Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

Published: May 29, 2016 doi: 10.3791/53847
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

Abstract

Вирус гриппа А (ИФО) гемагглютинины признают сиаловых кислот на поверхности клетки, как функциональные рецепторы, чтобы получить вход в клетки. Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV может пересечь видовой барьер для птицы, свиней, лошадей и людей. Вирусы птичьего признают сиаловой кислоты, прикрепленную к предпоследней галактозы с помощью α2-3 связи (рецепторы птичьего типа), тогда как человеческие вирусы предпочтительно распознавать сиаловой кислоты с α2-6 подъёмник (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы контролировать, если вирус птичьего адаптируются к рецепторам типа человека, могут быть использованы несколько способов. Glycan микрочипы с различными библиотеками синтетических sialosides все чаще используются для оценки специфичности рецептора. Тем не менее, этот метод не используется для измерения avidities. Измерение авидности обычно достигается путем оценки связывания серийно разведенной гемагглютинина вируса или к гликанов, адсорбированных в обычных полипропиленовых 96-луночных планшетах. В этом анализе гликаны с альфа2-3 или α2-6 сиаловых кислот, в сочетании с биотином и адсорбируют на стрептавидин пластин, или соединены с полиакриламид (ПАА), которые непосредственно адсорбироваться на пластике. Мы значительно миниатюрным этот анализ непосредственно печатание ПАА-сшитый sialosides и их не ПАА-сшитый коллегами на микро-а стеклах. Этот комплект, с 48 массивов на одном слайде, позволяет одновременно анализы 6 Гликан связывающих белков в 8 разведений, опрашивая 6 различных гликанов, в том числе двух не сиалилированных контроля. Это эквивалентно 18x 96-луночные планшеты в традиционном анализе на планшетах. Гликан формат массива уменьшается потребление соединений и биологических препаратов и тем самым значительно повышает эффективность.

Introduction

Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV способен пересечь видовой барьер для домашней птицы и млекопитающих, в том числе, человека. Птичий IAVS признают α2-3 связанных сиаловой кислоты (рецепторы птичьего типа), в то время как человеческие вирусы связывают α2-6 связанных сиаловой кислоты (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы иметь возможность эффективно копировать и передавать между людьми птичий IAV должно связываться с рецепторами человеческого типа 1.

IAVS разделены на основе серологических, характеризующей антигенность их гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гликопротеинами оболочки. HA связывается с сиаловой кислоты, в то время как NA является фермент , разрушающий рецепторы на другом конце вирусного жизненного цикла и расщепляет сиаловой кислоты 2. Все люди , заражающие вирусы, включая H1N1, H2N2 и H3N2, имеют птичьего происхождения 3. На протяжении двух последних десятилетий несколько птиц с человеческими кроссоверов произошли, с вирусом H5N1, H7N7, H7N9 и является наиболее известным; Хаувер, другие подтипы инфицировано более спорадически (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. К счастью, кажется , что ни один из этих вирусов не смогли полностью адаптироваться к человеческого типа α2-6-связанных рецепторов сиаловой кислоты 5-8. Адаптация птиц или других зоонозных вирусов для размещения репликации и передачи в человеческих хостов может оказать разрушительное воздействие на здоровье человека. Поэтому, прежде чем знание того, как эти вирусы эволюционируют связывать рецепторы человеческого типа поможет всемирное наблюдение за появления новых вирусов гриппа.

Определение предпочтений рецепторов впервые была выяснена с использованием эритроцитам различных видов и остается излюбленным среди исследователей анализ гриппа 9-12. Демонстрация того, что вирусы птичьего признают α2-3 сиаловой кислоты и человеческие вирусы α2-6 связанных сиаловой кислоты первоначально была основана на анализе с использованием гемагглютинации эритроцитов ферментативно сконструированных содержат каждый из Linkages 13,14. Хотя считывание гемагглютинации, стандартный тест для вирусологов, лежащие в основе гликановые структуры не определены, только концевую связь. Кроме того, ограниченная доступность из sialyltransferases, используемых для повторной sialylate клетки, ограничивают применение этого анализа 15-18. Впоследствии были введены другие методы определения предпочтений рецептора связывания с использованием сиалилированы гликанов структур , связанных с поли-акриламид (РАА) или поли-глутамата (ПГК) структур в анализах 19,20 плит на основе. Несколько вариантов возможны в покрытии либо гликанов или вирусы на микротитровальных пластин, каждая из которых приводит к получению устойчивой, надежной и очень чувствительного анализа ELISA , типа 21-23. В качестве альтернативы, биотин-связанные гликаны могут заменить PAA / АПГ и могут быть конъюгированы с покрытыми стрептавидином пластинами 2,24. Хотя некоторые специфические сыворотки могут потребоваться, ИФА являются стандартными и несколько гликанов связанных с РАА легко commerciallу и не коммерчески доступны (Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).

