Name: Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Impara l'isolamento di complessi RNA-proteina endogeni dalle cellule eucariote mediante arricchimento diretto da oligonucleotidi. Questo metodo consente di caratterizzare specifici RNP coinvolti nel controllo post-trascrizionale dell'espressione genica virale.

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Gli autori ringraziano il supporto dal NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Composizioni Buffer </td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio: </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> Basso sale Buffer: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 10 mM NaCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 1x inibitore della proteasi cocktail senza EDTA </td></tr><tr><td> RNase Out 5 ml / ml (inibitore RNasi) </td></tr><tr><td> Citoplasmatica Lysis Buffer: </td></tr><tr><td> 0.2 M saccarosio </td></tr><tr><td> 1,2% Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETn-150 tampone di lavaggio: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 mmNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% NP-40 </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 10% di glicerina </td></tr><tr><td> Binding Buffer: </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES pH 7,6 </td></tr><tr><td> 40 mM KCl </td></tr><tr><td> 3 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 5% glicerolo </td></tr></tbody></table> Tabella 2: composizioni Buffer. 1. Preparazione delle cellule e la matrice di affinità <ol><li> Culture una linea cellulare di interesse per sub-confluenza (80%) in un piatto 10 cm. Usare piatti 10 cm per immunoprecipitazione indipendenti (IP) di una proteina di rivestimento NLS-MS2 FLAG-tag. Eseguire l&#39;IP utilizzando antisieri al tag FLAG-epitope. Nell&#39;esprimere il MS2 proteina di rivestimento plasmide FLAG-tagged, trasfezione le cellule 24-48 ore in anticipo del raccolto 20. NOTA: Un particolare RNP può essere arricchito dal nucleare o citoplasmalisati ic o un preparato biochimicamente-frazionata, come frazioni di un gradiente di saccarosio. Si raccomanda di raccogliere il lisato da cellule non transfettate in parallelo ad istituire un controllo negativo aggiuntivo. </li><li> Trasferimento 60 ml per IP di proteine ​​G tallone magnetico liquami in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga. </li><li> Posizionare il tubo su un rack calamita per provette da microcentrifuga per separare le perline dalla soluzione di storage. </li><li> Rimuovere la soluzione di archiviazione disegnando con attenzione in su con una micropipetta. </li><li> Rimuovere il tubo dal rack magnete. </li><li> Lavare ed equilibrare le perline con 600 microlitri (10 volte il volume usato di perline) di 1x tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl 2, e 150 mM NaCl) e end-over-end di rotazione per 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio. </li><li> Aggiungere 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e immunoprecipitating anticorpi bandiera alle pr equilibratobiglie magnetiche otein G (secondo la quantità raccomandata dal produttore per un immunoprecipitazione) e ruotare end-over-end a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per coniugare l&#39;anticorpo immunoprecipitating. Utilizzare il corrispondente IgG isotipo come controllo negativo adatto anticorpi. </li><li> Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante. </li><li> Rimuovere il tubo dal rack magnete e lavare le perline anticorpo coniugato con 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e la rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio. </li></ol> 2. La raccolta della RNP NOTA: Preparare le RNP durante il tempo di incubazione dopo passo 1.8. <ol><li> Rimuovere terreno di coltura dalle cellule mediante aspirazione e lavare le cellule due volte con 1-5 ml di 1x ghiacciata PBS (PBS). Utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere bagnato,cellule aderenti precedenti la raccolta per centrifugazione a 226 xg per 4 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 375 ml di ghiacciata, buffer di basso contenuto di sale (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT; 1x proteasi-inibitore cocktail, senza EDTA e 5 ml / ml RNase Inhibitor) al pellet e consentire gonfiore ponendolo in ghiaccio per 5 min. NOTA: sarto il volume di tampone basso contenuto di sale in funzione delle dimensioni del pellet. Per 1,2 x 10 6 cellule da una piastra 10 cm 375 microlitri di tampone è sufficiente. </li><li> Per raccogliere il lisato cellulare citoplasmatica, aggiungere 125 ml di tampone di lisi ghiacciata (0,2 M di saccarosio / 1,2% Triton X-100), e quindi eseguire 10 colpi con un omogeneizzatore Dounce che è stato pre-raffreddata in un secchiello del ghiaccio. NOTA: per raccogliere il estratto cellulare totale, tampone di lisi standard di RIPA è raccomandato per solubilizzare nucleoplasma / cromatina. </li><li> Spin in una microcentrifuga alla massima velocità (16.000 xg) per 1 min; questo sarà chiaro il supernatante di detriti unnuclei ND. