Abstract
Influenza A virus (IAV) hemagglutinine herkennen siaalzuren op het celoppervlak als functionele receptoren invoer in cellen te krijgen. Wilde watervogels zijn de natuurlijke reservoir voor IAV, maar IAV kan de soort barrière voor pluimvee, varkens, paarden en mensen te steken. Aviaire virussen herkennen siaalzuur door een α2-3 koppeling (aviaire-type receptoren) om een voorlaatste galactose bevestigd terwijl menselijke virussen bij voorkeur siaalzuur met een α2-6 koppeling (human-type-receptoren) te herkennen. Om te controleren of aviaire virussen zich aanpassen aan de menselijke soort receptoren, kan op verschillende manieren worden gebruikt. Glycan microarrays met diverse bibliotheken van synthetische sialosides worden steeds meer gebruikt om receptorspecificiteit te evalueren. Echter is deze techniek niet gebruikt voor het meten aviditeiten. Meting van de aviditeit wordt gewoonlijk bereikt door het evalueren van de binding van serieel verdunde virus hemagglutinine of glycanen geadsorbeerd conventionele polypropyleen 96-well platen. In deze assay glycanen met α2-3 of α2-6 siaalzuren gekoppeld aan biotine en streptavidine geadsorbeerd aan platen of gekoppeld zijn met polyacrylamide (PAA) die direct adsorberen aan de kunststof. We hebben aanzienlijk verkleind deze test door direct printen-PAA verbonden sialosides en hun niet-PAA gebonden tegenhangers micro-putjes objectglaasjes. Deze set-up, met 48 arrays op een enkele dia, maakt gelijktijdige analyses van 6 glycan bindende eiwitten op 8 verdunningen, ondervragen 6 verschillende glycanen, waaronder twee niet-gesialyleerde controles. Dit is gelijk aan 18x 96-well platen in de traditionele assay plaat. De glycan array-formaat vermindert consumptie van verbindingen en biologische en dus verbetert de efficiëntie.
Introduction
Wilde vogels zijn de natuurlijke reservoir voor iav, maar IAV kan de soort barrière voor gevogelte en zoogdieren, waaronder de mens. Avian IAVS herkennen α2-3 gekoppelde siaalzuren (aviaire-type receptoren), terwijl menselijke virussen binden α2-6 gekoppelde siaalzuren (human-type-receptoren). In staat zijn om efficiënt te repliceren en te verzenden tussen mensen een aviaire IAV moet binden aan menselijke-type receptoren 1.
IAVS verdeeld gebaseerd op serologische dat de antigeniciteit van het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) envelopglycoproteïnen karakteriseert. HA bindt aan siaalzuren, terwijl de NA-receptorvernietigend enzym aan het andere uiteinde van de virale levenscyclus en splijt siaalzuur 2. Alle menselijke infecterende virussen, waaronder H1N1, H2N2 en H3N2, hebben een aviaire oorsprong 3. In de afgelopen twee decennia een aantal vogels aan menselijke crossovers hebben voorgedaan, met H5N1, H7N7 en H7N9 zijnde de meest bekende; however, hebben andere subtypen meer sporadisch besmette mensen (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Gelukkig lijkt het erop dat geen van deze virussen volledig kunnen aanpassen aan humane type-α2-6 gekoppeld siaalzuur receptoren 5-8 zijn. Aanpassing van aviaire of andere zoönotische virussen replicatie en transmissie in menselijke gastheren tegemoet kan een verwoestende uitwerking op de menselijke gezondheid. Daarom voorafgaande kennis van hoe deze virussen evolueren tot mens-type receptoren binden zal wereldwijd de bewaking van opduikende influenzavirussen helpen.
