Abstract
Influensa A-virus (IAV) hemagglutinins gjenkjenne sialinsyrer på celleoverflaten som funksjonelle reseptorer for å få innpass i cellene. Wild vannfugler er det naturlige reservoaret for IAV, men IAV kan krysse artsbarrieren til fjærfe, svin, hester og mennesker. Fuglevirus gjenkjenne sialinsyre festet til et nest siste galaktose ved en α2-3 binding (avian-type reseptorer), mens humane virus fortrinnsvis å gjenkjenne sialinsyre med en α2-6 ledd (human-type reseptorer). For å overvåke om fuglevirus tilpasser seg mennesketype reseptorer, kan flere metoder benyttes. Glycan mikromatriser med ulike biblioteker av syntetiske sialosides blir stadig mer brukt til å evaluere reseptor spesifisitet. Imidlertid er denne teknikk ikke benyttes til å måle avidities. Måling av aviditet oppnås typisk ved å evaluere bindingen av seriefortynnet hemagglutinin eller virus for å glykaner adsorbert til konvensjonelle polypropylen 96-brønners plater. I denne analysen glykaner med α2-3 eller α2-6 sialinsyrer er koblet til biotin og streptavidin adsorbert til plater, eller er koplet til polyakrylamid (PAA) som direkte adsorberes til plasten. Vi har betydelig forminsket denne analysen av direkte utskrift PAA bundet sialosides og deres ikke PAA-linked kolleger på mikro vel glass. Dette set-up, med 48 arrays på ett lysbilde, gjør samtidige analyser av 6 sukkerbindende proteiner 8 fortynninger, avhør 6 forskjellige glykaner, inkludert to ikke-sialyserte kontroller. Dette er ekvivalent med 18x 96-brønners plater i det tradisjonelle skålmetoden. Sukker rekke format reduserer forbruket av forbindelser og biologiske og dermed i stor grad forbedrer effektiviteten.
Introduction
Vill vannfugler er de naturlig reservoar for IAV, men IAV er i stand til å krysse den art barriere for fjærkre og pattedyr, inkludert, mennesker. Avian IAVs gjenkjenne α2-3 knyttet sialinsyrer (fugle-type reseptorer), mens menneskelige virus binder α2-6 knyttet sialinsyrer (human-type reseptorer). For å være i stand til effektivt å replikere og overføre mellom mennesker en avian IAV trenger å bindes til human-type reseptorer 1.
IAVs er delt basert på serologi som karakteriserer antigenisiteten av deres hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) konvolutt glykoproteiner. HA binder seg til sialinsyrer, mens NA er den reseptor-ødelegge enzymet i den andre enden av den virale livssyklus, og kløyver sialinsyre 2. Alle menneskelige infiserer virus, inkludert H1N1, H2N2 og H3N2, har en aviær opprinnelse tre. I løpet av de siste to tiårene flere avian menneskelige crossovers har skjedd, med H5N1, H7N7 og H7N9 er den mest kjente; However, har andre subtyper smittet mennesker mer sporadisk (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heldigvis ser det ut til at ingen av disse virusene har vært i stand til fullt ut å tilpasse seg menneskelig-type α2-6 bundet sialsyre reseptorer 5-8. Tilpasning av avian eller andre zoonotiske virus for å imøtekomme replikasjon og overføring i menneskelige verter kan ha en ødeleggende effekt på menneskers helse. Derfor forkunnskaper i hvordan disse virusene utvikler seg til å binde human-type reseptorer vil hjelpe verdensomspennende overvåking av nye influensavirus.
