Abstract
Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.
Introduction
aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano.
IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelope. HA se liga a ácidos siálicos, enquanto que NA é a enzima destruidora de receptor na outra extremidade do ciclo de vida viral e cliva o ácido siálico 2. Todos os vírus que infectam humanos, incluindo H1N1, H2N2 e H3N2, têm uma origem aviária 3. Durante as duas últimas décadas vários aviários para os crossovers humanos ocorreu, com o H5N1, H7N7 e H7N9, sendo o mais conhecido; However, outros subtipos de ter infectado seres humanos mais esporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Felizmente, parece que nenhum destes vírus têm sido inteiramente capaz de se adaptar aos receptores do ácido siálico ligado a α2-6-tipo humano 5-8. Adaptação do vírus zoonóticos aviária ou de outros para acomodar a replicação e transmissão em hospedeiros humanos poderia ter um efeito devastador sobre a saúde humana. Portanto, o conhecimento prévio de como esses vírus estão evoluindo para se ligar receptores do tipo humano ajudará a vigilância mundial do vírus da gripe emergentes.
Determinação da preferência receptor foi elucidada primeiro usando eritrócitos de diferentes espécies e continua a ser um ensaio favorecida entre os pesquisadores da gripe 9-12. A demonstração de que os vírus aviários reconhecer ácido siálico α2-3 e vírus humanos α2-6 ligados ácido siálico foi originalmente baseado em um ensaio utilizando hemaglutinação de eritrócitos enzimaticamente modificados para conter cada uma das linkages 13,14. Embora a leitura é hemaglutinação, um ensaio padrão para virologistas, as estruturas de glicano subjacentes não são definidos, a única ligação terminal. Além disso, a disponibilidade limitada das sialiltransferases, utilizados para re-sialilar as células, têm limitado a utilização deste ensaio 15-18. Subsequentemente, outros métodos de determinação das preferências de ligação ao receptor foram introduzidos usando estruturas de glicanos sialilados, ligado a poli-acrilamida (PAA) ou estruturas poli-glutamato (PGA) nos ensaios baseados em placa 19,20. Diversas variações são possíveis tanto no revestimento os glicanos vírus ou a placas de microtitulação, cada um dos quais resulta em um ensaio de ELISA de tipo robusto, fiável e muito sensível 21-23. Alternativamente, glicanos ligados em biotina pode substituir PAA / PGA e podem ser conjugados com placas revestidas com estreptavidina 2,24. Embora alguns soros específicos podem ser necessários, ELISAs estão glicanos padrão e vários ligados ao PAA são prontamente commercially e não comercialmente disponível (Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org)).
Tecnologias de microarray glicano surgiram como uma ferramenta valiosa para determinar a especificidade de receptor, como vários glicanos diferentes são vistos, e ligação a uma grande variedade de estruturas diferentes pode ser avaliada dentro de um único ensaio 25-29. A ligação dos IAV para estas estruturas fornece uma melhor compreensão das estruturas de glicano que IAV reconhece preferencialmente 30-33. microarrays de glicano requerem pequenas quantidades de volume de amostra para efectuar um ensaio de ligação e utiliza apenas quantidades diminutas de glicano por ponto (2 nl). No entanto, estas matrizes são normalmente utilizados apenas para avaliar a especificidade dos receptores de glicanos. Análise de vários vírus, ou proteínas de hemaglutinina, em vários intervalos de concentração pode ser proibitivo devido ao número de lâminas necessárias. Além disso, até à data, nenhum ensaio de avidez relativa foi desenvolvido usando ar glicanotécnicas de raios.