Bepaling van de receptor voorkeur werd voor het eerst opgehelderd met behulp van erytrocyten van verschillende soorten en blijft een favoriete test onder griep onderzoekers 9-12. De demonstratie dat vogelvirussen herkennen α2-3 siaalzuur en menselijke virussen α2-6 gekoppeld siaalzuur werd oorspronkelijk gebaseerd op een analyse met gebruik hemagglutinatie van erytrocyten enzymatisch ontworpen om elk van de li bevattennkages 13,14. Hoewel de uitlezing hemagglutinatie, een standaard test voor virologen, zijn de onderliggende glycan structuren niet bepaald, alleen de terminal koppeling. Bovendien, de beperkte beschikbaarheid van de sialyltransferasen, die opnieuw sialylate de cellen is het gebruik van deze test 15-18 beperkt. Vervolgens, indien andere methoden voor-receptor-bindende voorkeuren werden geïntroduceerd met behulp van gesialyleerde glycan structuren gekoppeld aan poly-acrylamide (PAA) of poly-glutamaat (PGA) structuren in-plaat gebaseerde testen 19,20. Verscheidene variaties zijn mogelijk in het bekleden hetzij de glycanen of virussen microtiterplaten, die elk resulteert in een robuuste, betrouwbare en gevoelige ELISA-type assay 21-23. Als alternatief kan biotine-gekoppelde glycanen vervangen PAA / PGA en kan worden geconjugeerd aan streptavidine-beklede platen 2,24. Hoewel een aantal specifieke sera kan worden verlangd, ELISA's zijn standaard en verschillende glycanen gekoppeld aan PAA worden gemakkelijk commercially en niet-commercieel verkrijgbaar (Consortium voor Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan microarray technologie naar voren zijn gekomen als een waardevol instrument om receptor specificiteit te bepalen, als meerdere verschillende glycanen worden gespot, en de binding aan een breed scala van verschillende structuren kan binnen één assay 25-29 worden beoordeeld. De binding van IAV deze structuren een beter begrip van de glycan structuren die IAV herkent bij voorkeur 30-33. Glycan microarrays vereisen kleine hoeveelheden van het monster volume tot een bindende analyse uit te voeren en gebruikt slechts minieme hoeveelheden van glycan per spot (2 nl). Echter, deze arrays typisch alleen gebruikt om de specificiteit van glycanen receptoren geëvalueerd. Analyse van meerdere virussen of hemagglutinine proteïnen, op meerdere concentratiebereik kan worden onbetaalbaar door het aantal dia's vereist. Bovendien tot op heden geen relatieve aviditeit assay is ontwikkeld volgens glycan array-technieken.
De lage vereiste monster verschaft door glycan microarray technieken en de gevoeligheid van PAA gekoppelde glycanen in ELISA-gebaseerde testen te combineren, zochten wij een multiwell-glycan array die zou zorgen voor een hoge-doorvoer analyse met gelijke of betere -oplossing vergeleken de traditionele ELISA gebaseerde bepaling. Tegelijkertijd wilden we het bedrag van biologicals en reporter chemicaliën verbruikt een minimum te beperken. Het uiteindelijke resultaat is een geminiaturiseerde aviditeit test specifiek ontwikkeld om toezicht IAV specificiteit en is eveneens toepasbaar op andere glycan bindende eiwitten bepalen. Gebruik een glasplaatje gescheiden in 48 microputjes door een Teflon masker, worden 6 verschillende glycanen gespot in 6 replicaten per putje. De microarray platform biedt dezelfde trends in receptorbinding gezien in de macro ELISA formaat met een aantal voordelen. Deze omvatten (I) drukken van verbinding 6 replicaten, met minimale monster versus het bekleden van meerdere rijen ina plaat, met behulp van 100 pl per putje; (II) meerdere verschillende verbindingen geanalyseerd gelijktijdig in één goed, met inbegrip van controles; (III) een enorme afname incubatievolume en; (IV) een groter dynamisch bereik met een fluorescente uitlezing. Eén dia kan worden berekend gelijk aan 18x 96-well platen zijn.
Het volgende protocol, elk laboratorium kunnen fabriceren en analyseren bevlekte microarrays moeten kunnen deze geminiaturiseerde ELISA format vervaardigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
1. Array Construction
- Glycan Voorbereiding en Plate Setup
- Bereid een voorraad van de boekdrukkunst buffer. Maak eerst 500 ml van een 150 mM voorraadoplossing van dibasisch natriumfosfaat. Zorg er ook 50 ml van een 150 mM voorraadoplossing monobasisch natriumfosfaat oplossing. In een kolf met een magnetische roerstaaf en pH meter langzaam Titreer dibasisch natriumfosfaat oplossing met de monobasische oplossing tot een pH van 8,5 wordt bereikt. Add Tween-20-0,005%.
