Name: Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Impara l'isolamento di complessi RNA-proteina endogeni dalle cellule eucariote mediante arricchimento diretto da oligonucleotidi. Questo metodo consente di caratterizzare specifici RNP coinvolti nel controllo post-trascrizionale dell'espressione genica virale.

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Gli autori ringraziano il supporto dal NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Composizioni Buffer </td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio: </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> Basso sale Buffer: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 10 mM NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 1x inibitore della proteasi cocktail senza EDTA </td></tr><tr><td> RNase Out 5 ml / ml (inibitore RNasi) </td></tr><tr><td> Citoplasmatica Lysis Buffer: </td></tr><tr><td> 0.2 M saccarosio </td></tr><tr><td> 1,2% Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETn-150 tampone di lavaggio: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 mmNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% NP-40 </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 10% di glicerina </td></tr><tr><td> Binding Buffer: </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES pH 7,6 </td></tr><tr><td> 40 mM KCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 5% glicerolo </td></tr></tbody></table> Tabella 2: composizioni Buffer. 1. Preparazione delle cellule e la matrice di affinità <ol><li> Culture una linea cellulare di interesse per sub-confluenza (80%) in un piatto 10 cm. Usare piatti 10 cm per immunoprecipitazione indipendenti (IP) di una proteina di rivestimento NLS-MS2 FLAG-tag. Eseguire l&#39;IP utilizzando antisieri al tag FLAG-epitope. Nell&#39;esprimere il MS2 proteina di rivestimento plasmide FLAG-tagged, trasfezione le cellule 24-48 ore in anticipo del raccolto 20. NOTA: Un particolare RNP può essere arricchito dal nucleare o citoplasmalisati ic o un preparato biochimicamente-frazionata, come frazioni di un gradiente di saccarosio. Si raccomanda di raccogliere il lisato da cellule non transfettate in parallelo ad istituire un controllo negativo aggiuntivo. </li><li> Trasferimento 60 ml per IP di proteine ​​G tallone magnetico liquami in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga. </li><li> Posizionare il tubo su un rack calamita per provette da microcentrifuga per separare le perline dalla soluzione di storage. </li><li> Rimuovere la soluzione di archiviazione disegnando con attenzione in su con una micropipetta. </li><li> Rimuovere il tubo dal rack magnete. </li><li> Lavare ed equilibrare le perline con 600 microlitri (10 volte il volume usato di perline) di 1x tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl 2, e 150 mM NaCl) e end-over-end di rotazione per 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio. </li><li> Aggiungere 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e immunoprecipitating anticorpi bandiera alle pr equilibratobiglie magnetiche otein G (secondo la quantità raccomandata dal produttore per un immunoprecipitazione) e ruotare end-over-end a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per coniugare l&#39;anticorpo immunoprecipitating. Utilizzare il corrispondente IgG isotipo come controllo negativo adatto anticorpi. </li><li> Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante. </li><li> Rimuovere il tubo dal rack magnete e lavare le perline anticorpo coniugato con 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e la rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio. </li></ol> 2. La raccolta della RNP NOTA: Preparare le RNP durante il tempo di incubazione dopo passo 1.8. <ol><li> Rimuovere terreno di coltura dalle cellule mediante aspirazione e lavare le cellule due volte con 1-5 ml di 1x ghiacciata PBS (PBS). Utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere bagnato,cellule aderenti precedenti la raccolta per centrifugazione a 226 xg per 4 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 375 ml di ghiacciata, buffer di basso contenuto di sale (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT; 1x proteasi-inibitore cocktail, senza EDTA e 5 ml / ml RNase Inhibitor) al pellet e consentire gonfiore ponendolo in ghiaccio per 5 min. NOTA: sarto il volume di tampone basso contenuto di sale in funzione delle dimensioni del pellet. Per 1,2 x 10 6 cellule da una piastra 10 cm 375 microlitri di tampone è sufficiente. </li><li> Per raccogliere il lisato cellulare citoplasmatica, aggiungere 125 ml di tampone di lisi ghiacciata (0,2 M di saccarosio / 1,2% Triton X-100), e quindi eseguire 10 colpi con un omogeneizzatore Dounce che è stato pre-raffreddata in un secchiello del ghiaccio. NOTA: per raccogliere il estratto cellulare totale, tampone di lisi standard di RIPA è raccomandato per solubilizzare nucleoplasma / cromatina. </li><li> Spin in una microcentrifuga alla massima velocità (16.000 xg) per 1 min; questo sarà chiaro il supernatante di detriti unnuclei ND. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1.7 ml che è stato sul ghiaccio. Determinare la concentrazione totale di proteine da una norma, metodo di laboratorio-preferito, come il Bradford Assay 23. Prenotare una aliquota di almeno il 10% per analisi Western blot, per essere usato come un controllo di input. Utilizzare il lisato cellulare raccolto immediatamente per immunoprecipitazione o conservarlo a -80 ° C per le analisi future. NOTA: Nella nostra esperienza, i campioni possono essere conservati e utilizzati alcuni mesi dopo per l&#39;analisi immunoprecipitazione, senza un compromesso di integrità. </li></ol> 3. immunoprecipitazione <ol><li> Aggiungere il volume desiderato del lisato cellulare raccolto, in base alla concentrazione proteica determinata nel passo 2.5, all&#39;obiettivo perline anticorpo-coniugato. Utilizzando tampone di lavaggio 1x, portare il volume totale a 600 microlitri e ruotare end-over-end per 90 min a temperatura ambiente. NOTA: Questo periodo di tempo è sufficiente per generareun isolamento robusto ad alta affinità complessi RNP, riducendo al minimo legame non specifico. Diluire fonti RNP alternative, come frazioni di un gradiente di saccarosio, di almeno 1: 1 con tampone di lavaggio 1x, e poi incubare con complessi branello-anticorpo precedentemente preparato, come detto sopra. </li><li> Dopo 90 min di incubazione, porre la provetta IP sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline. Riserva la surnatante come flusso continuo. NOTA: Questo primo flusso continuo è un campione di controllo importante per misurare l&#39;efficienza IP. Un saggio immunoenzimatico fornirà un&#39;indicazione dell&#39;efficienza IP, nonché la specificità delle interazioni indagate. Si consiglia di mantenere questo surnatante per l&#39;analisi a valle. </li><li> Lavare le, perline anticorpo-coniugato RNP-bound con 10 volumi (600 microlitri) di NETn-150 tampone di lavaggio ghiacciata (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 3 mM MgCl 2; 0,5% NP40; e 10% glicerolo) in rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 3 volte. NOTA: Questo buffer differisce dal buffer di lisi e riduce effettivamente associazioni deboli o non specifici. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere i complessi RNP immobilizzate in 60 ml di 1x tampone ghiacciata vincolante (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl, 3 mM MgCl 2; 5% glicerolo e 2 mM DTT) e riserva del 10% delle perline complessi immobilizzati per Western blot e 20% per l&#39;isolamento di RNA. </li></ol> 4. eluizione <ol><li> Regolare il volume residuo di 100 microlitri con 1x tampone di legame ghiacciato e riscaldare il tubo a 70 ° C per 3 min. </li><li> Per isolare affini complessi RNA-proteina, aggiungere un ~ 30 nt DNA oligonucleotide complementare al confine 3 &#39;la sequenza di RNA di interesse e incubare per 30 min a temperatura ambiente con delicata dondolo (100 nM di oligonucleotide è sufficiente). NOTA: L&#39;oligonucleotide antisenso è ai residui nucleotidici adiacenti alla traduzione start-site del costrutto PCE utilizzato come example in questo protocollo. Appropriata complementarità sequenza viene fornito dalla ~ contenuto di GC del 40%. Progettare l&#39;oligonucleotide antisenso per l&#39;ibridazione efficiente alla regione minima complementare del RNA bersaglio. </li><li> Aggiungere 5-10 unità di RNasi H al tubo ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora per scindere l&#39;RNA del RNA: DNA ibrido. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga sterili; questo campione contiene i complessi RNP catturati di interesse. NOTA: A seconda della accessibilità del RNA cognate, due o più cicli di trattamento RNase H possono essere utili per aumentare l&#39;abbondanza campione per le analisi a valle. </li><li> Utilizzare 20% dell&#39;eluato in un Western blot per proteine ​​associate noti e 20% dell&#39;eluato per l&#39;isolamento di RNA seguita da RT qPCR. Il restante 60% può essere utilizzata per spettrometria di massa o per identificare componenti proteiche. </li><li> Parallelamente, sottoporre una aliquota del lisato cellulare riservata all&#39;isolamento RNA e analisi RT-PCR. Questo assessment