icke-humana primater och bedöma deras metaboliska status från friska till metabola.
Abstract
Den intravenösa glukostoleranstest (IVGTT) spelar en nyckelroll i karakterisering av glukoshomeostas. När det tas tillsammans med biokemiska profiler, inklusive blodsockernivåer i både Fed och fastande tillstånd, HbA1c, insulinnivåer, klinisk historia av diet, kroppssammansättning och kroppsvikt status, en bedömning av normal och onormal glykemisk kontroll kan göras . Tolkning av en IVGTT sker genom mätning av förändringar i glukos- och insulinnivåer över tiden i förhållande till dextros utmaning. Kritiska komponenter som bör övervägas är: topp glukos och insulinnivåer som nåddes i samband med T0 (slutet av glukoslösning), glukos clearance K härleds från lutningen av snabb glukosclearance i de första 20 min (T1 till T20), tiden att återgå till glukos baslinjen, och området under kurvan (AUC). Dessa IVGTT åtgärder kommer att visa karaktäristiska förändringar som glukoshomeostas flyttar från en frisk to sjuka metaboliskt tillstånd 5. Häri kommer vi att beskriva karakterisering av icke-mänskliga primater (Rhesus och Cynomolgus makaker), som är den mest relevanta djurmodell av diabetes typ II (T2D) i människor och IVGTT och kliniska profiler av dessa djur från en mager frisk, till feta metabola, och T2D tillstånd 8, 10, 11.
Introduction
Den IVGTT är en praktisk funktionell analys som rutinmässigt används för att bestämma β-cellsfunktion hos människor vid olika metaboliska tillstånd 5, 7. I djurmodeller av T2D, det är välkänt som ett verktyg för att karakterisera djur som visar metabola sjukdomsprogression från en sund till en metabola hyperglykemiska tillstånd 8, 9. Den närmaste djurmodell av T2D demonstreras i icke-humana primater (NHP: n), varav rhesus och cynomolgus makaker är typiska exempel. Dessa djur naturligtvis utveckla T2D med samma riskfaktorer för ålder och fetma bidrar till dess förekomst som hos människor 10. Dessutom finns det en liknande sjukdomsutveckling och pankreas patologi visar amyloidavlagringar som metabola sjukdomen fortskrider 11.
Här rapporterar vi om vår standardmetod för att utföra en IVGTT i icke-mänskliga primater som en del av vår koloni karakterisering av metabolisk status hos dessa djur. Denna metod ärlätt att utföra i förhållande till andra, mer tidskrävande och kostsamma metoder 2. Den IVGTT är användbar för att karakterisera en stor koloni av djur snabbt och ofta. När beaktas med nivån av glykerat hemoglobin (HbA1c), är normalt tillräcklig för att karakterisera ett djurs metaboliska status och utveckling mot öppen diabetes 6 djurets kost och födointag historia, liksom deras procent muskelmassa och kroppsfett den IVGTT , 8.
HbA1C representerar den genomsnittliga glycemic nivå under hela löptiden för en röd blodkropp, vilket ger ett tillförlitligt mått på glukosnivåer under de senaste sex veckor till tre månader. Vid mätning från fasta prov av IVGTT baslinjen blod, ger detta värde ett fönster i glykemisk kontroll under månaderna mellan förfarandena. Om djuret har gått från metabola till diabetiker sedan deras senaste IVGTT skulle ett HbA1C värde mycket högre än deras tidigare värde indikeraratt övergången började snart efter deras sista IVGTT, medan ett HbA1C värde närmare till deras tidigare värde tyder på att de nyligen har gått. I allmänhet, i rhesusmacaques, värden HbA1C större än 6% anses onormal, och indikerar dålig glykemisk kontroll 10, 23.
Glykemiska nivåer bör tolkas inom ramen för beteende och allmänna hälsan hos djuret i sin helhet. Diabetes makaker - som människor - uppvisar hyperfagi, polydipsi och polyuri. Gemensamma burar ger stora utmaningar för mätning av dessa indikatorer och individuell omsorg som krävs för metabola och diabetes apor. Vi rekommenderar att var för sig inrymmer djuren så att mer personlig vård kan tillhandahållas, och beteende markörer för hälsa apan lättare övervakas 8. Dessutom kommer diabetiska makaker uppvisa viktminskning, samt en förhöjd lipidprofilen (ökadkolesterol, hypertriglyceridemi) och störd mineralmetabolismen i serum kemi. Det är viktigt att mäta markörer för lever- och njurfunktionen hos serumkemi, som skador på dessa organ är ofta komplikationer av att främja metabolisk störning / diabetes, och kan vara co-faktorer som påverkar glykemiskt, lipid och mineralobalanser 9, 11, 18, 24 .