Para combinar a exigência de baixo amostra proporcionada por técnicas de microarray de glicano e a sensibilidade dos glicanos ligados em PAA em ensaios baseados em ELISA, procurou-se desenvolver uma matriz de glicanos multi-bem que iria permitir a análise de alto rendimento com resolução semelhante ou melhor, em comparação para o ensaio tradicional baseado em ELISA. Simultaneamente, queríamos minimizar a quantidade de produtos biológicos e químicos repórter consumidos. O resultado final é um ensaio de avidez miniaturizado, desenvolvido especificamente para o controlo e especificidade IAV é igualmente aplicável à avaliação de outras proteínas de ligação de glicano. Usando uma lâmina de vidro separada em 48 micro-poços por uma máscara de Teflon, 6 glicanos diferentes são vistos em 6 réplicas por poço. A plataforma de microarray ofereça as mesmas tendências na ligação ao receptor visto no formato macro ELISA com várias vantagens. Estas incluem: (I) a impressão de composto em 6 repetições, utilizando amostra mínima, contra o revestimento de várias linhas iplaca na, usando 100 ul por poço; (II) vários compostos diferentes analisados simultaneamente num único poço, incluindo os controlos; (III) a uma redução maciça no volume de incubação e; (Iv) uma gama dinâmica maior utilizando uma leitura fluorescente. Uma única lâmina pode ser calculada como sendo equivalente a 18x placas de 96 poços.
Com o protocolo seguinte, qualquer laboratório capaz de fabricar e análise manchada microarrays deve ser capaz de fabricar este formato de ELISA miniaturizado.
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Protocol
NOTA: Todos os passos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma.
1. Disposição Construção
- Glicanos Preparação e configuração da placa
- Prepare um estoque de tampão impressão. Em primeiro lugar fazer 500 ml de uma solução de estoque de 150 mM de fosfato de sódio dibásico. Também fazem 50 ml de uma solução de estoque de 150 mM de solução de fosfato de sódio monobásico. Num balão, utilizando uma barra de agitação magnética e um medidor de pH, lentamente titule a solução de fosfato de sódio dibásico com a solução monobásico até um pH de 8,5 seja alcançado. Adicionar Tween-20 a 0,005%.
- Prepare as amostras de glicano. Diluir PAA glicanos conjugados, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) são para ser diluída para 100 ug / ml em tampão de impressão. step1.1.1 monovalentes glicanos,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) para 100 uM em tampão de impressão a partir do passo 1.1.1. Finalmente, preparar as tinturas funcionalizado com amina, para usar como marcadores de grade / luzes de pouso. manchas de marcador corante são impressos em 1? M.
NOTA: Atto488-NHS corante é usado em nossas impressões. No entanto, qualquer corante funcionalizado com amina, legível pelo scanner de slides é apropriado para esta finalidade. - Transferir 10 uL de cada amostra de glicano para placas de microtitulação de 384 poços, utilizados para o robô de impressão. Armazene glicanos não utilizados em solução tampão de impressão a -20 ° C em tubos selados. Tansfer 10 uL do marcador de corante para a placa de impressão.
- Impressão
NOTA: Todos steps que a preocupação de tocar ou mover os slides devem ser feitas com luvas.- Coloque arrayer pins na cabeça de impressão de acordo com a configuração correta do layout. Para este layout usar um pin para imprimir todas as amostras e matrizes. Imprimir os glicanos em blocos de seis, saltando um recurso (uma característica é definida como único local de um determinado composto), de cada lado, de tal modo que os pontos de uma mesma amostra não são impressos exactamente ao lado do outro.
NOTA: O usuário final deve decidir a configuração. - Retirar as lâminas de sacos, caixas abertas, e remover quaisquer partículas de poeira ou pequenos pedaços de plástico que podem ser em suas superfícies por gás nitrogénio ultra-alta pureza em cada slide. Coloque o número desejado de slides, o lado revestido para cima, no palco arrayer.
- Programa do arrayer, usar os parâmetros de 27 pontos por visita para a placa de fonte, usando 3 "pré-spots" em lâminas revestidas com poli-L-lisina, para remover o excesso de líquido na ponta dos pinos de impressão
- Ligue MPU (Unidade de Alimentação Principal) e Unidade de Controle do Clima. O software de análise Tiling aberto no computador.
- Escolha um layout para a impressão. Selecione Opções → Ferramenta Pin para ser usado para imprimir a matriz 1 x 1 ferramenta de impressão - 1 único pino. Selecione a guia de destino → Matriz Ferramenta Definição → Print Pattern e adicione o pitch (ponto-a-ponto à distância), o número de linhas e colunas para acomodar as amostras a ser impresso, e o padrão de impressão das amostras (para essa matriz de 8 x 8 padrão de impressão é usado em 340 relvado mm para 7 amostras totais).