- Bereid de glycan monsters. Verdunde PAA geconjugeerde glycanen, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) en 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figuur 1A )) moeten worden verdund tot 100 ug / ml in buffer afdrukken van step1.1.1. eenwaardige glycanen,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH2) 3 NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2) en 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2)) tot 100 uM in buffer afdrukken uit stap 1.1.1. Ten slotte is de voorbereiding van de amine-gefunctionaliseerde kleurstoffen, te gebruiken als grid markers / landingslichten. Dye marker vlekken zijn gedrukt bij 1 uM.
OPMERKING: Atto488-NHS kleurstof wordt gebruikt in onze prints. Echter, elke amine gefunctionaliseerde kleurstof, leesbaar door de dia scanner is geschikt voor dit doel. - Breng 10 pl van elk monster glycan 384-well microtiterplaten, gebruikt voor het drukken robot. Bewaar ongebruikte glycanen in printing bufferoplossing bij -20 ° C in afgesloten buizen. Tansfer 10 ul van de kleurstof marker op de drukplaat.
- het drukken
LET OP: Alle steps die betrekking hebben op het aanraken of verplaatsen van de dia's moet gebeuren met handschoenen.- Plaats array-pennen in de printkop volgens de juiste configuratie van de layout. Voor deze lay-out te gebruiken een pin om alle monsters en arrays te drukken. Print de glycanen in blokken van zes, overslaan een kenmerk (een functie wordt gedefinieerd als enkele vlek van een bepaalde verbinding) aan beide zijden, zodat vlekken van hetzelfde monster niet precies worden afgedrukt naast elkaar.
NB: De eindgebruiker moet de configuratie beslissen. - Verwijder dia's uit tassen, open dozen, en verwijder alle stofdeeltjes of kleine stukjes plastic dat zou kunnen zijn op hun oppervlak door te blazen ultra-hoge zuiverheidsgraad stikstofgas op elke dia. Plaats het gewenste aantal dia's, gecoate kant naar boven, op de Arrayer podium.
- Programmeer de array-Gebruik de parameters van 27 spots per bezoek aan de bronplaat, middels 3 "pre-spots" op met poly-L-lysine beklede objectglaasjes, om overtollige vloeistof te verwijderen aan het uiteinde van de gedrukte pennen
- Schakel de MPU (Main Power Unit) en Climate Control Unit. Open betegelen Analysis-software op de computer.
- Selecteer de lay-out van de afdruk. Kiest u Opties → Pin Tool moet worden gebruikt voor het afdrukken van de array 1 x 1 druk gereedschap - 1 enkele pin. Selecteer het tabblad Doel → Tool Array Definition → Patroon van de Druk en voeg het veld (spot-to-spot afstand), het aantal rijen en kolommen om de monsters tegemoet af te drukken, en de drukpatroon van de monsters (voor deze serie een 8 x 8 drukpatroon wordt gebruikt bij 340 micrometer plaats voor 7 totaal samples).
- Doel selecteren → dia-indeling en het programma van de blok-voor-blok afstand om het afdrukken van elk repliceren reeks toe in de 48-well (4 x 12) diasjabloon. Selecteer Bron en voeg het aantal bron pickups (1 van elk monster bij gebruik pin 1) (voor deze druk 7 bron pickups wordt gebruikt om 6 monsterputjes en 1 kleurstof marker goed geschikt).
NB: De bron dialoog moet GREEN wenden om te laten zien dat het aantalvan de bron bezoeken overeenkomt met de monsters af te drukken in het drukpatroon. - Doel selecteren → Adapter Plate en dia-indeling en pas de schuif nummer (5 dia's worden afgedrukt op een tijdstip voor deze druk met 1-pre spotten glijbaan).
- Laat de lade door te klikken op de T1-knop om de lade te activeren en voeg het gewenste aantal dia's om de lade, met veel aandacht voor de locaties van de pre-spotting slide (blauw) en "echte" dia's.