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1.7 ml che è stato sul ghiaccio. Determinare la concentrazione totale di proteine da una norma, metodo di laboratorio-preferito, come il Bradford Assay 23. Prenotare una aliquota di almeno il 10% per analisi Western blot, per essere usato come un controllo di input. Utilizzare il lisato cellulare raccolto immediatamente per immunoprecipitazione o conservarlo a -80 ° C per le analisi future. NOTA: Nella nostra esperienza, i campioni possono essere conservati e utilizzati alcuni mesi dopo per l&#39;analisi immunoprecipitazione, senza un compromesso di integrità. </li></ol> 3. immunoprecipitazione <ol><li> Aggiungere il volume desiderato del lisato cellulare raccolto, in base alla concentrazione proteica determinata nel passo 2.5, all&#39;obiettivo perline anticorpo-coniugato. Utilizzando tampone di lavaggio 1x, portare il volume totale a 600 microlitri e ruotare end-over-end per 90 min a temperatura ambiente. NOTA: Questo periodo di tempo è sufficiente per generareun isolamento robusto ad alta affinità complessi RNP, riducendo al minimo legame non specifico. Diluire fonti RNP alternative, come frazioni di un gradiente di saccarosio, di almeno 1: 1 con tampone di lavaggio 1x, e poi incubare con complessi branello-anticorpo precedentemente preparato, come detto sopra. </li><li> Dopo 90 min di incubazione, porre la provetta IP sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline. Riserva la surnatante come flusso continuo. NOTA: Questo primo flusso continuo è un campione di controllo importante per misurare l&#39;efficienza IP. Un saggio immunoenzimatico fornirà un&#39;indicazione dell&#39;efficienza IP, nonché la specificità delle interazioni indagate. Si consiglia di mantenere questo surnatante per l&#39;analisi a valle. </li><li> Lavare le, perline anticorpo-coniugato RNP-bound con 10 volumi (600 microlitri) di NETn-150 tampone di lavaggio ghiacciata (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 3 mM MgCl 2; 0,5% NP40; e 10% glicerolo) in rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 3 volte. NOTA: Questo buffer differisce dal buffer di lisi e riduce effettivamente associazioni deboli o non specifici. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere i complessi RNP immobilizzate in 60 ml di 1x tampone ghiacciata vincolante (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl, 3 mM MgCl 2; 5% glicerolo e 2 mM DTT) e riserva del 10% delle perline complessi immobilizzati per Western blot e 20% per l&#39;isolamento di RNA. </li></ol> 4. eluizione <ol><li> Regolare il volume residuo di 100 microlitri con 1x tampone di legame ghiacciato e riscaldare il tubo a 70 ° C per 3 min. </li><li> Per isolare affini complessi RNA-proteina, aggiungere un ~ 30 nt DNA oligonucleotide complementare al confine 3 &#39;la sequenza di RNA di interesse e incubare per 30 min a temperatura ambiente con delicata dondolo (100 nM di oligonucleotide è sufficiente). NOTA: L&#39;oligonucleotide antisenso è ai residui nucleotidici adiacenti alla traduzione start-site del costrutto PCE utilizzato come example in questo protocollo. Appropriata complementarità sequenza viene fornito dalla ~ contenuto di GC del 40%. Progettare l&#39;oligonucleotide antisenso per l&#39;ibridazione efficiente alla regione minima complementare del RNA bersaglio. </li><li> Aggiungere 5-10 unità di RNasi H al tubo ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora per scindere l&#39;RNA del RNA: DNA ibrido. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga sterili; questo campione contiene i complessi RNP catturati di interesse. NOTA: A seconda della accessibilità del RNA cognate, due o più cicli di trattamento RNase H possono essere utili per aumentare l&#39;abbondanza campione per le analisi a valle. </li><li> Utilizzare 20% dell&#39;eluato in un Western blot per proteine ​​associate noti e 20% dell&#39;eluato per l&#39;isolamento di RNA seguita da RT qPCR. Il restante 60% può essere utilizzata per spettrometria di massa o per identificare componenti proteiche. </li><li> Parallelamente, sottoporre una aliquota del lisato cellulare riservata all&#39;isolamento RNA e analisi RT-PCR. Questo