Glycan технологии микрочипов появились как неоценимый инструмент для определения специфичности рецептора, как и множество различных гликаны замечены, и связывание с широким спектром различных структур может быть оценена в пределах одного анализа 25-29. Связывание IAV к этим структурам обеспечивает лучшее понимание Гликан структур , которые IAV преимущественно распознает 30-33. Glycan микрочипы требуют небольших количеств объема образца для выполнения анализа связывания и использует только незначительное количество гликана на месте (2 NL). Тем не менее, эти массивы, как правило, используются только для оценки специфичности гликанам рецепторов. Анализ нескольких вирусов, или гемагглютинин белки, в нескольких диапазонах концентраций может быть непомерно высокой из-за количества требуемых слайдов. Кроме того, на сегодняшний день, никакого относительного анализа алчность не была разработана с использованием гликана арлучевые методы.

Чтобы объединить требование низкой пробы, обеспечиваемой гликанов методами микрочипов и чувствительности ПАА-связанных гликанов в анализах ELISA на основе, мы стремились разработать многоскважинных гликана массив, который позволил бы проводить анализ с высокой пропускной способностью с аналогичными или более высоким разрешением по сравнению к традиционному ИФА на основе анализа. Одновременно с этим мы хотели бы минимизировать количество биопрепаратов и репортер химических веществ, потребляемых. Конечным результатом является миниатюрной анализа алчность, специально разработанный для мониторинга Iav специфичности и в равной степени применимо для оценки других гликанов связывающих белков. Использование предметного стекла, разделенных на 48 микро-лунки с помощью маски тефлона, 6 различных гликаны замечены в 6 повторах на лунку. Платформа микрочипов дает те же самые тенденции в области связывания с рецептором видели в макроэкономическом формате ELISA с несколькими преимуществами. Они включают в себя (I) печать соединения в 6 повторах, с использованием минимального образца, по сравнению с покрытием из нескольких строк яна пластины, используя 100 мкл на лунку; (II), множество различных соединений анализировали одновременно в одной скважине, в том числе управления; (III) массивное уменьшение объема инкубации и; (IV) больший динамический диапазон с использованием флуоресцентного считывания. Один слайд может быть рассчитана как эквивалент 18x 96-луночные планшеты.

С помощью следующего протокола, любая лаборатория способна фабрикации и анализирующая пятнистый микрочипов должны быть в состоянии изготовить этот миниатюрный формат ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все стадии проводят при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Построение массива