Vid användning av denna metod, de historiska värden som genereras från flera, ofta karakteriseringar under hela löptiden för en apa är av speciellt värde. Om andra förfaranden, såsom en glukos klämma eller graderade glukoslösning (GGI), behövs för att fullt ut bedöma ett djurs hälsa, är det vanligt vid första karakterisering när deras historia är tillgänglig. Men när en baslinje har etablerats, upprepade IVGTTs av en frekvens av var tredje månad är normalt tillräckligt för att spåra ett djurs framsteg. Detta är särskilt viktigt när djuren är inskrivna i flera studier under enkalenderår baserat på deras metaboliska status. Medan deras hälsa kan förbli relativt stabil under flera år åt gången, då den metaboliska statusen för ett djur förvärras, en dramatisk ökning av insulinresistensen och glukosintolerans kan ske mycket snabbt. HbA1c-värden tillåter viss interpolering av nedgången eller förbättring av hälsotillståndet hos djuret mellan förfaranden planerade tre månaders mellanrum. Av denna anledning är denna metod idealisk för karakterisering djur som används i multipla, longitudinella studier under loppet av deras naturliga livslängd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av David H. Murdock Research Institute IACUC ligger på North Carolina Research Campus (NCRC), enligt protokoll 14 till 017, karakterisering av en icke-human primatmodell av diabetes och prediabetes / insulinresistens och effekt av läkemedel förbättra insulinkänslighet och metabolisk funktion.
1. Animaliska Urval och studie Förberedelse
- Välj kost och vikt stabila djur baserat på månads födointag och kroppsvikt poster.
OBS: Djur som har uppvisat en senaste tidens nedgång i aptit bör inte karakteriseras tills deras födointag har stabiliserats.- För vuxna djur (> 5-6 år), inte välja djur vars kropp vikter mellan månader i följd avviker med mer än 10% utan att först undersöka apan och utesluta andra än att ändra metaboliska status för den dramatiska förändringen i vikt orsaker.
- Med avseende på glukos, insulin och c-peptide analyter, förbereda K 2 EDTA provuppsamlingsrören med proteashämmare (Aprotinin och DPP4I).
OBS! DPP4I + Aprotinin cocktail erbjuder ett brett spektrum av proteashämning om detta skulle krävas för ytterligare analyter (glukagon, GLP-1). I händelse av att ytterligare analyter inte samlas in, bör blodrören framställas på samma sätt för att upprätthålla konsekvens i provsamling. Prover för analyserna inte validerade för denna metod bör samlas in separat, enligt tillverkarens rekommendationer.- Förbereda proteasinhibitorcocktail den genom att blanda 100 mg lyofiliserade Aprotinin med 10 ml DPP4I. Tillsätt 10 pl av aprotinin + DPP4I blandningen till varje blod rör för varje milliliter blod samlas.
- Tillsätt ytterligare 10 pl proteashämmare cocktail till varje rör för eventuell insamling överskott. Lagra behandlade-blod rör vid -20 ° C fram till användning. Håll rören på våt is under procedure och snurra vid 4 ° C.
- Använd ett serum separator rör för att samla in ett blodprov vid baslinjen för standardserum kemianalys. För blodstatus (CBC), använd en standard K 2 EDTA utan proteashämmare. Använd cryovials till alikvot plasma och serum efter blodproverna har spunnits ner.
- Märk blodrören och cryovials lämpligt med djuridentifierings, datum, förfarande, tidpunkt, och provvolym. Märka cryovials med analyt (er) i plasma för lämplig analys.
- Förbered hepariniserad saltlösning flush genom att injicera 0,15 ml av 1000 USP-enheter per ml heparin i en 250 ml påse med normal saltlösning. Erhålla en lösning av 0,06 mg heparin / ml. Dra 40 - 60 ml av denna lösning i en koksalt lås för spolning mellan prover. Dra ytterligare 1 ml och 5 ml i separata sprutor för spolning av dextros infusionsporten före och efter infusionen, respektive.
2.Animal Sedation och förberedelse
- Ta mat från djurets bur inte mindre än 14 timmar före ingreppet, och inte mer än 18 timmar.