assessment fornisce un&#39;indicazione della arricchimento di RNA all&#39;interno di un complesso RNP. NOTA: Utilizzare la preparazione proteina isolata in un Western Blot di controllo per accertare che la scissione RNasi H è stato efficace nel liberare la RNP dal complesso immunuoprecipitated. </li></ol> 5. Analisi delle proteine ​​elettroforesi e Western Blot <ol><li> Oggetto circa il 10-20% del campione totale per SDS-PAGE e analisi immunoblot secondo il protocollo standard di laboratorio. NOTA: Questo passaggio serve per convalidare l&#39;efficienza IP e la specificità prima dell&#39;analisi RNA a valle. Può anche essere utilizzato per valutare la composizione proteica del complesso RNP isolato. </li></ol> 6. Raccolta del immunoprecipitato RNA NOTA: isolamento di RNA può essere fatto con il metodo Trizol o seguendo il protocollo descritto. <ol><li> Risospendere la metà del campione totale in 750 ml di acido reagente guanidinio tiocianato e incubare a T ambienteemperature per 5 minuti prima di estrarre l&#39;RNA dai complessi PCE-RNP catturati. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio al tubo, agitare vigorosamente per 10 secondi, e incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Dopo centrifugazione a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C, raccogliere la fase acquosa nel tubo di nuovo e aggiungere un uguale volume di isopropanolo. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min. Aggiungere 1 ml di blu glicole al campione e conservarlo a -20 ° C nel congelatore per la precipitazione o la trasformazione efficiente in una data futura. </li><li> Centrifugare la provetta a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante in modo da non disturbare il pellet di RNA; l&#39;uso di un p-200 punta micropipetta è raccomandato per facilitare questo processo. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% per ogni provetta, vortex e centrifugare le provette a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante come al punto 6.4. Aria-asciugare il pellet per 2-3 minuti e risospendere in 100 ml di acqua RNase-free. NOTA: Non prolungare il tempo gli air-asciuga pellet al fine di evitare un problema con la risospensione. </li><li> Applicare 100 ml di campione di RNA a una colonna clean-up RNA. Elaborarlo utilizzando il protocollo del produttore. Eluire l&#39;RNA in 30 ml di acqua RNase-free e conservare a -80 ° C per un massimo di 3 mesi. NOTA: Questo isolato l&#39;RNA è adatto per l&#39;analisi a valle mediante RT-PCR in tempo reale (qPCR), microarray, e RNA sequenziamento. A seconda della abbondanza del RNP e l&#39;efficienza con cui viene isolato il RNP di interesse, la stessa lisato può essere sottoposto a due o più cicli di IP per generare RNA sufficiente applicabile per le analisi a valle. </li></ol> 7. RNA trascrizione inversa e l&#39;amplificazione di cDNA mediante PCR <ol><li> Sottoporre il RNA isolato per trascrizione inversa da un primer casuale con un transcrittasi inversa di alta qualità (RT), secondo il manufale istruzioni del cturer. </li><li> Per amplificare l&#39;RNA di interesse, progettare un primer antisenso specifici geni all&#39;interno della sequenza scissione RNase H. Utilizzare gli importi simili della oligonucleotide antisenso, un primer a caso, o di un primer oligo-dT (vedi Materiali Tavolo). NOTA: Il primer oligo-dT e mRNA poli-adenylated forniscono le reazioni positive di controllo per le reazioni di RT-PCR. </li><li> Reserve 5% della reazione RT (1 ml) per un qPCR preparativa fatto in tandem con controllo negativo lisato IP e campioni di DNA positivo controllo per definire cutoff e produrre una curva standard. Se il valore CT del preparativo qPCR non rientra nella gamma della curva standard, diluire la reazione RT in consecutivi 1: 5 diluizioni e ripetere il punto 7.2. NOTA: Per una sequenza di RNA e la tecnica di spettrometria di massa, si prega di consultare il file metodo supplementare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Si prega di cliccare qui t</a>o visualizzare il file metodo supplementare. (Tasto destro del mouse per scaricare). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;isolamento RNP e la strategia di identificazione RNA cognate qui descritto è un mezzo selettivo di indagare una specifica interazione RNA-proteine ​​e di scoperta di proteine ​​candidate co-regolamentazione di un RNP specifica nelle cellule. Il vantaggio di utilizzare oligonucleotide-diretto RNase H scissione per isolare RNP è la capacità di catturare e analizzare il modo specifico cis-agendo elemento RNA RNP oltre RNP eterogenei legati a valle con l&#39;elemento RNA cis-agenti di inte...