  1. Glycan Подготовка и настройка Plate
    1. Подготовить запас печатного буфера. Во-первых сделать 500 мл 150 мМ исходного раствора двухосновного фосфата натрия. Также сделайте 50 мл 150 мМ исходного раствора одноосновной раствора фосфата натрия. В колбе, с помощью магнитной мешалки и рН-метр, медленно титровать двухосновных раствор фосфата натрия с одноосновной раствором до рН 8,5 не будет достигнута. Добавить Tween-20 до 0,005%.
    2. Подготовьте Гликан образцы. Развести РАА сопряженными гликаны, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-РАА) и 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (рис 1A )) должны быть разбавлены до 100 мкг / мл в буфере печати от step1.1.1. гликанах одновалентных,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) и 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (СН 2) 3 NH 2)) в 100 мкМ в буфере печатающего со стадии 1.1.1. И, наконец, подготовить Амин-функционализированный красители, чтобы использовать в качестве маркеров сетки / посадочные огни. Dye маркер пятна печатаются на 1 мкМ.
      Примечание: Atto488-НГС краситель используется в наших печатных изданий. Тем не менее, любой амин-функционализированные краситель, считываемые сканером слайдов подходит для этой цели.
    3. Перенесите 10 мкл каждого образца гликановой до 384-луночных планшетах, используемую для печатания робота. Храните неиспользованные гликаны в печатном буферном растворе при -20 ° С в закрытых трубах. Tansfer 10 мкл маркера красителя к печатной форме.
  2. печать
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все Steпс, что беспокойство касаясь или перемещение слайдов должно быть сделано в перчатках.
    1. Поместите arrayer штифты в печатающей головке в соответствии с правильной конфигурации макета. Для этого макета использовать один вывод для печати всех образцов и массивов. Печать гликанов в блоках по шесть, пропуская одну функцию (функция определяется как одно пятно определенного соединения), на каждой стороне, таким образом, что пятна одного и того же образца не печатаются точно рядом друг с другом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный пользователь должен решить конфигурацию.
    2. Удалить слайды из сумки, открытых коробках, и удалить любые частицы пыли или небольшие кусочки пластика, которые могут быть на их поверхностях путем продувки сверхвысокой чистоты газообразного азота на каждом слайде. Поместите необходимое количество слайдов, покрытую сторону вверх, на сцене arrayer.
    3. Программирование arrayer, используйте параметры 27 точек за одно посещение к исходной пластине, используя 3 "предварительно пятна" на поли-L-лизина горками с покрытием, для удаления избытка жидкости на кончике булавки печатных
      1. Включите MPU (основной блок питания) и блока управления климатом. Открытое программное обеспечение Черепица анализа на компьютере.
      2. Выберите макет для печати. Выберите Функции → Pin инструмент, который будет использоваться для печати массива 1 х 1 печать инструмент - 1 один вывод. Выберите вкладку Target → Инструмент массива Определение → Print Pattern и добавить поле (спот-на-месте расстояние), количество строк и столбцов для размещения образцов для печати, и образец печати образцов (для этого массива в 8 х 8 печать шаблона используется на поле 340 мкм в течение 7 полных образцов).
      3. Выберите Target → Slide Layout и программировать расстояние маршрутный разрешить печать каждой повторности массива в шаблоне слайд 48-а (4 х 12). Выбора источника сигнала и добавить количество исходных пикапов (1 для каждого образца при использовании 1 PIN) (для этого печать 7 исходных пикапов будут использоваться для размещения 6 образцов скважин и 1 маркерной краской лунку).
        Примечание: Диалог источник должен зеленеть, чтобы показать, что числопосещений источников соответствует образцы, которые будут напечатаны в шаблоне печати.
      4. Выберите Target → Переходная пластина и Разметка слайда и настроить количество слайдов (5 слайдов печатаются в то время для этой печати с 1 предварительно пятнистость слайде).
      5. Отпустите лоток, нажав на кнопку T1, чтобы активировать лоток и добавить нужное количество слайдов к лотку, обращая особое внимание на местах предварительного пятнистость слайд (синий) и "настоящие" слайды.
      6. Поместите простые стеклянные слайды на всех остальных вакуумных портов, чтобы блокировать вакуум и нажмите кнопку OK, чтобы активировать вакуум. Убедитесь, что все слайды удерживаются на месте и нажмите кнопку OK, чтобы вернуть лоток в исходное положение.
      7. Загрузите печатную пластину в держателе и убедитесь, что стойка правильно установлена ​​на месте. Нажмите GO и позволяют процесс печати, чтобы продолжить.
    4. Печать остальных 24 места в повторах 6 точек в массиве (4 массивы / источник посещения).
    5. Загрузите 384-луночные планшетыв принтер и приступить к печати. Поддержание относительной влажности, во время печати, на протяжении печати от 55 до 65%. Принтер останавливается после печати 5 слайдов.
      Примечание: В то время как микрочип в этом анализе напечатан в определенной схеме 8 х 8, различные печатные микрочипов роботов потребуется оборудование, предназначенное программирование для достижения желаемой компоновки. Это до конечного пользователя, чтобы определить наиболее подходящий шаблон заданной спецификации их оборудований.
  3. Увлажнение / иммобилизации
    Примечание: После того, как слайды завершения печати, они проходят временную стадию иммобилизации, называемый также увлажняющим. Увлажнение Послепечатное помогает гомогенизировать держателю образца путем повторного смачивания пятна и обеспечивает полную блокировку.
    1. Поместите слайды в камере влажности 100% сразу после печати, в течение 30 мин. Построить камеру, помещая очень влажные бумажные полотенца плоские в нижней части большого стеклянную посуду, помещая слайдына какую-то стойку, такой как пробирка стойки, лицевой стороной вверх, и уплотнения полиэтиленовой пленкой в ​​ловушку в влаги.
    2. Количество слайдов со спиртом / резистентной маркером и хранить растворителя в коробке усыхание. Усыхают в течение ночи.
  4. Нумерация, блокировка, и хранение
    1. Подготовьте блокирующий буфер - 50 мМ этаноламина в 50 мМ боратного буфера. Во- первых, растворить борную кислоту, в DDH 2 O до конечной концентрации 50 мМ в колбу , содержащую магнитную мешалку. Перемешать раствор энергично на перемешивающей пластине, пока все твердое вещество не растворится. В то время как постоянно помешивая, добавить соответствующее количество этаноламина от 16,54 M маточного раствора для достижения желаемой концентрации 50 мМ. Добавить концентрированный гидроксид натрия для доведения до конечного рН 9,2.
    2. Погружают распечатанные слайды в растворе блокирующего буфера в течение 1 ч.
    3. После 1 часа, промойте слайды в DDH 2 O , чтобы удалить все лишние следы блокирующего буфера.Утилизацию блокирующий буфер в соответствующем контейнере для отходов.
    4. Передача слайдов держателям окрашивания стекла и спина сухая. Сухие массивы, помещая их в центрифуге, снабженной держателями поворотной плиты, со скоростью 10 мкг в течение 5 мин.
    5. После того, как слайды сухие, они могут быть инкубированы немедленно или хранить. Условия хранения -20 ° C в герметичном полиэтиленовом пакете.