fornisce un&#39;indicazione della arricchimento di RNA all&#39;interno di un complesso RNP. NOTA: Utilizzare la preparazione proteina isolata in un Western Blot di controllo per accertare che la scissione RNasi H è stato efficace nel liberare la RNP dal complesso immunuoprecipitated. </li></ol> 5. Analisi delle proteine ​​elettroforesi e Western Blot <ol><li> Oggetto circa il 10-20% del campione totale per SDS-PAGE e analisi immunoblot secondo il protocollo standard di laboratorio. NOTA: Questo passaggio serve per convalidare l&#39;efficienza IP e la specificità prima dell&#39;analisi RNA a valle. Può anche essere utilizzato per valutare la composizione proteica del complesso RNP isolato. </li></ol> 6. Raccolta del immunoprecipitato RNA NOTA: isolamento di RNA può essere fatto con il metodo Trizol o seguendo il protocollo descritto. <ol><li> Risospendere la metà del campione totale in 750 ml di acido reagente guanidinio tiocianato e incubare a T ambienteemperature per 5 minuti prima di estrarre l&#39;RNA dai complessi PCE-RNP catturati. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio al tubo, agitare vigorosamente per 10 secondi, e incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Dopo centrifugazione a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C, raccogliere la fase acquosa nel tubo di nuovo e aggiungere un uguale volume di isopropanolo. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min. Aggiungere 1 ml di blu glicole al campione e conservarlo a -20 ° C nel congelatore per la precipitazione o la trasformazione efficiente in una data futura. </li><li> Centrifugare la provetta a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante in modo da non disturbare il pellet di RNA; l&#39;uso di un p-200 punta micropipetta è raccomandato per facilitare questo processo. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% per ogni provetta, vortex e centrifugare le provette a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante come al punto 6.4. Aria-asciugare il pellet per 2-3 minuti e risospendere in 100 ml di acqua RNase-free. NOTA: Non prolungare il tempo gli air-asciuga pellet al fine di evitare un problema con la risospensione. </li><li> Applicare 100 ml di campione di RNA a una colonna clean-up RNA. Elaborarlo utilizzando il protocollo del produttore. Eluire l&#39;RNA in 30 ml di acqua RNase-free e conservare a -80 ° C per un massimo di 3 mesi. NOTA: Questo isolato l&#39;RNA è adatto per l&#39;analisi a valle mediante RT-PCR in tempo reale (qPCR), microarray, e RNA sequenziamento. A seconda della abbondanza del RNP e l&#39;efficienza con cui viene isolato il RNP di interesse, la stessa lisato può essere sottoposto a due o più cicli di IP per generare RNA sufficiente applicabile per le analisi a valle. </li></ol> 7. RNA trascrizione inversa e l&#39;amplificazione di cDNA mediante PCR <ol><li> Sottoporre il RNA isolato per trascrizione inversa da un primer casuale con un transcrittasi inversa di alta qualità (RT), secondo il manufale istruzioni del cturer. </li><li> Per amplificare l&#39;RNA di interesse, progettare un primer antisenso specifici geni all&#39;interno della sequenza scissione RNase H. Utilizzare gli importi simili della oligonucleotide antisenso, un primer a caso, o di un primer oligo-dT (vedi Materiali Tavolo). NOTA: Il primer oligo-dT e mRNA poli-adenylated forniscono le reazioni positive di controllo per le reazioni di RT-PCR. </li><li> Reserve 5% della reazione RT (1 ml) per un qPCR preparativa fatto in tandem con controllo negativo lisato IP e campioni di DNA positivo controllo per definire cutoff e produrre una curva standard. Se il valore CT del preparativo qPCR non rientra nella gamma della curva standard, diluire la reazione RT in consecutivi 1: 5 diluizioni e ripetere il punto 7.2. NOTA: Per una sequenza di RNA e la tecnica di spettrometria di massa, si prega di consultare il file metodo supplementare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Si prega di cliccare qui t</a>o visualizzare il file metodo supplementare. (Tasto destro del mouse per scaricare). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;isolamento RNP e la strategia di identificazione RNA cognate qui descritto è un mezzo selettivo di indagare una specifica interazione RNA-proteine ​​e di scoperta di proteine ​​candidate co-regolamentazione di un RNP specifica nelle cellule. Il vantaggio di utilizzare oligonucleotide-diretto RNase H scissione per isolare RNP è la capacità di catturare e analizzare il modo specifico cis-agendo elemento RNA RNP oltre RNP eterogenei legati a valle con l&#39;elemento RNA cis-agenti di inte...