OBS: Det är viktigt att djuren fasta under förfarandet för att undvika postprandiala variation i glykemiska värden. Det är också en försiktighetsåtgärd för att undvika uppstötningar och aspiration av maginnehåll medan sövd. - Stillsam djur under hela den IVGTT förfarandet med ketamin ges intramuskulärt som en narkos, vid 10 mg / kg. Administrera ytterligare ketamin (5-10 mg / kg) med intervaller på 20-30 minuter, eller vid behov, under förfarandet.
- Väg den sedated djuret. Placera djuret i en i sidled liggande ställning på en uppvärmd förfarande tabell.
- Övervaka kliniska parametrar var 15 till 20 min för att säkerställa att djuret är i ett stabilt plan av anestesi. Mäta hjärtfrekvens (100-200 bpm) och SPO 2 (> 92%) med en pulsoximeter. Mäta andningsfrekvens (20 - 50 andetag / min) w ed ett stoppur, räkna andetag visuellt eller för hand över femton sekunder och multiplicera med fyra. Åtgärd temperatur (> 97 ° F) rektalt. Övervaka färgen på slemhinnan runt tandköttet och läpparna (fuktiga, rosa).
- Förbered två kanyl platser. Använd hårklippningsmaskiner för att trimma håret från området av intresse där katetern kommer att införas, och sterilisera hela regionen med omväxlande skurar av klorhexidin och 70% alkohol.
- Placera en kateter i regionen av den vänstra eller högra KRANIE eller vena vener och bifoga det till en heparin saltlösning flush (0,06 mg heparin / ml) med en trevägskran. Detta är samplingsbloddragningen site.
- Placera den andra katetern i ett ben eller arm i regionen av de cefaliska eller vena vener och bifoga en port. Använd denna sida för dextros infusion. Använd en liten, 1 ml spola av hepariniserad koksaltlösning för att hålla kanylen patent före dextros infusion.
OBS! IVGTT förfarande består av 8 blodprovstagning provtagnings tidpunkter (tabell 1).
- Ta prov baslinjen och använda en handhållen glukometer att mäta fastande blodglukosnivån. Skaffa ett serumprov för standardkemi analys, liksom en hel blodprov för en CBC för att bedöma den allmänna hälsan hos djuret. Samla plasmaprover för analys glukos- och insulinnivåer från prov baslinjen med hjälp av ett kit validerats för användning med makaker enligt tillverkarens anvisningar 8, 9.
OBS: Det är viktigt att ha en i förväg dra av 0,5 ml tagna från kanylen före tar något urvalet för insamling av blod för att avlägsna återstående blod eller heparin i det döda-utrymmet av kanylen. - Efter att ha erhållit prov baslinjen, ingjuta dosen av 50% dextros (250 mg / kg) under 30 sek i den dextros infusionsport.
OBS: Högre dosmodeller (500 mg / kg) kan användas,men dosen bör fastställas över rutiner för att göra longitudinella jämförelser.- Spola infusions hamn med 5 ml hepariniserad koksaltlösning för att se till att det inte finns någon dextros kvar i hamnen. I slutet av infusionen är T0. Har teknikern ersätta handskarna, som rest dextros från infusionen kan förorena efterföljande blodprover.
- Den första efter infusionen sampeltid punkten är vid T3 min, från slutet av dextros infusion, följt av T5 min, T7 min, T10 min, T15 min, T20 min och det sista provet tidspunkten är vid T30 min. Samla plasma från varje tidpunkt för att analysera glukos och insulinnivåer med prov baslinjen (se steg 3,1).
- Vid T3 min tidpunkten använder handhållna glukometer att återigen kontrollera blodsockernivån.
OBS! Glukometer avläsningar vid baslinjen och T3 är bara att bekräfta infusion av dextros. Blodsockernivån vid T3 min tidpunkten bör vara ~ 100 mg / dl högre compared till fasta baslinjen plasmaglukosnivån.
- Vid T3 min tidpunkten använder handhållna glukometer att återigen kontrollera blodsockernivån.
4. Animal Recovery och provbearbetning
- Ta bort kanyler och utöva påtryckningar på kateter platser för hemostas efter T30 min tidspunkt. Övervaka djuret tills den har återfått medvetandet och sitter upp. Erbjudandet foder när djuret återhämtat sig helt.
- Omedelbart placera varje helblodprov i K 2 EDTA-rör på is. Centrifugera vid 3000 rpm vid en temperatur av 4 ° C inom 10 min av samlingen. Alikvotera plasmaprover i kryokärl, frysa och lagra vid -80 ° C tills analys.