- Plaats gewoon glas dia's op alle resterende vacuüm poorten om het vacuüm te blokkeren en klik op OK om het vacuüm te activeren. Controleer of alle dia's worden op hun plaats gehouden en klik op OK om de lade terug te keren naar de uitgangspositie.
- Laad de drukplaat in de plaat houder en zorgen voor het rack goed is ingesteld op zijn plaats. Klik op GO en laat het drukproces om verder te gaan.
- Print de resterende 24 plekken in replica's van 6 spots per array (4 arrays / bron bezoek).
- Laad de 384 putjesin de printer en beginnen met afdrukken. Handhaving van de relatieve vochtigheid, tijdens het afdrukken, de hele druk tussen de 55 en 65%. De printer stopt na het afdrukken 5 dia's.
OPMERKING: Terwijl de microarray in deze test wordt gedrukt in een bepaald patroon 8 x 8 worden verschillende microarray afdrukken robots landbouwmachines specifieke programmering vereist om de gewenste opmaak te bereiken. Het is aan de eindgebruiker om de meest geschikte patroon gegeven specificaties van hun apparatuur te bepalen ".
- Plaats array-pennen in de printkop volgens de juiste configuratie van de layout. Voor deze lay-out te gebruiken een pin om alle monsters en arrays te drukken. Print de glycanen in blokken van zes, overslaan een kenmerk (een functie wordt gedefinieerd als enkele vlek van een bepaalde verbinding) aan beide zijden, zodat vlekken van hetzelfde monster niet precies worden afgedrukt naast elkaar.
- Bevochtiging / immobiliseren
LET OP: Als de dia's zijn afgedrukt, ondergaan ze een tijdelijke immobilisatie stap, ook wel bevochtigen. Bevochtigen post-print helpt om het monster bevestiging door het opnieuw bevochtigen van de vlekken en zorgen voor volledige blokkering homogeniseren.- Zet objectglaasjes in een 100% bevochtigingskamer direct na het afdrukken gedurende 30 min. Construct de kamer door het plaatsen zeer natte papieren handdoeken plat op de bodem van een grote glazen schaal, het plaatsen van de diaop een soort van rek, zoals een reageerbuis rek, bedrukken zijde naar boven, en afdichten met plastic folie te vangen in het vocht.
- Aantal dia's met een alcohol / solventbestendige markering pen en op te slaan in een verdroging doos. Uitdrogen 's nachts.
- Nummering, blokkeren, en opslag
- Bereid de blokkerende buffer - 50 mM ethanolamine in 50 mM boraatbuffer. Eerst, los boorzuur, in DDH 2 O tot een eindconcentratie van 50 mM in een kolf met een magnetische roerstaaf. Roer de oplossing krachtig op een bewogen plaat totdat alle vaste stof is opgelost. Onder voortdurend roeren, voeg de juiste hoeveelheid ethanolamine van een 16,54 M voorraadoplossing om het gewenste 50 mM concentratie bereikt. Voeg geconcentreerd natriumhydroxide aan te passen tot een uiteindelijke pH van 9,2.
- Dompel het gedrukte objectglaasjes in de blokkerende bufferoplossing gedurende 1 uur.
- Na 1 uur, spoel de dia's in DDH 2 O om overtollige sporen van het blokkeren van buffer te verwijderen.Gooi het blokkeren van buffer in een geschikte afvalcontainer.
- Breng de dia's glas kleuring houders en centrifugeren. Droge arrays door ze in een centrifuge met slingerende plaat houders, met een snelheid van 10 g gedurende 5 minuten.
- Zodra de dia droog, kunnen ze direct worden geïncubeerd of opgeslagen. Opslagomstandigheden -20 ° C in een afgesloten plastic zak.
2. Het analyseren van Glycan bindende eiwitten
- Bereid een bevochtigde kamer waarin de arrays worden gehybridiseerd past. Een eenvoudige kamer bestaat uit een Pyrex schotel, lagen de bodem met vochtige papieren handdoeken en een rek, waarop slides rusten.