genica post-trascrizionale è regolato con precisione, cominciando con la trascrizione del DNA nel nucleo. Controllato da RNA vincolante proteine (RBPs), mRNA biogenesi e il metabolismo si verificano in particelle ribonucleoproteiche altamente dinamici (RNP), che associano e dissociano con un mRNA substrato precursore durante la progressione di RNA metabolismo 1-3. cambiamenti dinamici nella componenti RNP influenzano il destino post-trascrizionale di mRNA e di fornire la garanzia della qualità durante la lavorazione dei trascritti primari, i loro traffici nucleari e la localizzazione, la loro attività come modelli di mRNA per la traduzione, e l&#39;eventuale fatturato di mRNA maturi. Numerose proteine sono designati come RBPs in virtù dei loro domini ammino acido conservato, tra cui il motivo di riconoscimento RNA (RRM), l&#39;RNA a doppio filamento dominio di legame (REA), e tratti di residui basici (ad esempio, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs sono di routineisolato da strategie di immunoprecipitazione e sono proiettati per identificare i loro RNA cognate. Alcuni RBPs co-regolare pre-mRNA che sono funzionalmente correlati, designati come regulons RNA 5-8. Questi RBPs, i loro mRNA cognate, e talvolta non codificante RNA, formano RNP catalitici che variano in composizione; loro unicità è dovuta a varie combinazioni di fattori associati, nonché al temporale sequenza, posizione, e la durata delle loro interazioni 9. RNA immunoprecipitazione (RIP) è una tecnica potente per isolare RNP dalle cellule e per identificare le trascrizioni associati con analisi di sequenza 10-13. Passando da candidato a Genome-wide screening è possibile attraverso RIP combinato con un&#39;analisi microarray 14 o high-throughput sequencing (RNA-Seq) 15. Analogamente, proteine co-precipitazione possono essere identificate mediante spettrometria di massa, se sono sufficientemente abbondanti e separabili dal anticorpi co-precipitazione 16,17. Qui, ci rivolgiamo la metodologia per isolare i componenti RNP di una specifica RNA affine da cellule umane in coltura, anche se l&#39;approccio è alterabile per lisati solubili di cellule vegetali, funghi, virus e batteri. Analisi a valle del materiale comprendono l&#39;identificazione candidato e validazione mediante immunoblot, spettrometria di massa, saggio enzimatico biochimico, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, come riassunto in Figura 1. Dato il ruolo fondamentale della RNP nel controllare l&#39;espressione genica a livello post-trascrizionale, alterazioni nell&#39;espressione dei RBPs componenti o la loro accessibilità alle cognate RNA possono essere dannosi per la cellula e sono associati a diversi tipi di disturbi, malattie neurologiche 18. DHX9 / RNA elicasi A (RHA) è necessario per la traduzione di mRNA selezionati di origini cellulari e retrovirali 6. Questi RNA affini presentano strutturalmente affini elementi cis-agenti nel loro5 &#39;UTR, che è designato come elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 19. Attività RHA-PCE è necessaria per la traduzione efficiente cap-dipendente di molti retrovirus, compreso l&#39;HIV-1, e di geni regolatori crescita, tra Jund 6,20,21. Codificata da un gene essenziale (dhx9), RHA è essenziale per la proliferazione cellulare e la sua down-regolazione elimina la vitalità delle cellule 22. L&#39;analisi molecolare di RHA-PCE RNP è un passo essenziale per comprendere il motivo per cui l&#39;attività RHA-PCE è necessario controllare la proliferazione cellulare. La caratterizzazione precisa dei componenti RNP RHA-PCE allo stato stazionario o su perturbazione fisiologica della cella richiede l&#39;arricchimento selettivo e la cattura delle RNPs RHA-PCE in abbondanza sufficiente per l&#39;analisi a valle. Qui, retrovirale PCEgag RNA è stato etichettato con 6 copie del cis-acting sito di legame RNA per la proteina di rivestimento MS2 (CP) all&#39;interno della cornice di lettura aperta. La proteina di rivestimento MS2 è stato exogenously co-espresso con PCEgag RNA dal plasmide trasfezione per facilitare l&#39;assemblaggio RNP in cellule in crescita. RNP contenenti la proteina di rivestimento MS2 con cognate MS2-tag PCEgag RNA sono stati immunoprecipitati dall&#39;estratto cellulare e catturati su sfere magnetiche (Figura 2a). Per catturare selettivamente i componenti RNP legati alla PCE, l&#39;RNP immobilizzato è stato incubato con un oligonucleotide complementare alle sequenze distali alla PCE, formando un ibrido RNA-DNA che è il substrato per l&#39;attività RNasi H. Poiché PCE è posizionato in &#39;terminale 5&#39; del 5 untranslated regione, l&#39;oligonucleotide era complementare alle sequenze di RNA adiacenti al sito di inizio traduzione retrovirale (gag codone di inizio). RNase H scissione in prossimità della partenza gag codone rilasciato complesso UTR 5 &#39;dalla RNP immobilizzata, che è stato raccolto come eluente. Successivamente, il campione è stato valutato mediante RT-PCR per confermare la cattura di PCEgag e SDS PAGE e immunoblotting per confermare la capture della proteina di rivestimento bersaglio MS2. Una convalida del legame RNA proteina PCE-associata, DHX9 / RNA elicasi A, è stata quindi eseguita.