2. Анализ Glycan связывающие белки

  1. Подготовьте увлажненной камеру, в которой массивы, которые будут гибридизовался будет соответствовать. Простая камера состоит из тарелки Pyrex, слоистые на дне с влажными бумажными полотенцами и стойку, на которой слайды будут отдыхать.
  2. С помощью биотинилированных лектинов СНС (Самбука нигра агглютининов) и ЕСА (Erythrina cristagalli агглютининов) в количестве 10 мкг / мл + 2 мкг / мл стрептавидина-555 красителя, при зондировании буфере (PBS + 0,01% твина-20). Для HA (A / Vietnam / 1203/04 и H5N1 A / KY / 07 H1N1, в данном примере), используйтеначальная концентрация 20 мкг / мл предварительно образует комплекс, как описано выше 34. Если коротко, то сделать HA: мышь-альфа-Strep: Козы-α-мышь-Alexa647 смесь в блокирующем буфере (PBS + 3% БСА + 0,01% твина-20), в 4: мольном соотношении 1: 2.
    Примечание: Массив зондируют лектинов , чтобы удостовериться в том , что гликаны обездвижены и обнаруживаемым (Фигура 1В).
  3. Передача Гликан связывающий белок-антитело раствор смеси 20 мкл до 384-луночного планшета и инкубировать на льду в течение 30 мин. Серийно разбавить лектин и образцы HA 1: 1, в их соответствующем буфере, в 8 раз, путем смешивания 10 мкл образца с 10 мкл буфера.
  4. Пипетка 8 мкл образца на поверхности микро- и инкубировать в запечатанный увлажнением (100% относительной влажности) камере в течение 90 мин.
  5. Вымойте слайды по одному за раз, держа ее за края и опуская их четыре раза в смеси PBS и 0,05% Tween, затем четыре раза в PBS, и , наконец четыре раза в деионизированной H 2 O. С помощьютот же протокол сушки описано в стадии блокирования спина массивы сохнуть в центрифуге в течение 5 мин при 10 х г.