- Tillåta blod in i serumröret för standardserum kemianalys att sitta vid rumstemperatur under inte mindre än 20 min och inte mer än 30 min före centrifugering vid 3000 rpm vid RT. Frysa serumprover tills de analyserades inom 48 h av samlingen.
OBS: Kylskåp helblod som samlats in för CBC analys till såSiddick inom 24 timmar för insamlingen.
- Tillåta blod in i serumröret för standardserum kemianalys att sitta vid rumstemperatur under inte mindre än 20 min och inte mer än 30 min före centrifugering vid 3000 rpm vid RT. Frysa serumprover tills de analyserades inom 48 h av samlingen.
5. Data Behandling
- Efter fastställande av plasma insulin och glukoskurvor, fastställa vilken glukos clearancehastighet K från lutningen av den naturliga logaritmen av glukosvärden över baslinjen 16, 17.
OBS: En frisk NHP kan förväntas ha en glukos clearance K långt över en, ofta större än 2 eller mer, som ett friskt djur kommer ofta tillbaka till sina utgångsglukosvärden inom 30 minuter. Som insulinproduktion sjunker, kommer glukos clearance K sjunka mer dramatiskt, faller under ett. - Beräkna AUC som helhet, som summan av summan av området för trapetser som representerar området under kurvan för varje linjesegment mellan tidpunkter, genom T30 16, 17.
OBS: Traditionellt är AUC för de första tio minuterna av förfarandet ansåg acute insulinsvar på glukos (AIR), medan AUC från den sista 20 min av det förfarande anses vara den sena insulinsvar (LIR). När djuret blir mer metabola, kommer AUC insulin öka, vilket återspeglar ersättning för att öka insulinokänslighet. Som djur övergångar till uppenbar diabetes, kommer dock AUC minskar, ofta först i fas akut insulin, fångas av AIR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultat som visas i figur 1 är demonstrativa typiska glukos- och insulinkurvorna från mogna, friska och diabetiska cynomolgus makaker under loppet av en 30 minuters IVGTT. Data från friska och avancerade diabetes apor visas för att kontrastera de uppenbara skillnaderna mellan djur från båda extrema ändarna av intervallet av metabolisk karakterisering. Denna IVGTT protokoll har använts framgångsrikt av författarna i rhesus makaker med liknande resultat.
Fastande, utgångsglukosvärden hos en frisk makaker (rhesus och cynomolgus) kan vara så låg som 50 till 60 mg / dl 8. Såsom illustreras i figuren, den initiala glukos utflykt - uppmätt vid T3 - kan för en frisk NHP inte klättra så högt som ett typiskt baslinje glukosvärde för en diabetiker djur, som ofta överstiger 200 mg / dl. Under följande trettiominuter, glukosnivåerna i ett friskt djur återvänder ofta till sina utgångsvärden, medan metabola och diabetiska djur inte (Figur 1, heldragna linjer). Den medföljande insulinkurvan för ett friskt djur uppvisar två toppar (Figur 1, streckad blå linje), som motsvarar den första, snabba nedgången i blodglukos (fas 1) förmedlad i större än normalt delvis av perifera effekter av insulin på glukos transport och upptag 3, 4. storleken på dessa perifera effekter, även under den första fasen av insulinsvar, inte lika bidrag levern att glukossänkande, som under mindre men mer ihållande andra insulin topp (fas 2 ), har störst påverkan på glykemiska nivåer via hämning av endogen glukosproduktion 1.
Som ett djur fortskrider från friska till metabola, det är typiskt en minskning av the första fasen av insulinsvar till dextros bolus, som kan återspeglas i en minskad AIR. Emellertid kan AUC förbli oförändrad, eftersom det kommer att oftare vara en total ökning av insulinproduktion, som innehåller i stort sett oförändrade glykemiska nivåer under loppet av förfarandet som ökad insulinproduktion kompenserar för minskningen i känslighet. När ett djur har blivit öppet diabetiker, sjunker insulinproduktionen dramatiskt till följd av dextros bolus (Figur 1, streckad röd linje). Glycemic nivåer kommer att förbli hög under loppet av förfarandet, som vad glukosclearance sker nu medi nästan helt av icke-insulinberoende mekanismer (Figur 1).
Figur 1: IVGTT glukosclearance och insulinProduktions Kurvor för diabetiker och Healthy kontrolldjuren. visas här är glukos (heldragen linje) och insulin (streckad linje) kurvor för friska (blå linje) och diabetes (röd linje) djur. Dessa värden är medelvärden av faktiska data som samlats in under IVGTTs utförs på cynomolgus makaker (diabetisk glukos: n = 27; sunt glukos: n = 21; diabetiker insulin: n = 23; sunt insulin: n = 20, standard felstaplar visas). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Klock tid | Tidpunkter (min) | Realtid | Blod Provmängd (ml) | prov Assay | Glukos Meter Reading (mg / dl) | |
| baslinje | 5 ml | 1,5 ml SST - kemi 0,5 ml K 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 xl prot -. Glukos, insulin, C-Pep | ||||
| 0 | Dextros infusion 250 mg / kg IV, ges under 30 sek, följt av 5 ml Heparin saltlösning flush | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
| 7 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot .: glukos, Ins, C-Pep | ||||
Tabell 1:. IVGTT ordningen tabellen här är ett standardförfarande rapport för en IVGTT, detaljer all relevant information fångas under förfarandet. Klocktider för prov drar efter dextrosinfusion bör beräknas från slutet av infusionen. Faktiska tider bör registreras för varje dragning. Klicka här för att ladda ner tabellen som en Microsoft Word-dokument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den IVGTT bedömer kapaciteten av glukosstimulerad insulinfrisättning genom en enda dextros infusion baserad på kroppsvikt 5, 12, 13. Från analysen är fasteblodsocker och insulinnivå uppnås och det gör en bedömning av djurets förmåga att frisätta insulin och returnera den förhöjda glukosnivån mot baslinjen. Detta tillhandahåller användaren med information för att karakterisera djuret som en normal glukos och insulinnivå frisk kontroll, en hyperinsulinemic av metabola djur med normoglykemi, eller ett hyperglykemiskt insulinresistent diabetes djur.
Det är viktigt att blodprover, särskilt från de tidiga tidpunkter efter infusion av dextros, dras och behandlas i tid och konsekvent sätt. Detta kommer att minska variabilitet inom och mellan individer, och minska möjligheterna för fel i tidsordning av data. Tidpunkten för T3 är av avgörande betydelse eftersom utflykt of plasmaglukos från baslinjen till tre minuter efter infusion av dextros är en av ändpunkterna som används för att karakterisera den metaboliska statusen hos djuren. Det finns en nedgång i glukosclearance inom de första 7-10 min efter dextros infusion, vilket kan missas om de bloddragningar inte vidtas i tid. Det är området under denna del av både glukos och insulin kurvor som används som en slutpunkt, betona vikten av dessa tidiga tidpunkter. Om en bloddragningen efter det att T3 tas sent, kan proceduren fortsätta, men den faktiska tidpunkten för dragningen bör rapporteras i syfte att bevara den sanna formen av kurvan så mycket som möjligt. Det är särskilt viktigt att avvikelser på mer än en minut att fångas och rapporteras. Efter de första tio minuterna, tenderar glukosclearance att bli mer gradvis, och kan inte återvända till baslinjen inom 30 min (Figur 1). Förfarandet kan förlängas genom att sampla varje 10 minuter efter T30 tillfånga hur lång tid det tar för djuret att återvända till baslinjen.
IVGTTs är begränsade genom sin förmåga att direkt mäta insulinkänsligheten. Det är primärt användbar som en metod för att bedöma insulinproduktion och glukos clearance. Men lever utvinning insulin från portalen blodtillförseln äventyrar mätningar av "insulinutsöndring" från den systemiska blodtillförsel. Detta kan delvis övervinnas, emellertid genom att mäta C-peptid, som utsöndras i ekvimolära mängder från bukspottkörteln men är inte avlägsnas av levern innan de kommer till allmän blodtillförsel. Detta ger en tydligare bild av insulinproduktionen att bättre kunna bedöma β-cellsfunktion 16. Dessutom gör IVGTTs ingen skillnad mellan insulinberoende mekanismer för glukosclearance och icke-insulinberoende mekanismer 1, 6. Även insulinkänsligheten kan bedömas indirekt genom minimal modellering av data från en IVGTT kan mer tillförlitliga åtgärder uppnås genom the användningen av förfaranden såsom Graded Glukosinfusions (GGI), som ger en kurva β-cell dos-respons 14, 15.