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-RHA</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reagente</td><td>Tecnologia</td> <td>della vita10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNasi H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di pulizia RNaeasy</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa omniscript</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNasi Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Primer per esameri casuali</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Primer Oligo-dT</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>Primer PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer specifici per gene Amplificazione PCR</td></tr><tr><td>Oligonucleotide per scissione mediata da RNasi H</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer antisenso per RNA bersaglio</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Tecnologia Gibco Life</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura tissutale DMEM</td><td>Tecnologia Gibco Life</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Tecnologia Gibco Life</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>base Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td></td><td></td><td>Portaprovette per microcentrifuga da 1,7 ml</td></tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td> laminare <td>Per la coltura di tessuti animali</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td><td></td> CO2 <td>Per la coltura di tessuti animali</td></tr><tr>Apparato <td></td><td></td> su<td>gel proteico</td><td>Separazione di campioni di proteine</td></tr><tr><td>Apparecchio</td><td></td><td></td> per il trasferimento di proteine <td>Trasferimento di campioni di proteine</td></tr><tr><td>Pronto all'uso gel proteici (4-15%)</td><td></td><td></td><td>Separazione del campione di proteine</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> da tavolo <td>Pellet verso il basso il campione</td></tr><tr><td>Rotatore</td><td></td><td></td> da tavolo <td>Mescolare il campione da un capo all'altro</td></tr><tr><td>Vortice</td><td></td><td></td><td>Mescolare i campioni</td></tr></tbody></table>

isolamento di cognate complessi rna-proteina da cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Le particelle ribonucleoproteiche dirigono la biogenesi e la regolazione post-trascrizionale di tutti gli mRNA attraverso combinazioni distinte di proteine leganti l'RNA. Sono composti da elementi di RNA cis-agenti dipendenti dalla posizione e da combinazioni uniche di proteine leganti l'RNA. Definire la composizione di uno specifico RNP è essenziale per raggiungere una comprensione fondamentale della regolazione genica. L'isolamento di un RNP selezionato è simile a trovare un ago in un pagliaio. Qui, dimostriamo un approccio per isolare gli RNP associati alla regione 5' non tradotta di un mRNA selezionato in cellule asincrone e trasfettate. È stato dimostrato che questo RNP affine è necessario per la traduzione di virus selezionati e geni cellulari di risposta allo stress.
Il protocollo di co-precipitazione RNA-proteina dimostrato è adatto per l'analisi a valle di componenti proteici attraverso analisi proteomiche, immunoblots o opportuni saggi di identificazione biochimica. Questo protocollo sperimentale dimostra che l'elicasi A di DHX9/RNA è arricchita all'estremità 5' dell'RNA retrovirale affine e fornisce informazioni preliminari per l'identificazione della sua associazione con gli mRNA affini huR e junD associati allo stress cellulare.

Risultati RIP precedenti identificati RNA gag retrovirali e selezionati RNA cellulari che la co-precipitato con DHX9 / RHA, compreso l'HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, inedito). Il retrovirale 5 'UTR è stata dimostrata a co-precipitato con DHX9 / RHA nel nucleo e di co-isolare nel citoplasma in poliribosomi. Si è univocamente definita come la CSI -acting elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 6. Per isolare PCEgag RNA-RHA com...