3. Сканирование и анализ данных

Примечание: Гликан микрочипы могут быть отсканированы в различных условиях, в зависимости от производителя микрочипов сканера. Варьируя мощность и разрешение лазера, прибор может произвести изображение с таким количеством сигналов , как это возможно в пределах его динамического диапазона (рис 1C).

  1. С помощью флуоресцентного сканера слайдов и сканировать массивы сразу после инкубации с Гликан связывающими белками. Позаботьтесь, чтобы обеспечить слайд правильно вставлен в сканирующем приборе.
    1. Открытое программное обеспечение для сканирования. Нажмите кнопку Пуск, чтобы открыть программу. Подключение к сканеру: Сканер → Connect или зеленую кнопку в меню навигации панели сканера.
    2. Открыть дверь автозагрузчик сканера. Поместите слайды в пазы в автозагрузчика в определенном порядке. Закрыть автозагрузчик дверь. ClИк "чтения загрузчика" в Инструменты навигационной панели для автоматического обнаружения слайдов в сканере.
    3. Настройка параметров сканирования: Параметры сканирования Сканер → подходящие для эксперимента (например , 635 мощности лазера высокой, коэффициент усиления обнаружения 50%). Сканирование слайдов: Сканер → сканирования. Выберите путь, создав папку для сохранения изображений, сканирования и имен отдельных сканирования. Делайте это до фактического сканирования. Повторите эти действия для каждого отдельного слайда. Нажмите кнопку OK, чтобы начать сканирование.
  2. С помощью программного обеспечения сканера для настройки прибора и сканирования слайдов. Установите сканер для итерационного сканирования при малой мощности лазера (5 мВт) с увеличением установок усиления на 25%, 50% и 75%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установки могут быть протестированы и оптимизированы, но имейте в виду, что каждый сканирование может возможно понизить выход флуоресценции красителей из-за фотообесцвечивания.
    1. Открытый сбор данных и анализ программного обеспечения, такие как программное обеспечение Mapix. Нажмите кнопку Пуск, чтобы открыть программу. Открыть сканирование изображения: Файл → Открыть имвозраст. Открыть файл GAL: Анализировать → Открыть сетку и выберите соответствующий файл GAL.
    2. Войдите в режим блоков: режим изображения → блоки для перемещения сетки. С помощью маркеров сетки для установки сетки в нужное место на слайде. Настройка отдельных блоков по мере необходимости, чтобы соответствовать напечатанную массив.
    3. Вход в режим пятна: Image → режим пятна, чтобы отрегулировать положение и размер отдельных пятен в пределах блока. После того, как все блоки и пятна корректируются и на месте, интенсивность сигнала измеряют с помощью Анализировать → фотометрические расчеты. Сохраните файл вывода.
  3. После того , как слайды завершения сканирования, изображения анализируются для связывания сигналов с программой обработки изображений , установленной (Рисунок 1D - G). Для анализа изображений, загрузите файл GAL (Array List) над отсканированного TIFF изображения.
    Примечание: Файл GAL содержит как шаблон разметки пятна и идентичности каждого местоположения пятна. Файлы GAL для массивов крeated программным обеспечением принтера, используя табуляцией текстовый файл, содержащий идентификационные данные образцов и их расположение в исходной пластине 384-а.
  4. Использование сетки маркер / посадочные огни, напечатанные на микрочипы, чтобы правильно разместить GAL сетку. Отдельные пятна, возможно, должны быть перемещены по отдельности, но хорошо напечатанный массив, как правило, позволяют блоки внутри сетки, чтобы разместить с легкостью. После размещения сетки, собирать пятна интенсивности с помощью программного обеспечения и сохранить как табуляцией текстовый файл (.txt).
    1. Используя программу работы с электронными таблицами, открыть выходной файл со сканера. Откройте соответствующий файл макроса из папке. Нажмите View → Макро → RunMacro.
      Примечание: Предварительно написано будет копировать необработанные выходные данные, удалить ненужные строки и столбцы, сортировать данные по выборке, вычислить средние средние фоновые значения минус сигнала и построить результирующие значения к расширенным листа листа, содержащего графики для каждого из шести SAMPле протестирована на массиве.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Печать, сканирование и анализ данных

Для обеспечения правильной печати, жизненно важно иметь правильное выравнивание пятнистой сетки внутри маски тефлоном, который очерчивает каждый массив на слайде. Во время печати из-за характера тефлоновым покрытием, пятна не видны невооруженным глазом на MPX слайдами. Обращается внимание то к появлению предварительных пятен на слайдах поли-L-лизин покрытием. Непосредственно после того, как печать, каждый слайд должен быть проверен глазом на наличие каждого пятнистый соединения, который виден из-за солей этого буфера сушат на месте. Массивы проверены на предмет правильного выравнивания пятен в пределах границ тефлоновых и правильное количество пятнистых функций.