Dock är insulinkänsligheten fortfarande bedömas indirekt med GGI. En insulindos standard kan administreras till djuret under IVGTT att förbättra uppskattningen av insulinkänsligheten, men det kommer att maskera kroppsegen insulinproduktion, kompromissa bedömning av β-cellsfunktion. Den hyperglycemic och Hyperinsulinemic Clamp tekniker mäter direkt glukosreglering via exponering kontrollerad insulin. Nackdelen med både GGI och klämman tekniker är att de är dyra att utföra och kräver mer personal och tid att slutföra (ibland så länge som sex till åtta timmar, beroende på utformningen av förfarandena) 16. Den IVGTT, å andra sidan, kan utföras under en timme och med minimal arbetskraft.
I allmänhet kommer ett friskt djur avyttra glukos mycket snabbly, ofta återvänder till sina utgångsvärden inom 30 minuter, och deras insulinkurvan kommer att uppvisa två distinkta toppar för de akuta och sena insulinsvar. Som ett djur blir mer metabola, deras fasta glukos och deras glukos utflykt i de tre första minuterna efter infusion kan öka. Dock kan dessa värden variera kraftigt mellan friska djur, och är mest informativa av sjukdomsprogression jämfört med historiska värden från samma djur. Men totalt sett, glukos clearance av en metabola djur får inte avvika mycket från när de var friska. De första tecknen på sjukdomsprogression kommer att vara tydligast i kurvan insulin. Medan fastande insulinnivå kan endast vara milt förhöjda, kommer AUC insulin typiskt öka dramatiskt i metabola djur, vilket återspeglar ersättning för utvecklingsinsulinokänslighet. Såsom β-cellfunktionen avtar, fast, en avtrubbning av fasen insulinsvaret akut kan ses. Thans kommer att återspeglas i en minskad AIR, som när normaliserades till baslinjen, kan närma sig 0 i en diabetiker apa. Detta följs av en allmän nedgång i insulinproduktion och en dramatisk minskning av glukos clearance 8, 9, 10, 11.
Den metaboliska status för ett djur kan vara svårt att avgöra med en enda IVGTT. Detta kan vara fallet när man försöker att särskilja ett djur som antingen tidigt av metabola eller pre-diabetiker. När blir alltmer metabola, att insulinproduktionen ökar upprätthålla euglycemia. Medan fastande glukosvärden kan bli något förhöjd, inte nedsatt glukos förfogande blir inte mycket tydlig förrän β-cellsfunktion har äventyrats och insulinproduktionen börjar sjunka 18, 20. För en tid, innan öppen diabetes har satt in, insulinvärden kan likna kurvan för en tidig metabola djur hos vilka den första fasen svar har äventyrats, men någon insulin är still produceras ovan fastande, baslinjevärden. På grund av detta, kan AUC kurvan insulin av en tidig metabola och prediabetiker djur vara mycket lika. I denna situation, varvid en förhöjd glukoskurva, påverkat av både insulinberoende och icke-insulinberoende mekanismer, är inte tillräckligt för att särskilja djuret som antingen tidigt av metabola eller pre-diabetiker. Denna skillnad kan göras genom att utföra en hyperinsulinemic / euglycemic klämma, som direkt kommer att visa insulinkänsligheten 19. Alternativt kan göras denna åtskillnad på att utföra en annan IVGTT på djuret efter flera månader. I det senare fallet, om AUC för de insulinkurvan ökar, kan djuret anses ha varit tidigt av metabola vid tidpunkten för det första förfarandet. Om AUC minskar emellertid djurets metabola status kan anses ha avancerat / prediabetic vid tidpunkten för den första karakterisering. En prediabetic tillstånd kan också accompanerat av viktminskning och ökad vätskeintag under den tid ingripa de två IVGTT förfaranden. Dessa omständigheter visar varför IVGTT är ett särskilt användbart verktyg när de betraktas i ljuset av en historia av sådana förfaranden i motsats till att användas som en ögonblicksbild av ett djurs hälsa.
Användningen av stol återhållsamhet med medvetna djur har visat sig ge en signifikant ökning av blodglukosnivåer under glukostolerans test 25. Av denna anledning, är djur som sedated för detta förfarande. Dock måste man vara försiktig i valet av narkosmedel. Det har rapporterats att användningen ofα2-adrenoceptoragonister såsom xylazin och dexmedetomidin för sedering kan avsevärt öka blodglukosnivåer i icke-humana primater 17, 21. Metoden redovisas här bara använder ketamin för sedering, som inte orsakar blodsockernivåer att stiga 22. Ibland kan ett djur uppvisasådan styvhet och spänna att teknikern kan känna en relaxe är nödvändigt. I sådana fall har Diazepam och Telazol visat sig ha en mycket mindre djupgående effekt på insulinproduktionen och glukosmetabolismen sedan α2-adrenoreceptoragonister 21. Därför är det viktigt att ta hänsyn till anestesimetod i metaboliska tester, såsom den IVGTT. Sammanfattningsvis är IVGTT en enkel metabolisk funktionstest som rutinmässigt utförs i icke-mänskliga primater, men det kan ge värdefull information för att kategorisera djur inom en koloni i olika metaboliska tillstånd, därför att informera sin djuromsorg och health management, liksom deras potentiella användbarhet i modeller av metabola sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är anslutna med ett avtal forskningsorganisation (Crown Bioscience) aktiva inom området metabola sjukdomar.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för ett starkt stöd från DHMRI CLAS djurvård personal, Facility Manager Mr Daniel Peralta och delta veterinär, Dr. Glicerio Ignacio, DVM MRCVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-15R Centrifuge | plasma: 4 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Sorvall ST16R Centrifuge | serum: 22 °C at 3,000 rpm for 10 min | ||
| Thermo Scientific -86 °C Freezer, Forma 88000 Series | Model: 88500A | ||
| Dextrose 50% (D50) | Webster | 07-8008986 | I.V. glucose infusate |
| 3 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | serial blood draws | |
| 5 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | heparinized saline flush | |
| 10 ml Luer Lock Syringe | Midwest Veterinary Suppy | delivery of I.V. D50 | |
| Gauze sponges 2 x 2 | Midwest Veterinary Suppy | 366.23000.4 | Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution |
| 4 ml serum separator tubes | Midwest Veterinary Supply | 366.45000.4 | blood collection tube for superchem panel |
| K2EDTA, 2 ml | VWR | 95057-239 | blood collection tubes |
| Aprotinin, 100 mg | Sigma | A1153-100MG | blood collection tube protease additive |
| 22 G x 1" Catheters | Midwest Veterinary Suppy | 193.75250.2 | I.V. catheter |
| Injection Plug W/ Cap | Midwest Veterinary Suppy | 001.11500.2 | %50 dextrose infusion port |
| Porus Tape, 1/2" x 10 yd | Midwest Veterinary Suppy | 001.85000.2 | maintain adherance of catheters and hep. Locks |
| Chlorhexidine Solution 2% | Midwest Veterinary Suppy | 193.08855.3 | prep catheter site |
| 70% Ethanol | VWR | 71001-654 | prep catheter site |
| tourniquet | Webster | 07-8003432 | |
| 3-way stopcock | Midwest Veterinary Supply | 366.28510.4 | hep. lock |
| 37" extension set | Webster | 07-8454200 | hep. lock |
| Exel 50-60cc LL Syringes | Midwest Veterinary Suppy | 001.12250.2 | Heparinized saline flush |
| 250 ml bag 0.9% saline | Webster | 07-8365593 | flush |
| 1,000 U Heparin, 10 ml | Webster | 07-883-4916 | |
| Ketamine (Ketaset) 100 mg/ml | Fort Dodge | (AV ordered) | |
| Precision Xtra glucose test strips 50/bx | Abbott (American Diabetes Wholesale) | 9381599728K7 | test baseline/T3 blood glucose levels |
| Masimo Rad 57 | DRE | 6052057V | pulse-oximeter |
| Pavia rectal thermometer | Patterson | 07-8391335 | |
| Precision Xtra Glucometer | Abbott | 9381599728K7 | Handheld glucometer |
References
- Bergman, R., Phillips, L., Cobelli, C. Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man. J. Clin. Invest. 68, 1456-1457 (1981).
- Bergman, R., Prager, R., Volund, A., Olefsky, J. M. Equivalence of the insulin sensitivity index in man derived by the minimal model and the euglycemic glucose clamp. J. Clin. Invest. 79, 790-800 (1987).
- Hovorka, R., et al. Partitioning glucose distribution/transport, disposal, and endogenous production during IVGTT. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282, E992-E1007 (2002).
- Salinari, S., Guidone, C., Bertuzzi, A., Manco, M., Asnaghi, S., Mingrone, G. First-phase insulin secretion restoration and differential response to glucose load depending on the route of administration in type 2 diabetic subjects after beriatric surgery. Diabetes Care. 32 (3), 375-380 (2009).