Questo manoscritto descrive un approccio per isolare RNP affini selezionati formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Dimostriamo l'applicabilità di questo approccio isolando un RNP affine legato alla regione retrovirale 5' non tradotta che è composta da DHX9/RNA elicasi A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di immunoprecipitazione dell'RNA è quello di isolare e caratterizzare selettivamente complessi proteici endogeni di RNA formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del controllo post-trascrizionale, come la composizione delle proteine leganti l'RNA che definiscono i cinque UTR principali di un trascritto retrovirale per regolarne l'espressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di isolare e caratterizzare selettivamente uno specifico complesso proteico di RNA di interesse, pur mantenendo la possibilità di condurre un'analisi più globale dell'RNP a valle.Ebbene, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione fondamentale delle infezioni virali e di numerose malattie cellulari. E fornisce informazioni significative sui meccanismi del controllo post-trascrizionale dell'espressione genica. Ciò potrebbe significare nuovi bersagli farmacologici praticabili.Dopo aver coltivato le cellule ed effettuato l'immunoprecipitazione di una proteina marcata con FLAG secondo il protocollo di testo, trasferire 60 microlitri per IP di liquame di perle magnetiche pro-TG in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Posizionare la provetta su un rack magnetico e rimuovere la soluzione di conservazione pipettandola accuratamente. Quindi rimuovere la provetta dal rack.Aggiungere 600 microlitri di 1x tampone di lavaggio. E posizionare il tubo su un rotatore a temperatura ambiente per tre minuti, per lavare ed equilibrare le perle. Posizionare il tubo sulla griglia magnetica e rimuovere il tampone di lavaggio.Quindi aggiungere 10 volumi di fresco tampone di lavaggio 1x. Aggiungere l'anticorpo immunoprecipitante FLAG alle microsfere magnetiche pro-TG equilibrate. E poi ruotare la provetta a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, per coniugare l'anticorpo immunoprecipitante.Posizionare il tubo sul magnete e rimuovere il surnatante. Quindi rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 1x tampone di lavaggio alle perline e ruotare a temperatura ambiente per tre minuti. Ripetere la fase di lavaggio due volte e rimuovere il tampone finale.Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule mediante aspirazione e utilizzare 1,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule due volte. Con un raschietto cellulare rimuovere le celle bagnate e aderenti. Pipettare la sospensione cellulare in provette fresche e quindi centrifugare la coltura a 226 volte G a quattro gradi Celsius, per quattro minuti.Aggiungere 375 microlitri di tampone a basso contenuto di sale ghiacciato al pellet cellulare e incubare il campione su ghiaccio per cinque minuti per consentire il rigonfiamento. È importante prestare attenzione quando si aggiunge e si risospende il pellet di cella nel tampone di lisi a basso contenuto di sale, per garantire la completa immersione e il rigonfiamento senza interruzioni meccaniche premature. Per raccogliere il lisato cellulare citoplasmatico, aggiungere 125 microlitri di tampone di lisi ghiacciato, quindi utilizzare un omogeneizzatore Dounce pre-raffreddato per eseguire dieci colpi.Omogeneizzare a fondo con una forza sufficiente a consentire la lisi della membrana plasmatica e i contaminanti del lisato citoplasmatico rilasciato. Ma fare attenzione a non estendere eccessivamente l'interruzione meccanica e rischiare contaminazioni nucleari, interruzione del complesso proteico RNA o perdita di spin rilasciato l'omogenato in una microfuga alla massima velocità per un minuto. Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,7 millilitri che è stato congelato.Determinare la concentrazione proteica totale. Riserva del 10% per l'analisi del western blot, da utilizzare come controllo dell'input. Per eseguire l'immunoprecipitazione, aggiungere il volume desiderato di lisato cellulare raccolto alle perle coniugate con anticorpi bersaglio.Utilizzando 1x tampone di lavaggio, portare il volume totale fino a 600 microlitri e ruotare il campione a temperatura ambiente. Dopo 90 minuti di incubazione, posizionare il tubo IP sul supporto magnetico per raccogliere le perle. Quindi raccogli il surnatante e conservalo come flusso.Quindi, aggiungere 10 volumi di tampone di lavaggio NETN 150 ghiacciato alle perle coniugate con anticorpi legate all'RNP e ruotare il campione a temperatura ambiente per tre minuti. Dopo aver risospeso i complessi RNP immobilizzati in