- Selecione Alvo → Layout de slide e programar a distância de bloco-a-bloco para permitir a impressão de cada matriz replicar para o modelo de slide de 48 poços (4 x 12). Selecione Fonte e adicione o número de captadores de origem (1 para cada amostra quando se usa um pin) (para esta cópia 7 captadores de origem será usado para acomodar 6 poços de amostra e um marcador de corante bem).
NOTA: O diálogo fonte deve ficar verde para mostrar que o númerodas visitas de origem coincide com as amostras a serem impressas no padrão de impressão. - Selecione Alvo → Adaptador de Placa e Layout de slides e ajustar o número de slides (5 slides são impressos em uma hora para esta cópia com 1 slide pré-manchas).
- Solte a bandeja clicando no botão T1 para ativar a bandeja e adicionar o número desejado de lâminas para a bandeja, prestando muita atenção aos locais de slide pré-spotting (azul) e lâminas "reais".
- Coloque lâminas de vidro lisos em todas as portas de vácuo restantes para bloquear a vácuo e clique em OK para ativar o vácuo. Verifique se todos os slides são mantidos no lugar e clique em OK para retornar a bandeja para a posição inicial.
- Coloque a chapa de impressão no suporte da placa e garantir a cremalheira está definido corretamente no lugar. Clique GO e permitir que o processo de impressão para continuar.
- Imprimir os restantes 24 pontos em repetições de 6 pontos por matriz (4 matrizes / visit Fonte).
- Carregar as placas de 384 poçosna impressora e começar a imprimir. Manter a humidade relativa, durante a impressão, em toda a impressão entre 55 e 65%. A impressora pára após a impressão 5 slides.
NOTA: Enquanto o microarray neste ensaio é impresso em um 8 x 8 padrão específico, os robôs impressão microarray diferentes exigirá equipamento de programação específica para atingir o layout desejado. Cabe ao usuário final para determinar o padrão mais adequado tendo em conta as especificações dos seus equipamentos.
- Coloque arrayer pins na cabeça de impressão de acordo com a configuração correta do layout. Para este layout usar um pin para imprimir todas as amostras e matrizes. Imprimir os glicanos em blocos de seis, saltando um recurso (uma característica é definida como único local de um determinado composto), de cada lado, de tal modo que os pontos de uma mesma amostra não são impressos exactamente ao lado do outro.
- Umidificação / Imobilização
NOTA: Uma vez que as lâminas de terminar a impressão, eles passam por uma etapa de imobilização temporária, também chamado de umidificação. Umidificação pós-impressão ajuda a homogeneizar o anexo amostra por re-molhar as manchas e garantir bloqueio completo.- Colocar as lâminas em uma câmara de humidade a 100% imediatamente após a impressão durante um período de 30 min. Construir a câmara de colocação por toalhas de papel molhado muito plana no fundo de um prato de vidro grande, colocando os diapositivosem algum tipo de rack, tal como um suporte de tubos de ensaio, de impressão voltada para cima, e selagem com filme plástico para prender a umidade.
- Número desliza com um / pen álcool resistentes a solventes marcação e armazenar em uma caixa de dessecação. Desidratar durante a noite.
- Numeração, bloqueio e armazenamento
- Prepara-se o tampão de bloqueio - etanolamina 50 mM em 50 mM de tampão de borato. Primeiro, dissolver o ácido bórico, em ddH2O, a uma concentração final de 50 mM num frasco contendo uma barra de agitação magnética. Agita-se a solução vigorosamente numa placa de agitação até todo o sólido se ter dissolvido. Enquanto agitação constante, adicionar a quantidade apropriada de etanolamina a partir de uma solução estoque de 16,54 H até atingir a concentração de 50 mM desejado. Adiciona-se hidróxido de sódio concentrado para ajustar para um pH final de 9,2.