Слайды сканируются в итерационном процессе низкой к более высокой мощности сканирования, чтобы избежать отбеливания фотографий и позволяет сравнение HIGее алчность, чтобы понизить авидности связывающие белки, которые имеют более высокие и более низкие выходные сигналы, соответственно. После сканирования, интенсивность флуоресценции каждого пятна в выходных изображений измеряются с помощью программы обработки изображений. Каждый массив перекрыты с файлом сетки, совпадающему с числом функций , напечатанных на поверхности массива (рис 1D - G). Использование печатных флуоресцентных красителей, в границах напечатанных гликанам определены и маска, которая интегрирована с идентичностью печатного образца арканах каждое пятно. Маска изображения лассо будет записывать все аспекты изображаемой пятна (размер, интенсивность сигнала, координаты в сетке и т.д.) и вывести эту информацию в табуляцией текстовый файл. С помощью составления таблиц программного обеспечения (электронные таблицы), образцы сортируются по идентичности и среднее значение интенсивности сигнала минус фон усредняется по 4 из 6 мест для каждого образца, в результате чего из самый высокий и самый низкий сигнал как недопустимое. Линия график среднего среднего сигналаминус фон представлен в зависимости от восьми концентраций белка, применяемых в массив и содержит одну строку для каждого образца. Окончательный выходной график сглаживается , используя вычисление нелинейной регрессии (рис 1I).

Glycan связывающие белки

РАА-массив используется для оценки рецептора специфичность связывания вируса гриппа А агглютинины. Дополнительной особенностью нашего массива, не присутствует в анализе аналогичной пластины, является включение не-сиалилированных управления в том же микро-хорошо. Для того, чтобы оценить, что печатные соединения присутствуют после печати, обычно используется растение лектинов с использовались известной спецификой. ЕСА связывается с терминальной галактозы связана β1-4 с N-ацетил-глюкозамина (Galβ1-4GlcNAc или LacNAc) и не будет связываться, если терминал галактоза ограничен с сиаловой кислотой. ECA только обнаруживает не-сиалилированы гликаны на нашем миниатюрном гликановой обрAY (фиг.2А). Отсутствие привязки к какой-либо из сиалилированных гликанов образцов также указывает, что они полностью закрывали концевой сиаловой кислотой. Для α2-6 связанной сиаловой кислоты, СНС, использовали в качестве контроля лектина (Фигура 2В). Как и следовало ожидать, СНС только связывается с α2-6 связанных сиаловых кислот, но с заметными различиями в сродством к ПАА-сшитый не-ПАА-сшитый ди-LacNAc повторами. Это различие отражает чувствительность ПАА-сшитый гликанах и позволяет дискриминацию белков, которые могут связываться с низкой авидности. Для α2-3 связанной сиаловой кислоты, H5 гемагглютинина , полученного из A / Vietnam / 1203/04 вируса , который , как известно , распознавать α2-3 связанных сиаловой кислоты только использовали 6. Связывание профиль H5 HA действительно показывает специфичность в отношении α2-3 связанных сиаловых кислот, с более высокой авидности для РАА-связанных структур (рис 2С). И, наконец, использовали H1 гемагглютинин сезонного штамма H1N1 человека, который, как и ожидалось, толькосвязан с α2-6 связанных сиаловой кислоты , содержащие структуры (рис 2D).