- Gebruik gebiotinyleerde lectinen SNA (Sambuca nigra agglutinine) en ECA (Erythrina cristagalli agglutinine) bij 10 ug / ml + 2 ug / ml streptavidine-555 kleurstof, in indringende buffer (PBS + 0,01% Tween-20). Voor HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 A / Kentucky / 07 H1N1, in dit voorbeeld), gebruikeen beginconcentratie van 20 ug / ml vooraf gecomplexeerd, zoals eerder beschreven 34. In het kort maken HA: muis-α-Strep: geit-α-muis-Alexa647 mengsel in blokkerende buffer (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20), bij een 4: 2: 1 molaire verhouding.
OPMERKING: De array wordt gehybridiseerd met lectinen te bewerkstelligen dat glycanen geïmmobiliseerd en gedetecteerd (Figuur 1B). - Breng de glycan bindingseiwit-antilichaam mix oplossing van 20 ul van een 384-wells plaat en incubeer op ijs gedurende 30 min. Serieel verdund lectine en HA monsters 1: 1, in de juiste buffer, 8 maal, door 10 pl monster met 10 ul buffer.
- Pipetteer 8 ul van het monster op de micro-putoppervlak en incubeer dichtgeplakt bevochtiging (100% RV) kamer gedurende 90 min.
- Was de dia's één voor één door dat de randen en dompelen ze vier keer in een mengsel van PBS en 0,05% Tween, vervolgens vier keer in PBS, en tenslotte viermaal gedeïoniseerd H2O gebruikdezelfde drogingsprotocol in de blokkeringsstap beschreven spin de arrays drogen in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 10 x g.
3. Scannen en Data Analyses
NB: De glycan microarrays kunnen worden gescand met verschillende instellingen, afhankelijk van de fabrikant van de microarray scanner. Door het variëren van het laservermogen en de resolutie, kan het instrument een beeld met zo veel signalen mogelijk binnen het dynamische bereik (figuur 1C) te produceren.
- Gebruik een fluorescerende diascanner en scan de arrays direct na incubatie met de glycan bindende eiwitten. Let erop de dia wordt correct in de scanning instrument geplaatst.
- Open scansoftware. Klik op Start om het programma te openen. Verbinding maken met scanner: Scanner → Connect of groene knop in het menu Scanner navigatiepaneel.
- Open autoloader deur van de scanner. Plaats de dia's in sleuven in autoloader in bepaalde volgorde. Sluit autoloader deur. click "gelezen loader 'in het Hulpprogramma navigatiepaneel om automatisch detecteren dia's in de scanner.
- Stel scan parameter: Scanner → Scan parameters geschikt om het experiment (bijvoorbeeld 635 laservermogen hoog, detectie winst 50%). Scan dia's: Scanner → scan. Selecteer pad door het creëren van een map om de scan te beelden en de naam van de individuele scans op te slaan. Doe dit voorafgaand aan de feitelijke scannen. Herhaal dit voor elke afzonderlijke dia. Klik op OK om te beginnen met scannen.
- Gebruik de scanner software voor het opzetten van het instrument en scan de dia's. Stel scanner om iteratief te scannen bij lage laservermogen (5 mW) met toenemende ingrepen van 25%, 50% en 75%.
OPMERKING: De instellingen kunnen worden getest en geoptimaliseerd, maar houd er rekening mee dat elke scan mogelijk de fluorescentie-uitgang van de kleurstoffen te wijten aan fotobleken kan verlagen.- Open data-acquisitie en analyse software zoals mapix software. Klik op Start om het programma te openen. Open scan image: Bestand → geopend imleeftijd. Open GAL file: Analyze → Open Grid en selecteer het juiste GAL-bestand.
- Voer blokken mode: Beeld → blokken modus om het net te verplaatsen. Gebruik het raster markers om het raster ingesteld op de juiste locatie op de dia. Pas individuele blokken bestaan dat de afgedrukte matrix overeen.
- Voer vlekken mode: Beeld → vlekken modus om de locatie en de grootte van de afzonderlijke plekken binnen het blok aan te passen. Zodra alle blokken en vlekken worden aangepast en in de plaats, maatregel signaal intensiteiten door Analyze → fotometrische berekeningen. Bewaar de output file.
- Zodra de dia's klaar te scannen, worden de beelden geanalyseerd voor binding signalen met het beeld-processing programma geïnstalleerd (figuur 1D - G). Voor beeldanalyse, laadt een bestand GAL (Array List) de gescande TIFF voorbij.