genica post-trascrizionale è regolato con precisione, cominciando con la trascrizione del DNA nel nucleo. Controllato da RNA vincolante proteine (RBPs), mRNA biogenesi e il metabolismo si verificano in particelle ribonucleoproteiche altamente dinamici (RNP), che associano e dissociano con un mRNA substrato precursore durante la progressione di RNA metabolismo 1-3. cambiamenti dinamici nella componenti RNP influenzano il destino post-trascrizionale di mRNA e di fornire la garanzia della qualità durante la lavorazione dei trascritti primari, i loro traffici nucleari e la localizzazione, la loro attività come modelli di mRNA per la traduzione, e l&#39;eventuale fatturato di mRNA maturi. Numerose proteine sono designati come RBPs in virtù dei loro domini ammino acido conservato, tra cui il motivo di riconoscimento RNA (RRM), l&#39;RNA a doppio filamento dominio di legame (REA), e tratti di residui basici (ad esempio, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs sono di routineisolato da strategie di immunoprecipitazione e sono proiettati per identificare i loro RNA cognate. Alcuni RBPs co-regolare pre-mRNA che sono funzionalmente correlati, designati come regulons RNA 5-8. Questi RBPs, i loro mRNA cognate, e talvolta non codificante RNA, formano RNP catalitici che variano in composizione; loro unicità è dovuta a varie combinazioni di fattori associati, nonché al temporale sequenza, posizione, e la durata delle loro interazioni 9. RNA immunoprecipitazione (RIP) è una tecnica potente per isolare RNP dalle cellule e per identificare le trascrizioni associati con analisi di sequenza 10-13. Passando da candidato a Genome-wide screening è possibile attraverso RIP combinato con un&#39;analisi microarray 14 o high-throughput sequencing (RNA-Seq) 15. Analogamente, proteine co-precipitazione possono essere identificate mediante spettrometria di massa, se sono sufficientemente abbondanti e separabili dal anticorpi co-precipitazione 16,17. Qui, ci rivolgiamo la metodologia per isolare i componenti RNP di una specifica RNA affine da cellule umane in coltura, anche se l&#39;approccio è alterabile per lisati solubili di cellule vegetali, funghi, virus e batteri. Analisi a valle del materiale comprendono l&#39;identificazione candidato e validazione mediante immunoblot, spettrometria di massa, saggio enzimatico biochimico, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, come riassunto in Figura 1. Dato il ruolo fondamentale della RNP nel controllare l&#39;espressione genica a livello post-trascrizionale, alterazioni nell&#39;espressione dei RBPs componenti o la loro accessibilità alle cognate RNA possono essere dannosi per la cellula e sono associati a diversi tipi di disturbi, malattie neurologiche 18. DHX9 / RNA elicasi A (RHA) è necessario per la traduzione di mRNA selezionati di origini cellulari e retrovirali 6. Questi RNA affini presentano strutturalmente affini elementi cis-agenti nel loro5 &#39;UTR, che è designato come elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 19. Attività RHA-PCE è necessaria per la traduzione efficiente cap-dipendente di molti retrovirus, compreso l&#39;HIV-1, e di geni regolatori crescita, tra Jund 6,20,21. Codificata da un gene essenziale (dhx9), RHA è essenziale per la proliferazione cellulare e la sua down-regolazione elimina la vitalità delle cellule 22. L&#39;analisi molecolare di RHA-PCE RNP è un passo essenziale per comprendere il motivo per cui l&#39;attività RHA-PCE è necessario controllare la proliferazione cellulare. La caratterizzazione precisa dei componenti RNP RHA-PCE allo stato stazionario o su perturbazione fisiologica della cella richiede l&#39;arricchimento selettivo e la cattura delle RNPs RHA-PCE in abbondanza sufficiente per l&#39;analisi a valle. Qui, retrovirale PCEgag RNA è stato etichettato con 6 copie del cis-acting sito di legame RNA per la proteina di rivestimento MS2 (CP) all&#39;interno della cornice di lettura aperta. La proteina di rivestimento MS2 è stato exogenously co-espresso con PCEgag RNA dal plasmide trasfezione per facilitare l&#39;assemblaggio RNP in cellule in crescita. RNP contenenti la proteina di rivestimento MS2 con cognate MS2-tag PCEgag RNA sono stati immunoprecipitati dall&#39;estratto cellulare e catturati su sfere magnetiche (Figura 2a). Per catturare selettivamente i componenti RNP legati alla PCE, l&#39;RNP immobilizzato è stato incubato con un oligonucleotide complementare alle sequenze distali alla PCE, formando un ibrido RNA-DNA che è il substrato per l&#39;attività RNasi H. Poiché PCE è posizionato in &#39;terminale 5&#39; del 5 untranslated regione, l&#39;oligonucleotide era complementare alle sequenze di RNA adiacenti al sito di inizio traduzione retrovirale (gag codone di inizio). RNase H scissione in prossimità della partenza gag codone rilasciato complesso UTR 5 &#39;dalla RNP immobilizzata, che è stato raccolto come eluente. Successivamente, il campione è stato valutato mediante RT-PCR per confermare la cattura di PCEgag e SDS PAGE e immunoblotting per confermare la capture della proteina di rivestimento bersaglio MS2. Una convalida del legame RNA proteina PCE-associata, DHX9 / RNA elicasi A, è stata quindi eseguita.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-RHA</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reagente</td><td>Tecnologia</td> <td>della vita10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNasi H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di pulizia RNaeasy</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa omniscript</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNasi Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Primer per esameri casuali</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Primer Oligo-dT</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>Primer PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer specifici per gene Amplificazione PCR</td></tr><tr><td>Oligonucleotide per scissione mediata da RNasi H</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer antisenso per RNA bersaglio</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Tecnologia Gibco Life</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura tissutale DMEM</td><td>Tecnologia Gibco Life</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Tecnologia Gibco Life</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>base Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td></td><td></td><td>Portaprovette per microcentrifuga da 1,7 ml</td></tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td> laminare <td>Per la coltura di tessuti animali</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td><td></td> CO2 <td>Per la coltura di tessuti animali</td></tr><tr>Apparato <td></td><td></td> su<td>gel proteico</td><td>Separazione di campioni di proteine</td></tr><tr><td>Apparecchio</td><td></td><td></td> per il trasferimento di proteine <td>Trasferimento di campioni di proteine</td></tr><tr><td>Pronto all'uso gel proteici (4-15%)</td><td></td><td></td><td>Separazione del campione di proteine</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> da tavolo <td>Pellet verso il basso il campione</td></tr><tr><td>Rotatore</td><td></td><td></td> da tavolo <td>Mescolare il campione da un capo all'altro</td></tr><tr><td>Vortice</td><td></td><td></td><td>Mescolare i campioni</td></tr></tbody></table>