Рисунок 1
Рисунок 1: печать, сканирование и анализ изображения (A) РАА-конъюгированного 6SLNLN показан в качестве репрезентативного гликановой структуры, которая печатается на стеклах.. (B) инкубирование гликана связывающий белок на многоскважинных гликановой массива показан с объемом 8 мкл , который создает капельку на поверхности массива. (C) После инкубации Гликан связывания белков на матрице и сканирования в конфокальной флуоресцентной сканер слайдов, представитель получается изображение. (D) Изображение перекрыты с сеткой и, с помощью маркеров сетки для правильного выравнивания, единичные пятна могут быть проанализированы. (E) крупным планом полного набора 8 массивов, в которых один Гликан связывающий белоканализировали с использованием восьми 1: 1 разбавление. (F) единый массив, в одной скважине представлена; массив демаркированы маркерами сетки в верхнем правом углу (3 точки) и левом нижнем углу (2 места), этот Гликан связывающий белок связывает одно соединение на массиве в виде повторности из шести отчетливо видна. (G) Сетка показывается с лассо , опоясывающих конкретные отдельные пятна. (H) обработки изображений программное обеспечение вычисляет значения сигнала из файла изображения и выводит файл с разделителями табуляции данных. (I) Данные могут быть сведены в таблицу или stastical программное обеспечение для создания репрезентативной выходной график. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Производство растительных лектинов (ЭКА, СНС) и IAV гемаgglutinins с различной специфичностью (H5 от вируса A / Vietnam / 1203/04, H1 от A / Kentucky / 07). (A) ECA связывает терминала LacNAc или Galb1-4GlcNAc конкретно и обнаруживает присутствие не-сиалилированных соединений, используемых в качестве контроля для Iav агглютинины. (В) СНС признает только гликаны подшипник терминала α2-6 сиаловой кислоты. (С) Рекомбинантный гемагглютинина вируса H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) штамм связывается с α2-3 сиаловых кислот и обеспечивает птичьего связывания рецептора типа профиля. (D) Рекомбинантный гемагглютинина человеческого сезонного гриппа H1N1 (A / Kentucky / 07) связывается с рецепторами только человеческого типа. Интенсивность флуоресцентного сигнала измеряли для каждого пятна и средней интенсивности минус среднее фона была рассчитана с использованием программы работы с электронными таблицами. Для каждого гликана, средняя интенсивность сигнала вычисляется из 6 размножается пятен. Самые высокие и самые низкие сигналы 6 повторах удаляются, а оставшиеся 4 репликиTES используются для вычисления среднего сигнала, стандартное отклонение (SD), и стандартная ошибка измерения (СЭМ). Графики представляют собой усредненные значения минус сигнала фона для каждого образца и ошибок баров значение SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оценка специфичности рецептора Iav является важным шагом в анализе потенциал пандемии птичьего вирусов. Признание сиаловой кислоты с помощью вируса связан с несколькими биологическими свойствами, такими, как связывания и высвобождения из клетки. Знание того, какие аминокислотные мутации необходимы для вирусов птичьего для достижения α2-6 связывания и пересекают видовой барьер позволяет готовности к пандемии. Несколько анализов используются для определения специфичности рецептора; Тем не менее, все они имеют свои недостатки, в том числе только измерения авидности , а не специфичности и наоборот.

Здесь мы опишем инструмент новый миниатюризации, основанный на широко используемом и принятом ELISA, который использует ПАА-сшитый концевые фрагменты более сложных гликанов. Используя 4 хорошо определенные лектины, 2 завода и 2 вируса гриппа А происхождения, мы показываем, что мы поддерживаем специфичность и относительную алчность.

При расчете количества сокращения химических веществ и BIOLOGскую используемый миниатюризации ELISA на гликановой в чипе массива, мы достигаем поразительно большие различия. Во-первых, биопрепараты; мы используем 10x меньший объем анализа и использовать 6 тестовых соединений в 6 повторах; это можно рассчитать, чтобы быть эквивалентом 36х строк в 96-луночные планшеты. Результатом является то, что мы используем 360x меньше биопрепаратов. Критические шаги включают в себя правильную печать и риск высоких слоев с использованием неочищенных гликанов связывающих агентов или беден выявления антител.