Fastsettelse av reseptor preferanse ble først belyst ved hjelp av erytrocytter av ulike arter og er fortsatt et yndet analysen blant influensaforskere 9-12. Demonstrasjonen at fuglevirus gjenkjenne α2-3 sialsyre og menneskevirus α2-6 knyttet Sialinsyren var opprinnelig basert på en analyse ved hjelp hemagglutination av erytrocytter enzymatisk konstruert for å inneholde hver av de linkages 13,14. Selv om avlesning er hemagglutination, en standard analyse for virologer, er de underliggende sukker strukturer som ikke er definert, bare terminalen kobling. I tillegg er den begrensede tilgjengeligheten av sialyltransferaser, som brukes til å re-sialylate cellene, har begrenset anvendelse av denne analyse 15-18. Deretter ble andre metoder for å bestemme reseptorbindende preferanser innføres ved hjelp av sialyserte glykan strukturer koblet til poly-akrylamid (PAA) eller poly-glutamat (PGA) strukturer i platebaserte analyser 19,20. Flere variasjoner er mulige i å belegge enten glykaner eller virus i mikrotiterplater, som hver resulterer i en robust, pålitelig og meget følsom ELISA-type analyse 21-23. Alternativt kan biotin bundet glykaner erstatte PAA / PGA og kan konjugert til streptavidin-belagte plater 2,24. Selv om noen spesifikke sera kan være nødvendig, ELISA er standard og flere glykaner knyttet til PAA er lett kommersielt gjennomføry og ikke-kommersielt tilgjengelig (Consortium for Funksjonelle glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan microarray teknologi har dukket opp som et uvurderlig verktøy for å bestemme reseptor spesifisitet, som flere ulike glykaner er oppdaget, og binding til et bredt spekter av ulike strukturer kan vurderes innenfor en enkelt analyse 25-29. Binding av IAV til disse strukturene gir en bedre forståelse av de sukker strukturer som IAV fortrinnsvis gjenkjenner 30-33. Glycan mikromatriser krever små mengder prøvevolum for å utføre en bindingsanalyse og bruker bare små mengder av sukker per spot (2 nl). Imidlertid er disse rekker vanligvis brukes til å evaluere spesifisiteten av glykaner reseptorer. Analyse av flere virus, eller hemaglutinin proteiner, ved flere konsentrasjonsområder kan være prohibitive på grunn av det antall lysbilder som kreves. Videre, til dags dato, ingen slektning avidity analysen har blitt utviklet ved hjelp av sukker array teknikker.
Å kombinere lav prøven kravet gis av sukkermicroarray teknikker og følsomheten av PAA bundet glykaner i ELISA-baserte analyser, søkte vi å utvikle en multi-brønn glykan matrise som ville tillate for high-throughput analyser med tilsvarende eller bedre oppløsning sammenlignet til den tradisjonelle ELISA-basert assay. Samtidig ønsket vi å minimere mengden av biologiske og reporter kjemikalier forbrukes. Det endelige resultatet er en miniatyrisert aviditet analyse, spesielt utviklet for å overvåke IAV spesifisitet og er like aktuelt å vurdere andre sukker bindende proteiner. Ved hjelp av en glass-slide delt inn i 48 mikrobrønner med en Teflon maske, er 6 forskjellige glykaner oppdaget i 6 replikater per brønn. Den microarray plattform gir de samme trendene i reseptor binding sett i makro ELISA-format med flere fordeler. Disse omfatter (I) utskrift av forbindelsen i 6 gjentak, ved hjelp av minimal prøven, mot belegget av flere rader ina plate, med 100 mL per brønn; (II) av flere ulike forbindelser analysert samtidig i en enkelt brønn, inklusive kontroller; (III) en massiv reduksjon i inkubasjonsvolum og; (IV) et større dynamisk område ved hjelp av et fluorescerende avlesning. En enkelt lysbilde kan beregnes til å tilsvare 18x 96-brønners plater.
Ved hjelp av følgende protokoll, en hvilken som helst laboratorium stand til å fabrikere og å analysere flekket mikromatriser bør være i stand til å produsere dette miniatyrisert ELISA-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt.
1. Array Construction
- Glycan Forberedelse og Plate Setup
- Forbered et lager av utskrift buffer. Først lage 500 ml av en 150 mM stamløsning av dinatriumfosfatheptahydrat. Også lage 50 ml av en 150 mM stamløsning av monobasisk natriumfosfatoppløsning. I en kolbe, ved hjelp av en magnetisk rørestav og pH-meter, langsomt titrere dibasisk natriumfosfatoppløsning med den monobasisk oppløsning inntil en pH-verdi på 8,5 er nådd. Legg Tween-20 til 0,005%.