LET OP: De GAL-bestand bevat zowel de plek lay-out patroon en de identiteit van elke plek locatie. GAL bestanden arrays crat 's avonds door de printer software met behulp van een door tabs gescheiden tekstbestand dat de identiteit van de monsters en hun locatie in de 384-wells bron plaat bevat. - Gebruik het raster marker / landingslichten afgedrukt op de microarrays om goed plaats de GAL raster. Individuele spots moet mogelijk afzonderlijk worden bewogen, maar een goed gedrukt array algemeen lagere blokken in het raster gemakkelijk worden geplaatst. Na plaatsing raster, verzamel vlek intensiteiten door de software en opgeslagen als een door tabs gescheiden tekstbestand (.txt).
- Met behulp van spreadsheet programma, opent u de output bestand van de scanner. Open de juiste macro-bestand in de map locatie. Klik op Beeld → Macro → RunMacro.
OPMERKING: De vooraf geschreven wordt de ruwe output data te kopiëren, overbodige rijen en kolommen te verwijderen, de gegevens door monster te sorteren, het berekenen van de gemiddelde gemiddelde signaal minus achtergrond waarden en plot van de hieruit voortvloeiende waarden in een spread-sheet werkblad met de grafieken voor elk van de zes samples getest op de array.
- Met behulp van spreadsheet programma, opent u de output bestand van de scanner. Open de juiste macro-bestand in de map locatie. Klik op Beeld → Macro → RunMacro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Printing, Scanning & Data analyse
Om een goede afdrukken te waarborgen, is het essentieel om de juiste uitlijning van de gevlekte net binnen de teflon masker, dat elke array op de dia bakent hebben. Tijdens het afdrukken, vanwege de aard van de teflonlaag kan vlekken niet met het blote oog de MPX dia. Aandacht wordt besteed dan aan het uiterlijk van de pre-vlekken op de poly-L-lysine gecoate glaasjes. Direct na het afdrukken, moet elke glijbaan oog gecontroleerd op de aanwezigheid van elk bevlekte samenstelling die zichtbaar door zouten van de buffer in de spot gedroogd. Arrays worden geïnspecteerd op correcte uitlijning van plekken binnen de Teflon grenzen en juiste aantal gespot functies.
Dia's worden gescand in een iteratief proces van lagere naar hogere scan macht om foto bleken te voorkomen en waardoor de vergelijking van highaar aviditeit naar aviditeit bindende eiwitten, die hogere en lagere output signalen lager, respectievelijk. Na scannen, de fluorescentie-intensiteit van elke vlek in de de beelden worden gemeten met een weergaveprogramma. Elke array is bedekt met een rooster dat overeenkomt het aantal functies gedrukt op de array oppervlak (figuur 1D - G). Met behulp van gedrukte fluorescerende kleurstoffen, worden de randen van de gedrukte glycanen gedefinieerd en een masker dat is geïntegreerd met de identiteit van de proefdruk lasso elke plek. De imaging masker lasso alle aspecten van de afgebeelde spot te nemen (omvang, intensiteit van het signaal, coördinaten in het rooster, etc.) en de output van deze informatie aan een door tabs gescheiden tekstbestand. Met behulp van tabellering software (spreadsheet), worden de monsters naargelang hun identiteit en de gemiddelde intensiteit van het signaal minus achtergrond wordt gemiddeld over 4 van de 6 plekken voor elk monster, het weglaten van de hoogste en laagste signaal als uitschieters. Een lijn grafiek van de gemiddelde gemiddelde signaalminus achtergrond wordt uitgezet tegen de acht eiwitconcentraties toegepast op de array en bevat één rij voor elk monster. Het eindresultaat grafiek afgevlakt met een niet-lineaire regressie berekend (Figuur 1I).
