Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für den Nachweis der microRNA-Expression in der Ratten-Peritonealmembran unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion vor. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung des microRNA-Expressionsprofils in der Ratten-Peritonealmembran in mehreren pathologischen Zuständen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Messenger-RNA-Expression posttranskriptional regulieren. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Organen und Geweben bei Ratten untersucht. Allerdings sind Standardmethoden für die Reinigung von miRNAs und den Nachweis ihrer Expression in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert. Wir haben eine wirksame und zuverlässige Methode entwickelt, um miRNAs mit quantitativer Echtzeit-Reverse-Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) in Ratten-Peritonealmembran zu reinigen und zu quantifizieren. Dieses Protokoll besteht aus vier Schritten: 1) Reinigung der Peritonealmembranprobe; 2) Reinigung der Gesamt-RNA einschließlich miRNA aus der Peritoneal-Membranprobe; 3) reverse Transkription von miRNA zur Erzeugung von cDNA; Und 4) qRT-PCR zur Detektion der miRNA-Expression. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich festgestellt, dass die Expression von sechs miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p) zunahmSignifikant in der Peritonealmembran eines Ratten-Peritoneal-Fibrose-Modells im Vergleich zu denen in Kontrollgruppen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das Profil der miRNA-Expression in der Peritonealmembran von Ratten in vielen pathologischen Zuständen zu untersuchen.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die post-transkriptional die messenger RNA (mRNA) Expression 1 regulieren. Veränderungen in der Expression von miRNAs regulieren die Expression vieler mRNAs, die in verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Fibrose, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , eine zentrale Rolle spielen. Daher haben miRNAs als neuartige Biomarker und therapeutische Ziele 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 Potenzial. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Ratten bestimmtOrgane und Gewebe, einschließlich Leber, Herz, Lunge und Niere 9 . Allerdings sind Standardmethoden zur Reinigung und Detektion von miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert.
Das Gesamtziel dieses Protokolls besteht darin, miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich zu reinigen und zu detektieren. Zuerst wurde die Peritonealmembranprobe unter Verwendung eines Glashomogenisators homogenisiert, gefolgt von einer Exposition gegenüber einem Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule 10 . Als nächstes wurde die Gesamt-RNA, die miRNA enthielt, aus der Peritoneal-Membranprobe unter Verwendung einer Spin-Säule 10 auf Siliciumdioxid-Membran-Basis gereinigt. Dann wurde cDNA aus der gereinigten Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer 11 synthetisiert. Schließlich wurde die Expression von miRNA durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs 11 bestimmt . Die Begründung dieses Protokolls ist bAuf früheren Studien, die eine signifikante Reinigung und Nachweis von miRNA in Geweben durch ein einfaches Verfahren 8 , 10 , 11 zeigten. Es wurde berichtet, dass die Verwendung eines Biopolymer-Zerkleinerungssystems in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule und einer Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran-Basis eine hochqualitative Gesamt-RNA aus den Geweben 10 reinigen kann. Das Verfahren zur Synthese von cDNA aus gereinigter Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer und das Verfahren zum Nachweis der miRNA-Expression durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs in diesem Protokoll wurde mit hoher Genauigkeit und einer hohen Genauigkeit beschrieben Empfindlichkeit 11 Darüber hinaus ist dies ein einfacher Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert Daher ist dieses Protokoll in Studien nützlich, die einen hochgenauen und empfindlichen Nachweis von miRNA in der Ratten-Peritonealmembran in einem breiten Bereich von pathologischen Zuständen erfordern.
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Protocol
Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Tierethikkomitee der Jichi Medical University genehmigt und wurden im Einklang mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Experimental Animals von der Jichi Medical University Guide für Labortiere durchgeführt.
1. Peritoneum Probensammlung
- Sammeln Sie die folgenden Gegenstände: 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Baumwolle in Isofluran, Korkplatte, Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), chirurgischer Schere und Pinzette.