un tampone di legame 1x secondo il protocollo di testo, regolare il volume rimanente in 100 microlitri di tampone di legame 1x ghiacciato. E scaldare il tubo a 70 gradi Celsius per tre minuti.Per isolare complessi proteici di RNA affini, aggiungere un oligo di DNA di circa 30 nucleotidi, complementare al limite delle tre sequenze prime dell'RNA di interesse. E incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con un leggero dondolio. Aggiungere da cinque a dieci unità di RNasi H alla provetta e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora per scindere l'RNA dall'ibrido RNA DNA.Quindi trasferire il surnatante contenente i complessi RNP catturati di interesse in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Per raccogliere l'RNA immunoprecipitato, risospendere metà del campione totale di complessi di RNA catturati in 750 microlitri di reagente tiocianato di guanidinio acido. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio alla provetta, agitare energicamente per 10 secondi e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.Dopo la centrifugazione, raccogliere la fase acquosa in una provetta nuova e aggiungere un volume uguale di isopropanolo. Mescolare bene e incubare il campione a temperatura ambiente per almeno dieci minuti. Aggiungere un microlitro di glicole blu al campione e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per una precipitazione o un'elaborazione efficiente in una data futura.Centrifugare la provetta a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per dieci minuti. Utilizzare una micropipetta P200 per raccogliere e scartare con cura il surnatante in modo da non disturbare il pellet di RNA. Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% in ogni tubo.Agitare e centrifugare le provette per cinque minuti. Raccogliere e scartare con cura il surnatante come appena dimostrato. Asciugare il pellet all'aria per due o tre minuti e utilizzare 100 microlitri di acqua priva di RNasi per rimetterlo in sospensione.Applicare 100 microlitri del campione di RNA su una colonna di pulizia dell'RNA. Ed elaborarlo secondo il protocollo del produttore. Infine, eluire l'RNA in 30 microlitri di acqua priva di RNasi e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di tre mesi.Per isolare elementi di controllo post-trascrizionale, o complessi ribonucleoproteici PCE, GAG, RNA, RHA formati in cellule proliferanti. L'immunoprecipitazione dell'RNP FLAG-MS2 è stata effettuata in lisati cellulari HECK293 trasfettati. I risultati mostrano un'efficiente precipitazione della proteina FLAG-MS2.Poiché DHX9/RHA si trova nel complesso RNP e non nel controllo isotopico IgG, né nel controllo negativo. Qui sono mostrati i western blot di complessi di DNA RNA digeriti con RNasi H. La RNasi H ha scisso l'RNA PCE GAG, rilasciando il complesso RNP specificamente legato ai cinque UTR primi.Gli RNP associati a DHX9/RHA sono stati arricchiti negli eluenti. È importante sottolineare che gli RNP legati a FLAG-MS2 sono rimasti con le perle coniugate con anticorpi. In questo esperimento, l'immunoprecipitazione HO del loop staminale MS2, contenente PCE GAG RNA retrovirale nelle cellule e negli eluenti, è stata convalidata mediante RT-PCR e QRT-PCR.I risultati hanno confermato un'associazione selezionata tra DHX9/RHA e l'UTR retrovirale a cinque prime, che è stato evidenziato come un RNP unico, importante per il controllo mirato della traduzione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire tutti i passaggi in modo efficiente e con cura, per garantire il mantenimento dei complessi RNP intatti e l'isolamento dello specifico complesso RNP di interesse.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la spettrometria di massa e l'RNA-Seq, per rispondere a ulteriori domande, come l'associazione globale delle proteine con l'RNA bersaglio. E la regione o l'analisi completa di tutti i trascritti coinvolti all'interno di un particolare RNP. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del controllo genico post-trascrizionale per esplorare i distinti complessi proteici dell'RNA che regolano l'espirazione genica virale patogena e il meccanismo generale del controllo dell'espressione genica cellulare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere complessi RNP cellulari intatti e determinarne la composizione utilizzando l'arricchimento selettivo diretto da oligonucleotidi. Non dimenticare anche che lavorare con virus patogeni e campioni biologici e sostanze chimiche pericolose come acido o fenolo può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese tutte le precauzioni, come ad esempio adeguati dispositivi di protezione individuale.

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