Glycan bindende eiwitten
De PAA-array wordt gebruikt om receptorbindingsspecificiteit van influenza A virus hemagglutinine beoordelen. Een extra kenmerk van onze array, niet in de analoge plaattest, is het opnemen van niet-gesialyleerde controles in dezelfde micro-well. Om vast te stellen dat de gedrukte verbindingen aanwezig na het afdrukken zijn, vaak gebruikt plant lectinen met bekende specificiteit werden gebruikt. ECA bindt aan eindstandige galactose gekoppeld β1-4 tot N-acetyl-glucosamine (Galβ1-4GlcNAc of LacNAc) verschijnt niet bindt indien de terminal galactose wordt afgetopt met siaalzuur. ECA detecteert alleen de non-gesialyleerde glycanen op onze geminiaturiseerde glycan array (Figuur 2A). Het ontbreken van binding aan een van de gesialyleerde glycan monsters is een indicatie dat deze volledig afgesloten met eindstandige sialinezuur. Voor α2-6 gekoppeld siaalzuur werd SNA lectine gebruikt als controle (Figuur 2B). Zoals verwacht, SNA bindt alleen gekoppelde siaalzuren α2-6, maar met opmerkelijke verschillen in affiniteit voor-PAA gekoppelde niet-PAA gekoppelde di-LacNAc herhalingen. Dit verschil weerspiegelt de gevoeligheid van PAA-gekoppelde glycanen en maakt de discriminatie van eiwitten die bij lage aviditeit kan binden. Voor α2-3 gekoppeld siaalzuur, een H5 hemagglutinine afgeleid van A / Vietnam / 1203-1204 virus waarvan bekend is dat α2-3 gekoppeld sialic alleen zuren herkennen werd gebruikt 6. Het bindingsprofiel van de H5 HA toont inderdaad specificiteit voor α2-3 gekoppelde siaalzuren, met een hogere aviditeit voor het PAA-gekoppelde structuren (Figuur 2C). Tenslotte, de H1 hemagglutinine van een humane seizoensgebonden H1N1 stam werd gebruikt dat, zoals verwacht, alleengebonden aan gekoppeld siaalzuur bevattende structuren (figuur 2D) α2-6.
Figuur 1: Printen, scannen en het beeld analyseert (A) PAA-geconjugeerde 6SLNLN wordt weergegeven als een vertegenwoordiger glycan structuur die op het glas dia's wordt afgedrukt.. (B) het incuberen van een glycan bindend eiwit op de multiwell-glycan array wordt getoond met een 8 pl volume met een druppel op de array oppervlak ontstaat. (C) Na incubatie van de glycan bindende eiwitten op de array en scannen in een confocale fluorescente diascanner wordt een representatief beeld verkregen. (D) Het beeld is bedekt met een rooster en, met behulp van raster markers voor een goede uitlijning, kan het enkele plekken worden geanalyseerd. (E) Een close up van een complete set van 8 arrays, waarbij een enkele glycan bindende eiwittenwerd geanalyseerd met behulp van acht 1: 1 verdunningen. (F) Een enkele array in een enkel putje wordt vertegenwoordigd; de array demarked de rastermarkeringen in de rechterbovenhoek (3 spots) en linksonder (2 plaatsen), dit glycan bindingseiwit bindt een enkele verbinding op de array overgenomen zes duidelijk zichtbaar. (G) Het rooster wordt getoond met lasso rondom specifieke individuele plekken. (H) Imaging software berekent signaal waarden uit het image-bestand en voert een door tabs gescheiden bestand. (I) De gegevens kunnen worden getabelleerd in spreadsheet of stastical software om een representatieve uitgang grafiek te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Output van plantaardige lectines (ECA, SNA) en IAV hemagglutinins met verschillende specificiteiten (H5 van A / Vietnam / 1203-1204, H1 van A / Kentucky / 07). (A) bindt ECA terminal LacNAc of Galb1-4GlcNAc specifiek en detecteert de aanwezigheid van het niet-gesialyleerde verbindingen als controles voor IAV hemagglutinine. (B) SNA erkent slechts glycanen voorzien van een terminal α2-6 siaalzuur. (C) De recombinante hemagglutinine van de H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) strain bindt aan siaalzuren α2-3 en zorgt voor een aviaire soort receptor binden profiel. (D) De recombinante hemagglutinine van een mens seizoensgebonden H1N1 (A / Kentucky / 07) bindt uitsluitend menselijke-type receptoren. Fluorescent signaal intensiteit werd gemeten voor elke plek, en gemiddelde intensiteit minus betekenen achtergrond werd berekend met behulp van spreadsheet-programma. Voor elke glycan wordt de gemiddelde signaalintensiteit berekend uit 6 repliceert spots. De hoogste en laagste signalen van de 6 herhalingen zijn verwijderd en de resterende 4 replicates worden gebruikt om het gemiddelde signaal, standaarddeviatie (SD) berekenen en standaardfout meting (SEM). De grafieken geven de gemiddelde gemiddelde signaal minus achtergrond voor elk monster en error bars zijn de SEM waarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het beoordelen van IAV receptor specificiteit is een belangrijke stap in het analyseren van mogelijke pandemie van aviaire virussen. Siaalzuur erkenning door het virus is gekoppeld aan verschillende biologische eigenschappen zoals binding aan en afgifte uit de cel. Kennis van die aminozuur mutaties nodig zijn voor aviaire virussen te bereiken α2-6 binding en steek de soort barrière maakt pandemie. Verschillende assays worden toegepast om receptor specificiteit te bepalen; echter allemaal hun nadelen, met alleen meten aviditeit en specificiteit niet en vice versa.