- Euthanasieren Sie eine Ratte mit einer Überdosierung von Isofluoran, dann sprühen Sie die Bauchhaut der Ratte mit 70% Ethanol und montieren Sie die Ratte auf dem Korkenblatt auf dem Rücken.
- Machen Sie einen Längsschnitt in der Bauchhaut, Muskel und Peritoneal Membran mit der Schere und Pinzette.
- Heben Sie die Peritonealmembran mit der Pinzette auf und machen Sie horizontale Einschnitte auf ihren oberen Teil entlang der untersten Rippe Knochen unter dem Zwerchfell und auf seinem lOwer Seite auf der lateralen Region mit der chirurgischen Schere. Als nächstes machen Sie seitliche Längsschnitte, um die Peritonealmembran aus dem Körper mit der chirurgischen Schere zu entfernen. Dann waschen Sie es mit PBS in einer Petrischale.
- Schneiden und trimmen 20 mg (3-5 mm 2 ) der Peritonealmembranproben, die eine geeignete Größe für die folgenden Schritte ist, unter Verwendung der chirurgischen Scheren und der Pinzette.
2. Reinigung von Gesamt-RNAs aus Peritoneal-Membranproben
HINWEIS: Hier werden Peritonealmembranproben mit einem Gewicht von 20 mg unter Verwendung eines Glashomogenisators und eines Biopolymer-Zerkleinerungssystems in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule homogenisiert. Dann wird die Gesamt-RNA aus der Peritoneal-Membranprobe unter Verwendung einer Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran-Basis isoliert.
- Sammeln Sie folgende Gegenstände: 1,5 oder 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen, 100% Ethanol, Chloroform, Glashomogenisator, Eis, Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule 10 10 , Phenol / Guanidin-basiertes Lyse-Reagenz, Waschpuffer einschließlich Guanidin und Ethanol (Waschpuffer 1) und Waschpuffer einschließlich Ethanol (Waschpuffer 2).
- Setzen Sie eine 20 mg Peritonealmembranprobe in einen Glashomogenisator und fügen Sie 700 μl des Phenol / Guanidin-basierten Lyse-Reagens hinzu.
- Homogenisieren Sie die Peritoneal-Membranprobe durch langsames Drücken der Pistille auf die Probe mit Verdrehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrere Dutzend Mal auf Eis, bis die Peritonealmembranprobe vollständig in das Phenol / Guanidin-basierte Lyse-Reagens aufgelöst ist.
- Zur weiteren Homogenisierung wird das homogenisierte Lysat zum Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule in einem 2,0-ml-Sammelröhrchen überführt. Dann bei 14.000 xg für 3 min bei 4 ° C zentrifugieren.
- Übertragen Sie das homogenisierte Lysat in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- Füge dem homogenisierten Lysat 140 & mgr; l Chloroform hinzu und bedecke die WanneE sicher. Dann mischen Sie die Röhre durch Inversion für 15 s.
- Die Proben für 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zentrifugiere sie bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
- Übertragen Sie den Überstand (üblicherweise 300 μl) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, ohne den Niederschlag zu stören, und fügen Sie 1,5x seines Volumens (üblicherweise 450 μl) 100% igem Ethanol hinzu. Dann mischen Sie die Probe durch Vortexen für 5 s.
- Pipettieren Sie bis zu 700 μl der Probe in eine Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran, die in einem 2,0 ml Sammelröhrchen platziert ist. Schließen Sie die Kappe der Säule. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 15 s. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
- Füge 700 μl Waschpuffer 1 zur Siliciummembran-basierten Spin-Säule hinzu, um die Probe streng zu waschen. Schließen Sie die Kappe der Säule. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 15 s. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
- Füge 500 μl Waschpuffer 2 zur Siliciumdioxid-Membran hinzuRane-basierte Spin-Säule, um jede Spur von Salz zu entfernen. Schließen Sie die Kappe der Säule. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 15 s. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
- Wiederholung 2.11.
