Utilizzando una strategia di microarray di glicani stampati, è stato miniaturizzato un test convenzionale su piastra a 96 pozzetti per l'analisi dell'avidità e della specificità dell'emoagglutinina del virus dell'influenza A per i recettori contenenti acido sialico.
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Articolo metodologico
Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Virus influenzale A (IAV) emoagglutinine riconoscono acidi sialico sulla superficie delle cellule, come i recettori funzionali per ottenere l'ingresso nelle cellule. uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV può attraversare la barriera di specie di pollame, suini, cavalli e gli esseri umani. virus aviari riconoscono acido sialico attaccato ad un galattosio penultima da un legame α2-3 (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani preferenzialmente riconoscono acido sialico con un α2-6 linkage (recettori di tipo umano). Per monitorare se i virus aviari si stanno adattando ai recettori di tipo umano, possono essere utilizzati diversi metodi. microarray glycan con diverse librerie di sialosides sintetici sono sempre più utilizzati per valutare recettore specificità. Tuttavia, questa tecnica non è utilizzata per misurare avidità. Misurazione della avidità è solitamente ottenuto valutando il legame di emoagglutinina o virus diluiti serialmente per glycans adsorbita convenzionali polipropilene piastre a 96 pozzetti. In questo saggio, glicani con α2-3 o α2-6 acidi sialici sono accoppiati alla biotina e streptavidina adsorbite piastre, o sono accoppiati poliacrilammide (PAA) che adsorbe direttamente alla plastica. Abbiamo notevolmente miniaturizzato questo test stampando direttamente sialosides PAA-linked e le loro controparti non PAA-linked su vetrini micro-bene. Questo set-up, con 48 matrici su una singola diapositiva, permette analisi simultanee di 6 glycan proteine leganti a 8 diluizioni, interrogando 6 glicani diversi, tra cui due controlli non sialylated. Ciò equivale a 18x piastre a 96 pozzetti nel test tradizionale piatto. Il formato di matrice glycan riduce il consumo di sostanze e prodotti biologici e, quindi, migliora notevolmente l'efficienza.
Introduzione
uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV è in grado di attraversare la barriera di specie di pollame e mammiferi, inclusi gli esseri umani. IAV aviaria riconoscono α2-3 acidi sialico legati (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani si legano α2-6 acidi sialico legati (di tipo umano recettori). Per essere in grado di replicare in modo efficiente e trasmettere tra gli esseri umani un IAV aviaria ha bisogno di legarsi ai recettori di tipo umano 1.
IAV sono divisi sulla base di sierologia che caratterizza l'antigenicità della loro emoagglutinina (HA) e glicoproteine busta neuraminidasi (N....
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Protocollo
NOTA: Tutte le fasi sono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.
1. Costruzione Array
- Glycan Preparazione e configurazione Piastra
- Preparare uno stock di buffer di stampa. Prima fare 500 ml di una soluzione 150 mM magazzino di sodio fosfato bibasico. Anche fare 50 ml di una soluzione 150 mM magazzino di soluzione di sodio fosfato monobasico. In un pallone, utilizzando una ancoretta e pHmetro magnetico, titolare lentamente la soluzione di fosfato sodico bibasico con la soluzione monobasico fino a raggiungere un pH di 8,5. Aggiungere Tween-20 0,005%.
- Preparare i campioni glycan. Diluire PAA glicani coniugati, (....
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Risultati
Stampa, scansione e analisi dei dati
Per garantire una stampa corretta, è fondamentale avere il corretto allineamento della griglia macchiato all'interno della maschera teflon, che delinea ogni matrice sul vetrino. Durante la stampa, a causa della natura del rivestimento in teflon, macchie non sono visibili ad occhio nudo sulle slitte MPX. L'attenzione è rivolta quindi alla comparsa dei pre-macchie sui vetrini poli-L-l.......
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Discussione
Valutare IAV recettore specificità è un passo importante per l'analisi potenziale pandemia di virus aviari. riconoscimento acido sialico dal virus è legata a diverse proprietà biologiche quali legandosi e rilascio dalla cellula. La conoscenza di quali sono necessarie mutazioni di aminoacidi per i virus aviari per raggiungere α2-6 vincolante e attraversano la barriera di specie consente preparazione alla pandemia. Diversi test sono utilizzati per determinare la specificità del recettore; Tuttavia, tutti hanno i loro .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Fondo Scripps Microarray Core e un contratto dai Centers for Disease Control (JCP). RPdV è un destinatario di una borsa di Rubicon e VENI dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO). Il Consorzio per la Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org/) finanziato dalla NIGMS concessione GM62116 (JCP) ha fornito diversi glicani utilizzati in questo studio. Questa è la pubblicazione 29113 da The Scripps Research Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NEXTERION® Guida H MPX-48 | Schott | 1091525 | Vetrini per micropozzetti |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | ha interrotto la produzione | dello scanner confocale per microarray |
| Innoscan 1100AL Scanner/software Mapix | Innopsys-scanner | per microarray confocale | |
| MicroGrid II | Stampante | Digilab-microaray | |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Lectina vegetale |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Lectina vegetale |
| Anticorpo anti-streptococco | IBA | 2-1509-001 | Anitbody per il binding HA |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody per rilegatura HA |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | Detergente |
| di-basico Sodio Fosfato | Sigma | 255793 | stampa componente |
| mono-basico Sodio fosfato | Sigma | 229903 | Componente buffer di stampa |
| soluzione di poli-l-lisina | Sigma | P8920 | componente della slitta di pre-smacchiatura |
| idrossido di sodio | Sigma | 221465 | componente del vetrino pre-spotting |
| etanolo | Sigma | 493546 | componente del vetrino pre-spotting |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Corning | 46-013-CM | tampone di incubazione/lavaggio |
| Perni SMP4B | Telechem | Spillo di stampa | SMP4B |
| Azoto compresso (Grado 5) | Praxair | UN1066 | strumento generale per spolverare/essiccare |
| Acido borico | Sigma | B6768-500G | Reagente bloccante vetrini |
| etanolammina | Sigma | E9508-500ML | Reagente bloccante vetrini |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker su array |
| PAA-LNLN | Consorzio per glicomica funzionale | PA368 | Glicani maculati |
| PAA-3SLNLN | Consorzio per Glicomi Funzionali | PA362 | Glicani Maculati |
| PAA-6SLNLN | Consorzio per Glicomici Funzionali | PA343 | Glicani Macculati |
| LNLN | Consorzio per Glicomici Funzionali | Te98 | Glicani Maculati |
| 3SLNLN | Consorzio per Glicomici Funzionali | Te175 | Glicani Maculati |
| 6SLNLN | Consorzio per Glicomica Funzionale | Te176 | Glicani maculati |
| Piastra per microtitolazione a 384 pozzetti | Matrix TechCorp | 4361 | Piastra di stampa |
| Marcatore da laboratorio VWR | VWR | 52877-150 | Numerazione dei vetrini |
| Piatto di colorazione per vetrini | Wheaton Sigma | Z103969-1EA | Blocco e asciugatura |
Riferimenti
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional ba....
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Ristampe e permessi