- Forbered ved sukkerprøver. Fortynnet PAA konjugerte glykaner, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) og 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (figur 1A )) skal fortynnes til 100 ug / ml i utskriften buffer fra step1.1.1. Monovalente glykaner,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH2) 3-NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH2) 3-NH2) og 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) til 100 uM i utskriften buffer fra trinn 1.1.1. Til slutt, forberede amin-funksjonfargestoffer, for å bruke som grid markører / landingslys. Dye markør flekker er trykt på en mikrometer.
MERK: Atto488-NHS fargestoff er brukt i våre utskrifter. En hvilken som helst amin-funksjonalisert fargestoff, som kan leses av sleiden skanneren er egnet for dette formål. - Overføre 10 ul av hver prøve glykan til 384-brønners mikrotiterplater, som brukes for trykk roboten. Oppbevar ubrukte glykaner i trykking bufferoppløsning ved -20 ° C i forseglede rør. Tansfer 10 ul av fargestoffet markør til trykkeplaten.
- Printing
MERK: All steps som gjelder berøre eller flytte lysbildene må gjøres med hansker.- Plasser arrayer pins i utskriften hodet i henhold til riktig konfigurasjon av oppsettet. For dette oppsettet bruke en pinne for å skrive ut alle prøver og arrays. Skrive ut glykaner i blokker med seks, hopper en funksjon (en funksjon som er definert som én flekk av en viss forbindelse), på hver side, slik at flekker av den samme prøven ikke er trykt nøyaktig ved siden av hverandre.
MERK: Sluttbrukeren må bestemme konfigurasjonen. - Fjern lysbilder fra poser, åpne bokser, og fjern eventuelle støvpartikler eller små biter av plast som kan være på deres overflater ved å blåse ultra-høy renhet Nitrogen gass på hvert lysbilde. Plasser ønsket antall lysbilder, belagt side opp, på arrayer scenen.
- Programmer arrayer, bruker parameterne for 27 flekker pr besøk til kilden plate, ved å bruke 3 "pre-spots" på poly-L-lysin-belagte objektglass, for å fjerne overskudd av væske på tuppen av trykk pinnene
- Slå på MPU (hovedstrømmen Unit) og Climate Control Unit. Åpne Flislegging Analyse programvare på datamaskinen.
- Velg layout til print. Velg Alternativer → Pin verktøy som skal brukes for å skrive ut matrisen 1 x 1 print verktøy - en enkelt pinne. Velg fanen Target → Tool Array Definisjon → OPPSKRIFT og legge banen (spot-til-spot avstand), antall rader og kolonner for å imøtekomme de prøvene som skal skrives ut, og utskrift mønster av prøvene (for denne matrisen en 8 x 8 utskrift mønster er brukt på 340 mikrometer banen for 7 totalt prøver).
- Velg Target → Slide Layout og programmere blokk-til-blokk avstand for å tillate utskrift av hver replikere rekke inn i 48-brønn (4 x 12) lysbildemalen. Velg Kilde og legge antall kilde pickups (en for hver prøve ved bruk av en pin) (for denne utskrifts 7 kilde pickups vil bli brukt til å huse 6 prøvebrønner og en fargestoff markør vel).
MERK: Kilden dialog skal bli grønn for å vise at antallav kilde besøk kamper prøvene som skal skrives ut i utskriftsmønsteret. - Velg Target → Adapter Plate og Slide Layout og justere bildenummeret (5 lysbilder skrives på et tidspunkt for denne utskrifts med en pre-spotting lysbilde).
- Slipp skuffen ved å klikke på T1-knappen for å aktivere skuffen og legge til ønsket antall lysbilder i skuffen, vier oppmerksomhet til plasseringen av den pre-spotting lysbilde (blå) og "ekte" lysbilder.