- Zentrifugieren Sie die Siliciummembran-basierte Spinsäule erneut bei 15.000 xg für 1 min. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
- Legen Sie die Siliciummembran-basierte Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen. Dann 25 μl RNase-freies Wasser in die Säule geben. Schließen Sie die Kappe der Säule. Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur für 5 min. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 1 min.
- Übertragen Sie das 25 & mgr; l Eluat, das Gesamt-RNA enthält, in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Dann bei -80 ° C vor Gebrauch aufbewahren.
3. Reverse Transkription der Gesamt-RNA
HINWEIS: Referenz und Einhaltung der Mindestinformationen für die Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-PCR-ExpersIments (MIQE) Leitlinien fördern eine bessere Praxis und helfen bei der Erlangung zuverlässiger und eindeutiger Ergebnisse 12 .
ANMERKUNG: Hier werden insgesamt 1,0 μg isolierte RNA unter Verwendung der reversen Transkriptase, der Poly (A) -Polymerase und des Oligo-dT-Primers umgekehrt transkribiert.
- Sammeln Sie folgende Gegenstände: 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen; Acht-Well-Streifenrohre; RNase-freies Wasser; Eis; Reverse Transkriptase Kit (siehe Material Tabelle) 11 .
- Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor, die 2,0 μl 10x Nukleinsäuremischung, 2,0 μl reverse Transkriptase-Mischung (aus dem Kit) und 4,0 μl 5x Hi-Spec-Puffer für insgesamt 8,0 μl pro Röhrchen enthält.
- 8,0 μl Master-Mix-Lösung (aus dem Kit) in jedes Röhrchen geben.
- Messen Sie die Menge der Gesamt-RNAs mit einem Spektrophotometer. Addieren Sie 1,0 μg isolierte Gesamt-RNAs, die aus der Peritoneal-Membranprobe zu jedem Röhrchen gereinigt wurden.
HINWEIS: qRT-PCR kann usi durchgeführt werdenNg Gesamt-RNAs als Vorlage ohne reverse Transkription für die Qualitätskontrolle von gereinigten Gesamt-RNAs. Wenn irgendeine DNA kontaminiert ist, werden unerwartete Amplifikationsprodukte durch qRT-PCR beobachtet. - Füge RNase-freies Wasser zu jedem Röhrchen zu insgesamt 20 μl hinzu. Dann gründlich durch Pipettieren mischen und für 15 s zentrifugieren.
- Die Proben für 60 min bei 37 ° C inkubieren. Sofort 5 min bei 95 ° C inkubieren.
HINWEIS: Dieser Schritt kann in einem Thermocycler durchgeführt werden. - CDNA in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und zehnmal (1:10) mit RNase-freiem Wasser verdünnen.
- Die verdünnte cDNA auf Eis vorübergehend aufbewahren und bei -80 ° C für lange Zeit vor Gebrauch.
4. qRT-PCR von miRNA
HINWEIS: qRT-PCR von miRNA wird mit interkalierenden Farbstoff durchgeführt. Hier wurden Primer für RNA, U6 kleine nukleäre 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p wurden benutzt.
- Sammeln Sie folgende Gegenstände: 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 96-Well-Reaktionsplatte für qRT-PCR, Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte, miRNA-spezifische Primer, grüner Farbstoff-basierter PCR-Kit (siehe Materialtabelle) 11 und a Echtzeit-PCR-Instrument.
- Eine Mastermischung, die 12,5 & mgr; l 2 × PCR-Mastermischung enthält, wurden 2,5 & mgr; l 5 & mgr; M pro miRNA-Primer, gelöst in nukleasefreiem Wasser, und 1,25 & mgr; l 10x Universalprimer für jede Vertiefung hergestellt.
- 22,5 & mgr; l Mastermix in jede Vertiefung der 96-Well-Platte geben.
- Füge 2,5 μl Template-cDNA zu jeder Vertiefung hinzu.