- Mergulhar os slides impressos na solução tampão de bloqueio durante 1 h.
- Seguindo 1 hora, lavar as lâminas em ddH2O para remover qualquer vestígio de excesso de tampão de bloqueio.Descarte tampão de bloqueio em um recipiente adequado de lixo.
- Transferir as lâminas para suportes de vidro para coloração e spin seco. matrizes secas, colocando-os numa centrífuga equipada com suportes de placa oscilante, a uma velocidade de 10 xg durante 5 min.
- Uma vez que as lâminas são secas, elas podem ser incubadas imediatamente ou armazenado. condições de armazenamento: -20 ° C em um saco plástico selado.
2. Analisando glicano Proteínas de Ligação
- Preparar uma câmara umidificado em que as matrizes para ser hibridizado vai caber. Uma câmara simples consiste em um pirex, mergulhado no fundo com toalhas de papel umedecido e um rack, sobre a qual os slides vai descansar.
- Use lectinas biotiniladas SNA (Sambuca nigra aglutinina) e CEA (Erythrina aglutinina cristagalli) a 10 ug / ml + 2 ug / ml de estreptavidina-555 de corante, em sondagem de tampão (PBS + 0,01% Tween-20). Para HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 e A / KY / 07 H1N1, neste exemplo), o usouma concentração de partida de 20? g / ml pré-complexada, como previamente descrito 34. Resumidamente, fazer uma HA: Rato-α-Strep: mistura cabra-α-murganho Alexa647 em tampão de bloqueio (PBS + BSA a 3% + 0,01% de Tween-20), numa proporção de 4: molar de 1: 2.
NOTA: O array é sondado com lectinas para verificar que glicanos são imobilizados e detectável (Figura 1B). - Transferir a solução de proteína-anticorpo de ligação de glicano mistura de 20 ul de uma placa de 384 poços e incubar em gelo durante 30 min. Seriadamente diluídas amostras de lectina e HA 1: 1, na sua tampão apropriado, 8 vezes, por mistura de 10 ul de amostra com 10 ul de tampão.
- Pipeta 8 ul da amostra para a superfície de micro-poços e incubar na câmara de humidificação selada (100% de HR) durante 90 min.
- Lavam-se as lâminas de um de cada vez, mantendo as bordas e mergulhando-os quatro vezes em uma mistura de PBS e Tween a 0,05%, em seguida, quatro vezes em PBS, e, finalmente, quatro vezes em H 2 O. desionizada utilizaçãoo mesmo protocolo de secagem descrito no passo de bloqueio, as matrizes girar secar numa centrífuga durante 5 min a 10 x g.
3. Análises de digitalização e de dados
NOTA: Os microarrays de glicano podem ser digitalizados em configurações diferentes, dependendo do fabricante do scanner microarray. Ao variar a potência do laser e da resolução, o instrumento pode produzir uma imagem com tantos sinais quanto possível dentro de sua faixa dinâmica (Figura 1C).
- Use um scanner de slides fluorescente e digitalizar as matrizes imediatamente após a incubação com as proteínas de ligação de glicano. Tome cuidado para garantir a lâmina está correctamente inserida no instrumento de varredura.
- software de digitalização aberta. Clique em Iniciar para abrir o programa. Conectar-se a scanner: Scanner → Connect ou botão verde no menu do painel de navegação Scanner.
- porta autoloader aberta do scanner. Colocar as lâminas em ranhuras no carregador automático, a fim específico. Feche a porta carregador automático. Click "ler loader" no painel Ferramentas de navegação para detectar automaticamente os slides no scanner.
- Ajuste o parâmetro de verificação: parâmetros Scanner → digitalização apropriadas para o experimento (por exemplo, 635 potência do laser de alta, o ganho de detecção de 50%). Digitalizar slides: Scanner → digitalização. Selecione caminho, criando uma pasta para guardar as imagens de varredura e nome scans individuais. Faça isso antes da digitalização real. Repita para cada slide individual. Clique em OK para iniciar a digitalização.
- Use o software do scanner para configurar o instrumento e digitalizar os slides. Definir scanner para digitalizar de forma iterativa em baixa potência laser (5 mW) com o aumento ajustes de ganho de 25%, 50% e 75%.