- Legg vanlig glassplater på alle gjenværende vakuum porter for å blokkere vakuum og klikk OK for å aktivere vakuum. Sjekk at alle lysbilder holdes på plass og klikk på OK for å gå tilbake i skuffen til utgangsposisjonen.
- Last trykkplaten inn i plateholderen og sikre stativet er riktig satt på plass. Klikk GO og la trykkeprosessen for å fortsette.
- Skriv ut de resterende 24 plassene i replikater av 6 flekker per array (4 arrays / kilde besøk).
- Last inn 384-brønners platerinn i skriveren og starte utskriften. Oppretthold relativ fuktighet, under utskrift, hele print mellom 55 og 65%. Skriveren stopper etter utskrift 5 lysbilder.
MERK: Mens microarray i denne analysen er trykt i et bestemt 8 x 8 mønster, vil ulike microarray utskrift roboter krever utstyr spesifikk programmering for å oppnå ønsket layout. Det er opp til sluttbrukeren å bestemme den mest passende mønster gitt sitt utstyr spesifikasjoner.
- Plasser arrayer pins i utskriften hodet i henhold til riktig konfigurasjon av oppsettet. For dette oppsettet bruke en pinne for å skrive ut alle prøver og arrays. Skrive ut glykaner i blokker med seks, hopper en funksjon (en funksjon som er definert som én flekk av en viss forbindelse), på hver side, slik at flekker av den samme prøven ikke er trykt nøyaktig ved siden av hverandre.
- Humidification / Immobiliserende
MERK: Når lysbildene er ferdig med å skrive ut, de gjennomgår en midlertidig immobilisering skritt, også kalt fukt. Avfukting post-print bidrar til å homogenisere prøven vedlegg ved å re-fukte flekkene og sikre fullstendig blokkering.- Sette glir i en 100% fuktighet kammeret umiddelbart etter utskrift i en periode på 30 min. Konstruere kammeret ved å lage en meget våt papirhåndklær flate i bunnen av en stor glasstallerken, å plassere objektglassenepå en slags rack, slik som et reagensrør rack, utskriftssiden opp, og tetting med plastfolie for å felle i fuktighet.
- Antall lysbilder med en alkohol / løsemiddelresistent tusjpenn og oppbevar i en uttørking boks. Desiccate over natten.
- Nummerering, Blokkering og oppbevaring
- Klargjør blokkering buffer - 50 mM etanolamin i 50 mM borat buffer. Først oppløse borsyre, i DDH 2 O, til en endelig konsentrasjon på 50 mM i en kolbe inneholdende en magnetisk rørestav. Rør løsningen kraftig på en røreplate inntil alt faststoff er oppløst. Mens stadig omrøring, tilsett passende mengde etanolamin fra en 16,54 M stamløsning for å nå den ønskede 50 mM konsentrasjon. Legg konsentrert natriumhydroksyd for å justere til en slutt-pH på 9,2.
- Dypp de utskrevne sider i blokkeringsbufferløsning for en time.
- Etter en time, skyll lysbildene i DDH 2 O for å fjerne overflødig spor av blokkering buffer.Kast blokkeringsbuffer i en passende avfallsbeholder.
- Overfør lysbilder til glass flekker holdere og spinne tørr. Tørre matriser ved å plassere dem i en sentrifuge utstyrt med svingende plateholdere, ved en hastighet på 10 x g i 5 min.
- Når skinnene er tørre, kan de bli inkubert umiddelbart eller lagres. Lagringsbetingelser er -20 ° C i en forseglet plastpose.
2. Analysere Glycan bindende proteiner
- Forbered en fuktet kammer der arrays for å bli hybridisert vil passe. En enkel kammer består av en Pyrex tallerken, lagvis på bunnen med fuktet papirhåndklær og en rack, hvorpå lysbildene vil hvile.