isolamento di cognate complessi rna-proteina da cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Le particelle ribonucleoproteiche dirigono la biogenesi e la regolazione post-trascrizionale di tutti gli mRNA attraverso combinazioni distinte di proteine leganti l'RNA. Sono composti da elementi di RNA cis-agenti dipendenti dalla posizione e da combinazioni uniche di proteine leganti l'RNA. Definire la composizione di uno specifico RNP è essenziale per raggiungere una comprensione fondamentale della regolazione genica. L'isolamento di un RNP selezionato è simile a trovare un ago in un pagliaio. Qui, dimostriamo un approccio per isolare gli RNP associati alla regione 5' non tradotta di un mRNA selezionato in cellule asincrone e trasfettate. È stato dimostrato che questo RNP affine è necessario per la traduzione di virus selezionati e geni cellulari di risposta allo stress.
Il protocollo di co-precipitazione RNA-proteina dimostrato è adatto per l'analisi a valle di componenti proteici attraverso analisi proteomiche, immunoblots o opportuni saggi di identificazione biochimica. Questo protocollo sperimentale dimostra che l'elicasi A di DHX9/RNA è arricchita all'estremità 5' dell'RNA retrovirale affine e fornisce informazioni preliminari per l'identificazione della sua associazione con gli mRNA affini huR e junD associati allo stress cellulare.