NOTA: As configurações podem ser testadas e otimizadas, mas tenha em mente que cada varredura pode eventualmente diminuir a saída de fluorescência dos corantes devido à fotodegradação.- aquisição de dados aberto e software de análise, tais como software Mapix. Clique em Iniciar para abrir o programa. Abrir varredura imagem: Arquivo → im abertoidade. Abrir arquivo GAL: Analisar → grade aberta e selecione o arquivo GAL apropriado.
- Entre no modo de blocos: Modo de imagem → blocos para mover o grid. Use os marcadores de grade para definir a rede para o local apropriado no slide. Ajustar os blocos individuais conforme necessário para coincidir com a matriz impressa.
- Entre no modo de pontos: Imagem → Modo de pontos para ajustar localização eo tamanho de pontos individuais dentro do bloco. Uma vez que todos os blocos e os pontos são ajustados e no lugar, intensidades de sinal medida pelo Analisar cálculos fotométricos →. Salve o arquivo de saída.
- Uma vez que os slides a digitalização é concluída, as imagens são analisadas para sinais de ligação com o programa de processamento de imagem instalado (Figura 1D - G). Para análise de imagem, carregar um arquivo GAL (Lista Array) sobre a imagem TIFF digitalizada.
NOTA: O arquivo GAL contém o padrão de layout de local e as identidades de cada local local. arquivos GAL para matrizes são created pelo software da impressora usando um arquivo de texto delimitado por guia que contém a identidade das amostras e sua localização na placa de fonte de 384 poços. - Use a grade luzes marcador / desembarque impressas nas microarrays para colocar adequadamente a grade GAL. pontos individuais podem precisar de ser movido de forma individual, mas uma matriz bem impresso será geralmente permitir que os blocos dentro da grade para ser colocado com facilidade. Após a colocação do grid, recolher intensidades local pelo software e salva como um arquivo de texto delimitado por tabulação (.txt).
- Usando programa de planilha, abra o arquivo a partir do scanner de saída. Abra o arquivo de macro apropriado a partir da localização da pasta. Clique em Exibir → Macro → RunMacro.
NOTA: A pré-escrito irá copiar os dados de saída matérias, remover linhas e colunas desnecessárias, classificar os dados por amostra, calcular os valores médios média de fundo menos sinal e traçar os valores resultantes para uma planilha do spread-folha que contém os gráficos para cada dos seis SAMPles testado na matriz.
- Usando programa de planilha, abra o arquivo a partir do scanner de saída. Abra o arquivo de macro apropriado a partir da localização da pasta. Clique em Exibir → Macro → RunMacro.
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Representative Results
Impressão, digitalização e análise de dados
Para garantir a impressão correta, é vital ter o alinhamento correto da grade manchado dentro da máscara de teflon, que delineia cada matriz no slide. Durante a impressão, devido à natureza do revestimento de Teflon, as manchas não podem ser vistos a olho nu nas lâminas MPX. Dá-se atenção, em seguida, para o aparecimento dos pré-manchas sobre as lâminas de poli-L-lisina revestidos. Directamente após a impressão, cada lâmina deve ser visualmente inspeccionada para a presença de cada composto descoberto que é visível devido a sais do tampão secas no local. Arrays são inspecionados para o alinhamento correto de pontos dentro das fronteiras de teflon e número correto de recursos manchado.