- Bruk biotinylerte lektiner SNA (Sambuca nigra agglutinin) og ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) ved 10 ug / ml + 2 ug / ml streptavidin-555 fargestoff, i sentret buffer (PBS + 0,01% Tween-20). For HA (A / Vietnam / 1203 til 1204 H5N1 og A / KY / 07 H1N1, i dette eksempelet), bruken utgangskonsentrasjon på 20 ug / ml forhåndskompleksdannet, som tidligere beskrevet 34. I korte trekk gjør en HA: Mus-α-Strep: Geit-α-mus Alexa647 blandingen i blokkeringsbuffer (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20), ved et 4: 2: 1 molart forhold.
MERK: Matrisen er undersøkt med lektiner å konstatere at glykaner er immobilisert og påvisbar (figur 1B). - Overfør glykan bindingsprotein-antistoff blanding oppløsning av 20 ul av en 384-brønners plate og inkuber på is i 30 min. Serielt fortynnet lectin og HA prøvene 1: 1, i deres passende buffer, 8 ganger, ved å blande 10 ul prøve med 10 ul buffer.
- Pipetter 8 ul av prøven på mikrobrønnoverflaten og inkuber i den forseglede fukting (100% RH) kammer i 90 min.
- Vask objektglassene en om gangen ved å holde kantene og å dyppe dem fire ganger i en blanding av PBS og 0,05% Tween, deretter fire ganger i PBS, og til slutt fire ganger i avionisert H2O Brukedet samme tørke protokoll beskrevet i sperretrinnet, spinne arrays tørke i en sentrifuge i 5 minutter ved 10 x g.
3. skanning og dataanalyser
MERK: sukker mikromatriser kan skannes med forskjellige innstillinger, avhengig av microarray skannerprodusenten. Ved å variere lasereffekt og oppløsning, kan instrumentet gi et bilde med så mange signaler som mulig innen sitt dynamiske område (figur 1C).
- Bruk en fluorescerende lysbilde skanner og skanne arrays umiddelbart etter inkubasjon med ved sukker bindende proteiner. Pass på lysbildet er riktig satt inn i skanning instrumentet.
- Åpne skanneprogramvare. Klikk Start for å åpne programmet. Koble til skanneren: Scanner → Koble til eller grønne knappen i menyen skannernavigasjonspanelet.
- Åpne Autoloader dør av skanneren. Plasser lysbilder i sporene i autolasteren i bestemt rekkefølge. Lukk Autoloader dør. Click "lese loader" i Verktøy-navigasjonspanelet for å automatisk oppdage lysbilder i skanneren.
- Sett skanning parameter: Scanner → Skanne parametere som passer til forsøket (f.eks 635 laser makt høy, gjenkjenning gain 50%). Skann lysbilder: Scanner → Scan. Velg bane ved å opprette en mappe for å lagre skanne bilder og navne individuelle skanninger. Gjør dette før selve skanningen. Gjenta for hvert enkelt lysbilde. Klikk OK for å starte skanningen.
- Bruk skannerprogramvaren for å sette opp instrumentet og skanne lysbilder. Sett skanner iterativt skanne ved lav laser makt (5 mW) med økende forsterkning på 25%, 50% og 75%.
MERK: Innstillingene kan testes og optimaliseres, men husk at hver skanning kan muligens senke fluorescens produksjon av fargestoffer på grunn av fotobleking.- Åpne datainnsamling og analyse programvare, for eksempel Mapix programvare. Klikk Start for å åpne programmet. Åpne skannebildet: Fil → Åpne imalder. Åpne GAL file: Analyser → åpent rutenett og velg riktig GAL filen.
- Skriv blokker modus: Bilde → blokker modus for å flytte rutenettet. Bruk grid markører for å sette rutenettet til riktig sted på lysbildet. Juster individuelle blokker som er nødvendig for å matche den trykte array.
- Skriv flekker modus: Bilete → flekker modus for å justere plasseringen og størrelsen på enkeltsteder i blokken. Når alle blokker og plassene er justert og på plass, måle signalintensitet etter Analyze → fotometriske beregninger. Lagre filen.
- Når lysbildene er ferdig skanning, vil bildene analyseres for binding signaler med bildebehandlingsprogram installert (figur 1D - G). For bildeanalyse, legger en GAL (Array List) fil over det skannede TIFF-bilde.