Hier beschrijven we een nieuwe geminiaturiseerde tool gebaseerd op de gebruikte en aanvaarde ELISA, die PAA-gekoppelde terminale fragmenten van complexe glycanen gebruikt. Gebruik 4 welomschreven lectines, 2 van planten en 2 van influenza A virus oorsprong, laten we zien dat we behouden specificiteit en relatieve aviditeit.
Bij de berekening van de hoeveelheid vermindering van chemicaliën en biologiCal gebruikt door miniaturisering de ELISA op een glycan array-chip, bereiken we opvallend grote verschillen. Ten eerste, de biologische; We gebruiken 10x minder testvolume en gebruik 6 testverbindingen in 6 herhalingen; Dit kan worden berekend op het equivalent van 36x rijen in 96-well platen zijn. Het resultaat is dat we gebruik maken van 360x minder biologicals. Kritische stappen omvatten goede afdrukken en het risico van hoge achtergronden met behulp van ongezuiverde glycan bindmiddelen of slechte detecteren antilichamen.
De verbindingen die in deze assay, hoewel nog steeds beschikbaar, niet gemakkelijk door chemo-enzymatische synthese. Gebruik microarray-druktechnieken, elke vlek slechts 2 nl, vergeleken met 100 ul per putje van een microtiterplaat. een enkele dia met 48 putten en 6 verbindingen, in 6 herhalingen printen, verbruiken we ongeveer 1152 nl. Dezelfde bekledingswerkwijze in 96-well platen resultaten bij het bekleden totaal 1842 putjes met 100 pl verbinding in dezelfde concentratie. Daarom printing tHij verbinding vergeleken met de plaattest bereiken wij een opvallende vermindering van 1,500x. Dus in totaal biologische gereduceerd 360-voudig en glycan verbruik van 1500-voudig. Gebruik robotachtige vloeibare handlers, envision we dat de meeste stappen kunnen worden geautomatiseerd, zodat de gehele assay worden gebruikt als een high-throughput screen.
Hoewel afdrukken microarrays en de daaropvolgende afbeelding analyses vereisen speciale machines en gereedschappen, deze instrumenten zijn niet zeldzaam en zijn aanwezig op vele universiteiten en instituten zijn. Printing is direct en geen chemische veranderingen vereisen. Daarom geloven wij dat dit een minimale hoeveelheid verbindingen en simpele druktechniek, kan deze test algemener toepasbaar zijn. Omdat het incubatievolume verlaagt de kosten van antilichamen en kostbare biologicals, deze techniek zal het mogelijk maken voor laboratoria met beperkte middelen om de specificiteit van IAV of andere glycan bindende eiwitten met hoge getrouwheid beoordelen behoud lagere kostens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Scripps Microarray Core Facility, en een contract van de Centers for Disease Control (JCP). RPdV is een ontvanger van een Rubicon en VENI-subsidie van de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO). Het Consortium voor Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) gefinancierd door NIGMS subsidie GM62116 (JCP) die verschillende glycanen gebruikt in deze studie. Dit is publicatie 29113 van het Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P.
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