Slides são digitalizados em um processo iterativo de menor para maior poder de digitalização para evitar Fotobranqueamento e permitindo a comparação de higsua avidez para diminuir proteínas de ligação de avidez, que têm sinais de saída superior e inferior, respectivamente. Após a digitalização, a intensidade de fluorescência de cada mancha nas imagens de saída são medidos usando um programa de imagem. Cada conjunto é coberto com um arquivo de grade que corresponde ao número de características impressas na superfície da matriz (Figura 1D - L). Utilizando corantes fluorescentes impressas, as fronteiras dos glicanos impressos são definidos e uma máscara que é integrado com a identidade da amostra impressa lassoes cada local. A máscara de imagem lasso irá gravar todos os aspectos do local com imagens (tamanho, intensidade de sinal, coordenadas na grade, etc.) e de saída essas informações para um arquivo de texto delimitado por tabulação. Usando o software de tabulação (planilha), as amostras são classificadas segundo a identidade e a intensidade do sinal média menos de fundo é em média por 4 dos 6 pontos para cada amostra, deixando de fora a maior ea menor sinal como discrepantes. Um gráfico de linhas de sinal média médiamenos fundo é representada graficamente contra as concentrações de proteína oito aplicados à matriz e contém uma linha para cada amostra. O gráfico de saída final é estabilizada utilizando um cálculo de regressão não-linear (Figura 1I).
Glicanos proteínas de ligação
O PAA-matriz é usada para avaliar a especificidade de ligação ao receptor de influenza A hemaglutininas do vírus. Uma característica adicional da nossa disposição, não presente no ensaio em placa análoga, é a inclusão de controlos não sialilados na mesma micro poços. Para avaliar os compostos impressos estão presentes após a impressão, planta utilizada lectinas com especificidade conhecida foram utilizados. Liga-se a CEA de galactose terminais ligados β1-4 a N-acetil-glucosamina (Galβ1-4GlcNAc ou LacNAc) e não se ligará se a galactose terminal é tapado com ácido siálico. ECA só detecta os glicanos não sialilados em nosso arr glicano miniaturizadoAy (Figura 2A). A falta de se ligar a qualquer uma das amostras de glicano sialilados é também indicativo de que estes estão completamente cobertas com ácido siálico terminal. Para α2-6 ácido siálico ligado, SNA foi utilizado como um controlo de lectina (Figura 2B). Como esperado, o SNA única liga-se a α2-6 ácidos siálicos com ligações, mas com diferenças notáveis na afinidade para repetições di-LacNAc não-ligado-PAA ligada com PAA. Esta diferença reflecte a sensibilidade de glicanos ligados em PAA e permite a discriminação de proteínas que se podem ligar com baixa avidez. Para α2-3 ácido siálico ligado, uma hemaglutinina H5 derivada de A / Vietname / 1203-1204 vírus que se sabe reconhecer apenas α2-3 ácidos siálicos com ligações foi usada 6. O perfil de ligação do H5 HA de facto mostra especificidade para α2-3 ácidos siálicos com ligações, com uma avidez maior para as estruturas de PAA-ligadas (Figura 2C). Finalmente, utilizou-se a hemaglutinina H1 a partir de uma estirpe H1N1 sazonal humana que, como esperado, únicaligado a α2-6 estruturas contendo ácido siálico ligados (Figura 2D).
Figura 1: A impressão, digitalização e análise de imagem (A) 6SLNLN PAA-conjugado é mostrado como uma estrutura de glicano representante que está impresso nas lâminas de vidro.. (B) a incubação de uma proteína de ligação de glicano na matriz de glicanos multi-poços é mostrado com um volume de 8 ul que cria uma gota sobre a superfície da matriz. (C) A seguir à incubação das proteínas de ligação de glicano no array e digitalização de um scanner de slides fluorescente confocal, uma imagem representativa é obtido. (D) A imagem é coberta com uma grade e, usando marcadores de grade para o alinhamento adequado, os pontos individuais podem ser analisados. (E) Um fim acima de um conjunto completo de 8 matrizes, em que uma única proteína de ligação glicanofoi analisada utilizando oito 1: 1 diluições. (F) Uma única matriz, num único poço é representado; a matriz é demarcada pelos marcadores de grade na parte superior direita (3 pontos) e inferior esquerda (2 pontos), essa proteína de ligação glicano se liga a um único composto na matriz como uma réplica de seis é claramente visível. (G) A grade é mostrado com lassos circundando pontos individuais