Соединения, используемые в данном анализе, хотя все еще доступны, не легко сделать с помощью химио-ферментативный синтез. С помощью технологии микрочипов печати, каждое пятно только 2 NL, по сравнению с 100 мкл на лунку планшета для микротитрования. Печать одного слайда, содержащего 48 лунок и 6 соединений, в 6 повторах, мы потребляем около 1152 NL. Та же процедура нанесения покрытия в 96-луночных планшетах приводит покрытие в общей сложности 1,842 скважин с помощью 100 мкл соединения в той же концентрации. Таким образом, печать тон соединении по сравнению с анализе на планшетах, мы достигаем поразительное снижение 1,500x. Таким образом, в общей сложности, биопрепараты сокращаются 360 раз, а потребление гликана 1500 раз. С помощью роботизированной жидких обработчиков, мы предполагаем, что большинство шагов может быть автоматизирован, что позволяет весь анализ можно использовать в качестве экрана с высокой пропускной способностью.

Хотя печать микрочипы и последующий анализ изображений требуют специальных механизмов и инструментов, эти инструменты не редки и присутствуют во многих университетах и ​​институтах. Печать является прямым и не требует химических изменений. Поэтому мы считаем, что, с этим минимальным количеством соединений и простого способа печати, этот анализ может быть в более общем смысле применимо. Как уменьшить объем инкубации, стоимость антител и драгоценных биопрепаратов, этот метод сделает возможным для лабораторий с ограниченными ресурсами для оценки специфичности IAV или других гликанов связывающими белками с высокой точностью, сохраняя при этом более низкую стоимостьs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана частично Scripps Microarray Основной фонд, и контракт от Центров по контролю и профилактике заболеваний (JCP). RPdV является получателем гранта Rubicon и Veni от Нидерландской организации научных исследований (NWO). Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) финансируется за счет гранта NIGMS GM62116 (JCP) представила несколько гликаны, используемых в данном исследовании. Это публикация 29113 из Скриппса научно-исследовательского института.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEXTERION® Slide H MPX-48  Schott 1091525 Microwell slides
ProScanArray Plus  PerkinElmer discontinued confocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software Innopsys - confocal microarray scanner
MicroGrid II  Digilab - microaray printer
SNA Vector Labs B-1305  Plant Lectin
ECA Vector Labs B-1145  Plant Lectin
Anti-Strep Antibody IBA 2-1509-001  Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647 Life A-21235 Anitbody for HA binding
Tween-20 Sigma P2287  detergent
di-basic Sodium Phosphate Sigma 255793 printing buffer component
mono-basic Sodium phosphate Sigma 229903  printing buffer component
poly-l-lysine solution Sigma P8920  pre-spotting slide component
sodium hydroxide Sigma 221465 pre-spotting slide component
ethanol Sigma 493546 pre-spotting slide component
phosphate buffered saline Corning 46-013-CM incubation/washing buffer
SMP4B pins Telechem SMP4B printing pin
Compressed Nitrogen (Grade5) Praxair UN1066 general dusting/drying tool
Boric Acid Sigma B6768-500G Slide blocking reagent
ethanolamine Sigma E9508-500ML Slide blocking reagent
Atto 488 AttoTec AD 488-91 Gridmarker on array
PAA-LNLN Consortium for Functional Glycomics PA368 Spotted glycans
PAA-3SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA362 Spotted glycans
PAA-6SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA343 Spotted glycans
LNLN Consortium for Functional Glycomics Te98 Spotted glycans
3SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te175 Spotted glycans
6SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te176 Spotted glycans
384-well microtiter plate Matrix TechCorp 4361 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-150 Slide Numbering
Wheaton slide staining dish Sigma Z103969-1EA Blocking and Drying

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
  3. Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).
  4. Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
  5. Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
  6. Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
  7. Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
  8. Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
  9. Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
  10. Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
  11. Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
  12. Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
  13. Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
  14. Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
  15. Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
  16. Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
  17. Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
  18. Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
  19. Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
  20. Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
  21. Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
  22. Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
  23. Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
  24. Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
  25. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  26. Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
  27. Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
  28. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  29. Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
  30. Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
  31. Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
  32. de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
  33. Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
  34. de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).

Tags

Immunology выпуск 111 Glycan-массив сиаловой кислоты поли-акриламид (РАА) гриппа гемагглютинин лектин галактоза LacNAc
Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McBride, R., Paulson, J. C., de… More

McBride, R., Paulson, J. C., de Vries, R. P. A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111), e53847, doi:10.3791/53847 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter