A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre alte rese di granzimi folici glicosilati ed enzimaticamente attivi in cellule T 2 93 del rene embrionale umano. Ciò si ottiene espandendo prima le cellule T HEC 2 93 in apposite piastre di coltura tissutale. La dimensione di preparazione abituale dopo l'espansione consiste in 20-25 piastre di coltura.

Il secondo passo consiste nel trasfettare transitoriamente le cellule espanse con un plasmide di espressione granzima utilizzando l'efficiente metodo del fosfato di calcio. Successivamente, i supernat cellulari vengono raccolti e i grandi enzimi secreti vengono purificati mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati. Le fasi finali consistono nell'attivare i grandi enzimi mediante trattamento con chinasi e nell'ulteriore purificazione delle proteasi mediante cromatografia a scambio cationico.

In definitiva, l'attività enzimatica viene testata utilizzando un test di metrica chole rapido e affidabile, poiché la disponibilità di proteasi attiva in quantità sufficienti è un fattore limitante nella ricerca sui granzimi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo, come la caratterizzazione di nuove vie di morte cellulare in diversi organismi, o l'identificazione di nuovi substrati proteasi in approcci di proteoma intero per esprimere grandi enzimi. Per prima cosa, coltivare le cellule HEC 2 93 T in 20 millilitri di terreno di coltura, utilizzando piastre di coltura tissutale da 150 x 25 millimetri dividono le cellule all'80% di fluenza di Co. Le cellule si attaccano liberamente, ma possono essere staccate meccanicamente senza tripsina pipettando rigorosamente su e giù per la piastra.

Le cellule la notte prima della trasfezione per dare dal 60 al 70% di fluenza di co al giorno della trasfezione. Una normale dimensione di preparazione consiste in 20-25 piatti di coltura. Un'ora prima della trasfezione, il terreno di coltura standard è stato modificato in 20 millilitri di terreno di trasfezione verso la fine della fase di incubazione di un'ora, ha mescolato 400 microgrammi di DNA plasmatico con 10,95 millilitri di acqua distillata doppia e 1,55 millilitri di cloruro di calcio a due molari in provette da 50 millilitri uno o due minuti prima della trasfezione.

A 12,5 millilitri di due x cumuli di soluzione salina tamponata a 12,5 millilitri di soluzione di DNA e calcio mescolata per inversione delle provette prima di incubare per 30 secondi. A temperatura ambiente, aggiungere questo composto, goccia a goccia direttamente sulle celle a cinque millilitri per piatto, cospargere uniformemente su tutta l'area, trasformando il terreno in un colore leggermente arancione. Incubare le piastre di coltura per sette-11 ore in un incubatore di coltura tissutale.

Dopo l'incubazione, è visibile un precipitato fine. Rimuovere il mezzo di trasfezione. Sciacquare accuratamente con PBS preriscaldato e aggiungere 20 millilitri di terreno di coltura privo di siero prima di incubare per 72 ore in un incubatore di coltura tissutale, analizzare la trasfezione e l'efficienza di espressione eseguendo un campione del surnatante cellulare sulla pagina SDS e colorando con kumasi.

Blu brillante. Per visualizzare una banda granzyme. Dopo l'incubazione, decantare i surnatanti della coltura cellulare in provette da 250 millilitri e liberarli mediante centrifugazione.

Esegui una prima centrifuga che eliminerà il mezzo dalle celle staccate. Trasferire il surnatante in provette fresche da 250 millilitri e centrifugare a 4.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti. Quindi, aggiungi cinque millilitri di cloruro di sodio, 6,25 millilitri di tris base e un millilitro di solfato di nichel più 250 millilitri di surnatante chiarificato.

Filtrare il surnatante utilizzando un'unità filtrante sottovuoto da 500 millilitri. Equilibrare una colonna per cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati al nichel con il suo tampone legante. A utilizzando un sistema FPLC adatto.

Quindi applicare il surnatante chiarificato sulla colonna bilanciata a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto a quattro gradi Celsius. Dopo l'applicazione del surnatante, lavare la colonna con il suo tampone legante fino a raggiungere la linea di base dell'assorbente ultravioletto o UV. Eluire i granzimi con un gradiente ILE lineare di 20 millilitri a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto, raccogliendo frazioni di due millilitri.

Analizzare le frazioni eluciane mediante pagina SDS e colorazione kumasi. Tirare il grande zima contenente le frazioni in un tubo stordente. Conservare un piccolo campione a meno 20 gradi Celsius come controllo pre entero chinasi.

Aggiungere entero chinasi a 0,02 unità per 50 millilitri di surnatante iniziale direttamente alla frazione aggregata nella provetta per dialisi e dializzare per una notte a temperatura ambiente in tampone enterochinasi. Il giorno successivo analizzare la chinasi trattata grand rispetto al controllo della chinasi pre enterer mediante pagina SDS e colorazione blu kumasi. Al termine dell'elaborazione del terminale.

Sostituire il tampone di dialisi con il tampone S A e dializzare per altre quattro ore a temperatura ambiente prima di filtrare DIALATE eight. Quindi, equilibrare una colonna S con il buffer S. A.Caricare il campione sulla colonna a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto a quattro gradi Celsius dopo il caricamento del campione.

Lavare la colonna con il tampone S A fino a raggiungere la linea di base assorbente UV. Eluire i granzimi con un gradiente lineare di cloruro di sodio da 30 millilitri, il granzima A eluisce a circa 650 millimolari di cloruro di sodio, il granzima B a circa 700 millimolari di cloruro di sodio e il granzima M a circa 750 millimolari di cloruro di sodio. Raggruppare le frazioni contenenti granzimi e concentrarle a circa 100 micromolari in filtri di centrifuga, aliquotare le preparazioni di granzima concentrate e conservarle a meno 80 gradi Celsius.

Successivamente, analizzare le frazioni eluciane mediante la pagina SDS e i saggi metrici chole per eseguire i saggi metrici chole distribuiscono piccoli campioni di granzima da frazioni elliche o scorte concentrate in 96. Le piastre a fondo piatto includono un controllo positivo e un controllo negativo. Aggiungere 100 microlitri di tampone per test a ciascuno.

Incubare bene la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Infine, misurare la densità ottica a 405 nanometri in un lettore di micropiastre. Questo protocollo produrrà alte rese di granzimi puri, come dimostrato in questo gel rappresentativo della pagina SDS colorato con kumasi che mostra il granzima BE dalla colonna S.

I granzimi ricombinanti mostrano un'attività simile a quella dei preparati di proteasi nativi, come mostrato in questo saggio di metrica del colore che confronta l'attività del granzima B ricombinante e nativo. È importante sottolineare che il trattamento con endo H indica che i granzimi prodotti nelle cellule T HEC 2 93 sono completamente glicosilati. I grandi enzimi ricombinanti sono in grado di scindere i substrati proteici macromolecolari, come dimostrato in questo saggio di scissione del granzima rappresentativo utilizzando il substrato proteico batterico e l'UOCD.

Qui, la banda che rappresenta la scissione N-O-U-C-D scompare lentamente con l'aumentare della concentrazione di granzima. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre grandi enzimi completamente glicosilati e proattivi ad alte rese in cellule HK 2 93 T.