MERK: GAL-filen inneholder både spot layout mønster og identiteten til hver spot sted. GAL-filer for arrays er crflere ganger av skriverprogramvaren ved hjelp av en tabulatordelt tekstfil som inneholder identiteten til prøvene og deres plassering i 384-brønnen kilde plate. - Bruk grid markør / landingslys trykket på mikromatriser du skal plassere GAL rutenettet. Enkeltsteder må kanskje flyttes individuelt, men en godt skrevet array vil vanligvis tillate blokker innenfor rutenettet skal plasseres med letthet. Etter emisjonen rutenett, samle stikk intensiteter av programvaren og lagres som en tabulatordelt tekstfil (.txt).
- Ved hjelp av regnearkprogram, åpne utdatafilen fra skanneren. Åpne den aktuelle makro filen fra mappen. Klikk på Vis → Makro → RunMacro.
MERK: forhåndsskrevne vil kopiere rå utgangsdata, fjerne unødvendige rader og kolonner, sortere dataene etter prøven, beregne gjennomsnittlig gjennomsnitts signal minus bakgrunnsverdier og plotte de resulterende verdiene i en spread-ark regneark som inneholder grafer for hver av fem SAMPles testet på matrisen.
- Ved hjelp av regnearkprogram, åpne utdatafilen fra skanneren. Åpne den aktuelle makro filen fra mappen. Klikk på Vis → Makro → RunMacro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utskrift, skanning og dataanalyser
For å sikre riktig utskrift, er det viktig å ha riktig justering av flekket rutenettet i teflon maske, som avtegner hver oppstilling på lysbildet. Under utskrift, på grunn av naturen av teflon belegg, kan flekker ikke ses med det blotte øye på MPX lysbilder. Oppmerksomhet er betalt deretter til utseendet på pre-flekker på poly-L-lysin belagt lysbilder. Rett etterpå, bør hvert lysbilde kontrolleres av øyet for tilstedeværelsen av hvert oppdaget forbindelse som er synlig på grunn av rets salter tørket i stedet. Arrays er inspisert for riktig justering av plassene innenfor Teflon grenser og riktig antall flekket funksjoner.
Slides er skannet i en iterativ prosess med lavere til høyere skanne makt for å unngå fotobleking og tillater sammenligning av highennes aviditeten til lavere aviditet bindende proteiner, som har høyere og lavere utgangssignaler, respektivt. Etter skanning, er det fluorescerende intensiteten av hver spot i utgangs bildene måles ved hjelp av et bildeprogram. Hver matrise er overlappet med et rutenett fil som samsvarer med antall funksjoner trykt på tabellen overflaten (Figur 1D - G). Ved hjelp av trykte fluorescerende fargestoffer, er grensene til de trykte glykaner definert og en maske som er integrert med identiteten utskriften slik kveiler hver spot. Bildebehandling maske lasso vil ta opp alle aspekter av bildebehandlede spot (størrelse, signalintensitet, koordinater i rutenettet, etc.) og utgang denne informasjonen til en tabulatordelt tekstfil. Bruke tabulation programvare (regneark), er prøvene sortert etter identitet og gjennomsnittlig signalintensitet minus bakgrunn er midlet over 4 av de 6 stedene for hver prøve, drar ut den høyeste og laveste signal som uteliggere. En linje graf over midlere signalminus bakgrunn er plottet mot de åtte proteinkonsentrasjoner som anvendes til matrisen og inneholder en linje for hver prøve. Det endelige resultatet grafen er glattet ved hjelp av en ikke-lineær regresjon beregning (Figur 1I).