específicas. (H) Imaging software calcula valores de sinal a partir do arquivo de imagem e gera um arquivo de dados delimitado por tabulação. (I) Os dados podem ser tabulados na planilha ou software stastical para criar um gráfico de saída representativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Saída de lectinas de plantas (ECA, SNA) e IAV hemagglutinins com diferentes especificidades (H5 de A / Vietnam / 1203/04, H1 de A / Kentucky / 07). (A) se liga a CEA LacNAc Galb1-4GlcNAc terminal ou especificamente e detecta a presença de compostos não sialilados, utilizados como controlos por hemaglutininas IAV. (B) SNA reconhece apenas glicanos contendo um ácido siálico α2-6 terminal. (C) A hemaglutinina recombinante do vírus H5N1 (A / / 1203-1204 Vietname) liga-se a estirpe α2-3 ácidos siálicos e fornece um perfil de ligação do receptor de tipo aviário. (D) A hemaglutinina recombinante de uma H1N1 sazonal humana (A / Kentucky / 07) apenas se liga a receptores do tipo humano. intensidade do sinal fluorescente foi medido para cada ponto, e intensidade média de menos significa fundo foi calculada usando o programa de planilha. Para cada glicano, a intensidade de sinal média é calculada a partir de 6 réplicas manchas. Os sinais de maior e menor das 6 repetições são removidos e a 4 réplicas restantestes são utilizados para calcular o sinal de média, o desvio padrão (DP), e medição do erro padrão (SEM). Os gráficos representam o fundo de menos de sinal média calculada a média para cada amostra e erro bares são o valor SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especificidade do receptor; No entanto, todos têm os seus inconvenientes, incluindo avidez única medição e não especificidade e vice-versa.
Aqui, descrevemos uma nova ferramenta miniaturizado com base no amplamente utilizado e aceite de ELISA, que utiliza fragmentos terminais ligados com PAA de glicanos mais complexas. Usando 4 lectinas bem definidas, 2 de planta e 2 do vírus influenza A origem do vírus, mostramos que mantemos especificidade e avidez relativa.
Quando eu calcular a quantidade de redução de produtos químicos e biologiCal usado por miniaturizar o ELISA em um chip matriz de glicanos, chegamos surpreendentemente grandes diferenças. Em primeiro lugar, os produtos biológicos; usamos 10x menor volume de ensaio e usar 6 compostos de teste em 6 repetições; Isto pode ser calculado para ser o equivalente de 36x linhas em placas de 96 poços. O resultado é que nós usamos 360X menos biológicos. As etapas críticas incluem a impressão adequada e o risco de fundos elevados utilizando agentes de ligação de glicano não purificados ou anticorpos de detecção pobres.
Os compostos utilizados no presente ensaio, embora ainda disponíveis, não são facilmente feitos por síntese quimio-enzimática. Usando a tecnologia de microarray-impressão, cada ponto é de apenas 2 nl, em comparação com 100 ul por poço de uma placa de microtitulação. Imprimindo um único slide contendo 48 poços e 6 compostos, em 6 repetições, que consomem cerca de 1.152 nl. O mesmo procedimento de revestimento em placas de 96 poços resultados no revestimento de um total de 1.842 poços com 100 ul de composto na mesma concentração. Portanto, a impressão tele composto em comparação com o ensaio de placa, nós atingimos uma redução marcante da 1,500x. Por conseguinte, no total, os agentes biológicos são reduzidas de 360 vezes e o consumo de glicano por 1500 vezes. Usando manipuladores de líquidos robóticos, prevemos que a maioria dos passos pode ser automatizada, permitindo o ensaio de todo ser usado como uma tela de alto rendimento.
Apesar de microarrays de impressão e análises de imagens subsequentes exigem máquinas e ferramentas especiais, estes instrumentos não são raros e estão presentes em muitas universidades e institutos. A impressão é direto e não requer alterações químicas. Portanto, acreditamos que, com esta quantidade mínima de compostos e técnica de impressão simples, este ensaio pode ser de aplicação mais geral. Uma vez que reduz o volume de incubação, os custos de anticorpos e produtos biológicos preciosas, esta técnica irá torná-lo viável para laboratórios com recursos limitados para avaliar a especificidade do IAV ou outras proteínas de ligação de glicanos com alta fidelidade, mantendo um custo mais baixos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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