- Clinical Diabetes Research: Methods and Techniques. Roden, M. , John Wiley & Sons. (2007).
- Cobelli, C., Pacini, G. Insulin secretion and hepatic extraction in humans by minimal modeling of c-peptide and insulin kinetics. Diabetes. 37, 223-231 (1988).
- Lorenzo, C., et al. Disposition index, glucose effectiveness, and conversion to type 2 diabetes: the insulin resistance atherosclerosis study. Diabetes Care. 33, 2098-2103 (2010).
- Hansen, B. C. Investigation and treatment of type 2 diabetes in nonhuman primates. Methods Mol Biol. 933, 177-185 (2012).
- Hansen, B. C., Bodkin, N. L. Standardization of IVGTT. Importance of method used to calculate glucose disappearance. Diabetes Care. 16 (5), 847 (1993).
- Hardwood, J. H., Listrani, P., Wagner, J. D. Nonhuman primates and other animal models in diabetes research. J Diabetes Sci Tech. 3, 503-514 (2012).
- De Koning, E. J., Bodkin, N. L., Hansen, B. C., Clark, A. Diabetes mellitus in Macaca mulatta monkeys is characterized by islet amyloidosis and reduction in beta-cell population. Diabetologia. 36, 378-384 (1993).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Insulin secretion, clearance and action before and after gastroplasty in severely obese subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 18, 295-300 (1994).
- Letiexhe, M. R., Scheen, A. J., Gerard, P. L., Desaive, C., Lefebvre, P. J. Postgastroplasty recovery of ideal body weight normalizes glucose and insulin metabolism in obese women. J Clin Endocrinol Metab. 80, 364-369 (1995).
- Kim, S. H., Abbasi, F., Chu, J. W., McLaughlin, T. L., Lamendola, C., Polonsky, K. S., Reaven, G. M. Rosiglitazone reduces glucose-stimulated insulin secretion rate and increases insulin clearance in nondiabetic, insulin-resistant individuals. Diabetes. 54, 2447-2452 (2005).
- Toffolo, G., Breda, E., Cavaghan, M. K., Ehrmann, D. A., Polonsky, K. S., Cobelli, C. Quantitative indexes of beta-cell function during graded up and down glucose infusion from C-peptide minimal models. Am J Physiol Endocrinol Metab. 280, E2-E10 (2001).
- Wang, X., et al. Quantification of beta-cell insulin secretory function using a graded glucose-infusion with C-peptide deconvolution in dysmetabolic, and diabetic cynomolgus monkeys. Diabetology and Metabolic Syn. 5, 40 (2013).
- Xiao, Y. F., Wang, B., Wang, X., Du, F., Benzinou, M., Wang, Y. X. Xylazine-induced reduction of tissue sensitivity to insulin leads to acute hyperglycemia in diabetic and normoglycemic monkeys. Anesthesiology. 13 (33), (2013).
- Porte, D., Kahn, S. β-cell dysfunction and failure in type 2 diabetes potential mechanisms. Diabetes. 50, Suppl 1. S160-S163 (2001).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), G214-G223 (1979).
- Ferrannini, E., Gastaldelli, A., Miyazaki, Y., Matsuda, M., Mari, A., DeFronzo, R. A. β-cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J Clin Endocrinol Metab. 90 (1), 493-500 (2005).
- Vaughan, K. L., Szarowicz, M. D., Herbert, R. L., Mattison, J. A. Comparison of anesthesia protocols for intravenous glucose tolerance testing in rhesus monkeys. J Med Primatol. 43, 162-168 (2014).
- Kemnitz, J. W., Kraemer, G. W. Assessment of glucoregulation in rhesus monkeys sedated with ketamine. American Journal of Primatology. 3, 201-210 (1982).
- Dutton, C. J., Parvin, C. A., Gronowski, A. M. Measurement of glycated hemoglobin percentages for use in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus in nonhuman primates. Am J Vet Res. 64, 562-568 (2003).
- Rai, V., Iyer, U., Mani, I., Mani, U. V. Serum biochemical changes in insulin dependent and non-insulin dependent diabetes mellitus and their role in the development of secondary complications. Int J Diab Dev Countries. 17, 33-37 (1997).
- Shirasaki, Y., Yoshioka, N., Kanazawa, K., Maekawa, T., Horikawa, T., Hayashi, T. Effect of physical restraint on glucose tolerance in cynomolgus monkeys. J Med Primatol. 42, 165-168 (2013).