Glycan bindende proteiner
Den PAA-Array brukes til å vurdere reseptorbindingsprofilen spesifisitet av influensa A-virus hemagglutinins. Et ytterligere trekk ved vår rekke, ikke til stede i det analoge skålmetoden, er det å inkludere ikke-sialyserte kontrollene i samme mikro brønnen. For å vurdere det trykte forbindelser er til stede etter utskrift, lektiner brukte plante med kjent spesifisitet ble brukt. ECA binder seg til terminal galaktose knyttet β1-4 til N-acetyl-glukosamin (Galβ1-4GlcNAc eller LacNAc) og vil ikke binde dersom terminalen galaktose er avkortet med sialsyre. ECA registrerer bare de ikke-sialyserte glykaner på vår miniatyrisert glykan array (Figur 2A). Mangelen på binding til en hvilken som helst av de sialyserte glykan prøvene er også en indikasjon på at disse er fullt avkortet med terminal sialinsyre. For α2-6 bundet sialinsyre, ble SNA anvendt som et lektin kontroll (figur 2B). Som forventet, SNA binder bare å α2-6 knyttet sialinsyrer, men med betydelige forskjeller i affinitet for PAA bundet ikke-PAA bundet di-LacNAc gjentas. Denne forskjellen skyldes sensitiviteten av PAA-bundne glykaner og tillater diskriminering av proteiner som kan binde med lav aviditet. For α2-3 knyttet sialsyre, en H5 hemagglutinin fra A / Vietnam / 1203-1204 virus som er kjent for å gjenkjenne α2-3 knyttet sialinsyre bare syrer ble brukt seks. Bindingen profil av den H5 HA faktisk viser spesifisitet for α2-3 koblede sialinsyrer, med en høyere aviditet for PAA-bundne strukturer (figur 2C). Til slutt ble H1 hemagglutinin fra et humant sesong H1N1 belastning anvendt på at, som forventet, barebundet til α2-6 knyttet sialinsyregrupper inneholder strukturer (figur 2D).
Figur 1: utskrift, skanning og bildeanalyse (A) PAA-konjugert 6SLNLN er vist som en representant sukker struktur som er trykt på glassplater.. (B) inkubering av en glykan bindende protein på multi-brønn glykan matrise er vist med en 8 pl volum som skaper en dråpe på matrisen overflaten. (C) Etter inkubasjon av sukker bindende proteiner på rekke og skanning i en konfokalmikroskoper fluorescerende lysbilde skanner, er et representativt bilde oppnådd. (D) Bildet er overlappet med et rutenett, og ved hjelp grid markører for riktig justering, kan de enkelte stedene skal analyseres. (E) Et nærbilde av et komplett sett med 8 matriser, der en enkelt glykan bindende proteinble analysert ved hjelp av åtte 1: 1 fortynninger. (F) En enkelt matrise, i en enkelt brønn er representert; matrisen er markerte av nett markører i øverst til høyre (3 spots) og venstre (2 plasser), binder denne sukker bindende protein en enkelt forbindelse på tabellen som en gjengivelse av seks er klart synlig. (G) Rutenettet vises med lasso omkranser konkrete enkeltsteder. (H) bildebehandling beregner signalverdier fra bildefilen og utganger en tabulatordelt datafil. (I) Dataene kan ordnet i regneark eller stastical programvare for å lage en representant utgang graf. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Utgang av plante lektiner (ECA, SNA) og IAV Hemagglutinins med forskjellige spesifisiteter (H5 fra A / Vietnam / 1203-1204, H1 fra A / Kentucky / 07). (A) ECA binder terminal LacNAc eller Galb1-4GlcNAc spesifikt og detekterer tilstedeværelsen av de ikke-sialyserte forbindelser benyttet som kontroller for IAV hemagglutinins. (B) SNA anerkjenner bare glykaner som bærer en terminal α2-6 sialsyre. (C) Den rekombinante hemagglutinin av H5N1 (A / Vietnam / 1203-1204) stamme binder seg til α2-3 sialinsyrer og gir en avian typen reseptor-bindende profil. (D) Den rekombinante hemagglutinin fra et humant sesong H1N1 (A / Kentucky / 07) binder seg til menneskelig-type reseptorer bare. Fluorescerende signalintensitet ble målt for hver spot, og mener intensitet minus bety bakgrunn ble beregnet ved hjelp av regnearkprogram. For hver glykan, er den midlere signalintensiteten beregnet fra seks replikater flekker. De høyeste og laveste signalene fra 6 replikater er fjernet og de resterende fire replikates brukes til å beregne den midlere signal, standardavvik (SD), og standard feil måling (SEM). Grafene representerer gjennomsnitt gjennomsnittet signal minus bakgrunn for hver prøve og feilfelt er SEM verdi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurdere IAV reseptoren spesifisitet er et viktig skritt i å analysere pandemisk potensial av fuglevirus. Sialinsyre gjenkjennelse av viruset er knyttet til en rekke biologiske egenskaper som for eksempel binding til og frigjøring fra cellen. Kunnskap om hvilke aminosyre-mutasjoner er nødvendig for fuglevirus å oppnå α2-6 bindende og krysse artsbarrieren gjør pandemiberedskap. Flere analyser er benyttet for å bestemme reseptorspesifisitet; men har alle sine ulemper, blant annet bare måle grådighet og ikke spesifisitet og vice versa.