Risultati RIP precedenti identificati RNA gag retrovirali e selezionati RNA cellulari che la co-precipitato con DHX9 / RHA, compreso l'HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, inedito). Il retrovirale 5 'UTR è stata dimostrata a co-precipitato con DHX9 / RHA nel nucleo e di co-isolare nel citoplasma in poliribosomi. Si è univocamente definita come la CSI -acting elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 6. Per isolare PCEgag RNA-RHA com...

Questo manoscritto descrive un approccio per isolare RNP affini selezionati formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Dimostriamo l'applicabilità di questo approccio isolando un RNP affine legato alla regione retrovirale 5' non tradotta che è composta da DHX9/RNA elicasi A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di immunoprecipitazione dell'RNA è quello di isolare e caratterizzare selettivamente complessi proteici endogeni di RNA formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del controllo post-trascrizionale, come la composizione delle proteine leganti l'RNA che definiscono i cinque UTR principali di un trascritto retrovirale per regolarne l'espressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di isolare e caratterizzare selettivamente uno specifico complesso proteico di RNA di interesse, pur mantenendo la possibilità di condurre un'analisi più globale dell'RNP a valle.Ebbene, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione fondamentale delle infezioni virali e di numerose malattie cellulari. E fornisce informazioni significative sui meccanismi del controllo post-trascrizionale dell'espressione genica. Ciò potrebbe significare nuovi bersagli farmacologici praticabili.Dopo aver coltivato le cellule ed effettuato l'immunoprecipitazione di una proteina marcata con FLAG secondo il p

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A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e...

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con...

Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

In questo video, descriviamo l'evoluzione sistematica dei ligandi con il metodo dell'arricchimento esponenziale (SELEX) per identificare specifiche sequenze leganti l'RNA per una proteina bersaglio di interesse. La proteina viene incubata con un ampio pool di sequenze di RNA randomizzate e le sequenze di RNA leganti la proteina vengono isolate, amplificate con PCR e sequenziate per identificare i loro siti di legame proteico.

Saggio di legame in vitro basato su SELEX per identificare le interazioni RNA-proteina

Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Questo metodo di discesa di RNA permette di identificare i bersagli di RNA di un RNA lunghi non codificanti (lncRNA). Basato sull'ibridazione di fatto in casa, progettato anti-senso del DNA del oligonucleotide sonde specifiche per questo lncRNA in un tessuto opportunamente fisso o linea cellulare, in modo efficiente permette la cattura di tutti i target di RNA della lncRNA.

Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

È descritta una procedura di isolamento di RNA (viaggio) tandem per il recupero dei complessi in modo endogeno formato mRNA-proteina. In particolare, complessi RNA-proteina sono reticolate in vivo, poliadenilazione RNAs sono isolati dagli estratti con i branelli di oligo e particolare mRNA vengono catturati con oligonucleotidi antisenso RNA modificati. Proteine legate a mRNA vengono rilevati dall'analisi del immunoblot.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.

Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

Qui, descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell'elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Impara l'isolamento di complessi RNA-proteina endogeni dalle cellule eucariote mediante arricchimento diretto da oligonucleotidi. Questo metodo consente di caratterizzare specifici RNP coinvolti nel controllo post-trascrizionale dell'espressione genica virale.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

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