인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화
Summary
피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석을 설명한다.
Abstract
돌기 쪽은 중추 신경계의 흥분성 시냅스의 후 시냅스 구획에 해당하는 작은 돌기입니다. 그들은 수상 돌기를 따라 배포됩니다. 이들의 형태는 신경 세포의 활동에 크게 의존, 그들은 동적입니다. 돌기 쪽은 표면과 시냅스 밀도의 수준에서 글루타메이트 수용체 (AMPA와 NMDA 수용체)을 표현한다. 각각의 척추는 신경 세포가 독립적으로 주 및 지역 활동을 제어 할 수 있습니다. 척추 모폴로지 광범위 생체 내 접근법과 설치류로부터 얻어지는 신경 조직 배양을 모두 사용하여, 뇌 피질의 글루타메이트 피라미드 세포에서 연구되어왔다. 설치류 배양 뉴런과 일차원 정량 분석 1에 도시 된 바와 같이 신경 병리학 적 조건은, 변경된 척추 유도 및 성숙에 관련 될 수있다. 본 연구는 인간의 cortic를 사용하여 척추 형태학의 3D 정량 분석을위한 프로토콜을 설명신경줄 기세포 (늦은 피질 전구 세포)로부터 유래 된 알 뉴런. 이러한 세포는 처음에 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 얻었다. 이 프로토콜은 다른 배양 기간에서 척추 모폴로지의 분석이 가능하고, 정신 질환 환자로부터 수득 된 것과 제어 개체로부터 얻은 유도 된 다 능성 줄기 세포 사이와 비교 가능.
Introduction
대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 돌기 쪽은 설치류, 영장류, 그리고 인간의 뇌에서 이러한 신경 세포 아형의 기저와 혀끝의 수상 돌기를 따라 분포되어 작고 얇은 돌기 있습니다. 그들은 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트이며, 학습과인지 과정의 주요 기능을 표시합니다. 인간 돌기 쪽의 상세한 구조는 기술적으로 전자 현미경 (2)에 의해 연구되었다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요하고 무거운 부하를 나타냅니다. 최근 돌기 쪽의 형태의 3 차원 (3D)는 크게 재구성 척추 수동 분석 (3)에 결합 된 특정 소프트웨어를 사용하여 인간의 뇌 피질에서보고되었다.
면역 결합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기술을 형광 현미경에 의해 식별 및 척추 모양 측정 정확한 도구를 나타낸다. 이 방법은 쉽게 배양 신경에 적용 할 수있다. 하우버전, 데이터는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)에서 파생 된 인간의 신경 세포에 척추 성숙과 형태의 분석보고되지 않았다.
이 연구의 목적은 시험 관내에서 배양 된 신경 세포에서 돌기 척추 촬상을 허용하는 프로토콜을 기술 하였다. Imaris 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈과 GFP 표지, 공 초점 현미경 및 3D 분석은 본 프로토콜에 사용 하였다. II 신경 줄기 세포로부터의 IV (NSC)에 층의 피질 글루타메이트 성 신경 세포를 획득하는 데 필요한 배양 단계는 여기서 설명 간략하다. 인간의 NSC 생산을위한 전체 프로토콜은 이미 다른 곳에서 4 게시되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
피라미드 신경 세포의 형태 학적 특성의 정량화 소프트웨어에 의존했다. 필라멘트 트레이서 인터페이스는 뉴런 및 등뼈의 분할을 위해 사용하고, XT 모듈들은 분석을 위해 사용 하였다.
우리의 기술의 정확성을 분석하기 위해, 우리는 먼저 배양 6, 7 및 인간 뇌 조직 3 쥐 성숙한 피라미드 신경 세포를 사용하여 게시 된 것과 측정 형태 학적 파라미터 (길이, 면?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
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