Her beskriver vi en roman miniatyrisert verktøy basert på den mye brukte og akseptert ELISA, som bruker PAA bundet terminal fragmenter av mer komplekse glykaner. Bruke 4 veldefinerte lektiner, to av anlegget og to av influensa A virus opprinnelse, viser vi at vi opprettholder spesifisitet og relativ grådighet.
Når vi beregne mengden av reduksjon av kjemikalier og biological brukes av miniaturizing ELISA på en sukker rekke chip, nå vi påfallende store forskjeller. Først de biologiske; vi bruker 10x mindre analysen volum og bruke 6 testforbindelser i 6 paralleller; Dette kan beregnes til å være den tilsvarende 36x rader i 96-brønners plater. Resultatet er at vi bruker 360X mindre biologiske. Kritiske trinn inkluderer riktig utskrift og risiko for høye bakgrunn bruker urenset sukkerbindemidler eller dårlige Oppdage antistoffer.
Forbindelsene som anvendes i denne analysen, selv om det fortsatt er tilgjengelig, er ikke lett tatt opp av chemo-enzymatisk syntese. Ved hjelp av mikromatrise-trykking teknologi, er hvert sted bare to nl, sammenlignet med 100 ul per brønn av en mikrotiterplate. Skrive ut et enkelt lysbilde som inneholder 48 brønner og 6 forbindelser i 6 gjentak, forbruker vi om lag 1152 nl. Den samme fremgangsmåte belegget i 96-brønners plater resulterer i belegg med totalt 1,842 brønner med 100 ul av forbindelse i den samme konsentrasjon. Derfor utskrift than forbindelse sammenlignet med den skålmetoden, vi oppnå en slående reduksjon av 1,500x. Derfor, i alt, er biologiske reduseres 360 ganger og sukkerforbruket med 1500-fold. Ved hjelp av robotvæskebehandlere, ser vi for oss at de fleste trinn kan være automatisert, slik at hele analyse brukes som et high-throughput skjerm.
Selv om utskrift mikromatriser og påfølgende bilde analyser krever spesielt utstyr og verktøy, disse instrumentene er ikke sjeldne og er til stede ved mange universiteter og institutter. Utskrift er direkte og krever ikke kjemiske forandringer. Derfor tror vi at med denne minimal mengde av forbindelser og enkel utskrift teknikk, kan denne analysen være mer generelt anvendelig. Som det reduserer inkubasjon volum, vil kostnadene ved antistoffer og dyrebare biologiske, vil denne teknikken gjør det mulig for laboratorier med begrensede ressurser til å vurdere spesifisitet av IAV eller andre sukker bindende proteiner med høy nøyaktighet og samtidig opprettholde lavere kostnaders.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av Scripps Microarray Kjerne Facility, og en kontrakt fra Centers for Disease Control (JCP). RPdV er en mottaker av en Rubicon og VENI tilskudd fra nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO). Konsortiet for Funksjonelle glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finansiert av NIGMS tilskuddet GM62116 (JCP) gitt flere glykaner brukt i denne studien. Dette er publikasjonen 29113 fra The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P.
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