- Die Platte mit Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte abdichten. Dann die Platte bei 1000 xg für 30 s zentrifugieren.
- Führen Sie das PCR-Cycling-Programm mit dem Echtzeit-PCR-Instrument und der Software wie folgt aus.
- Stellen Sie die Platte in das Echtzeit-PCR-Instrument ein. In der Echtzeit-PCR-Software definieren wir experimentelle Eigenschaften (Eingang experimentellName, wählen Sie "96-wells" für die experimentelle Art von Instrument, wählen Sie "2 - ΔΔCT- Methode" für die Quantifizierung Methode, wählen Sie "SYBR grüne Reagenzien" für das Reagenz, um die Zielsequenz zu erkennen, wählen Sie "Standard-Rampenzahl" für die Instrument laufen).
- Dann ordnet man den Samples Namen zu und setzt miRNAs in jeder Vertiefung. Die Proben werden immer doppelt oder dreifach getestet, um genügend Daten zur Validierung der Ergebnisse zu erhalten. Wählen Sie Referenzmuster und endogene Kontrolle. Wählen Sie "none" für den Farbstoff, um als passive Referenz zu verwenden.
- Geben Sie ein Reaktionsvolumen von "20 μL" und die folgenden PCR-Zyklusbedingungen in der Echtzeit-PCR-Software gemäß den Anweisungen ein: Vorinkubation bei 95 ° C für 15 min und dann 40 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 15 s , Glühen bei 55 ° C für 30 s und Verlängerung bei 70 ° C für 30 s.
- Analysieren Sie qRT-PCR Daten uSingen die Software des Echtzeit-PCR-Instruments. Vergewissern Sie sich, dass die Schwelle und die Grundlinie, die automatisch durch Software bestimmt werden, in jeder Vertiefung angemessen sind.
- Überprüfen Sie den Schwellenzyklus der Ziel-miRNAs in jeder Probe. Der Schwellenzyklus ist der Schnittpunkt zwischen einer Verstärkungskurve und einer Schwellenlinie. Dann normalisieren Sie das Expressionsniveau von Ziel-miRNAs gegen RNU6-2 als endogene Kontrolle und berechnen das relative Expressionsniveau von Ziel-miRNAs unter Verwendung des 2- ΔΔCT- Verfahrens 13 .
HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass die Stabilität des Expressionsniveaus der endogenen Kontrolle miRNA überprüft werden sollte. In diesem Experiment wurde RNU6-2 bestätigt, dass es auf hohem Niveau exprimiert wurde und relativ invariant über jede Gruppe hinweg war.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Ergebnisse basieren auf unserer bisher gemeldeten Studie 8 . Wir untersuchten das miRNA-Expressionsprofil in der peritonealen Fibrose. Peritoneale Fibrose ist eine große Komplikation bei der Peritonealdialyse. Es ist durch den Verlust der mesothelialen Zellmonoschicht und die überschüssige Akkumulation von extrazellulären Matrixkomponenten gekennzeichnet und ist mit dem Peritonealmembranversagen 14 , 15 assoziiert. Ein Peritonealfibrose-Rattenmodell wurde durch die intraperitoneale Injektion von 100 ml / kg Peritonealdialyseflüssigkeit (2,5% Glucose, 100 mM NaCl, 35 mM Natriumlactat, 2 mM CaCl 2 und 0,7 mM MgCl 2, enthaltend 20 mM Methylglyoxal) für 5 hergestellt Tage pro Woche für 3 Wochen an männliche Ratten, im Alter von 12 Wochen und mit Körpergewichten von 230-250 g 16 . Die folgenden Gruppen dienten als Kontrollen: Ratten ohne Behandlung (Mock Ratten) und Ratten injiziertMit Peritonealdialyseflüssigkeit ohne Methylglyoxal (Kontrollratten). Basierend auf miRNA-Microarray-Screening fanden wir, dass die Spiegel von sechs miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p) Signifikant erhöht in der Peritonealmembran von Peritonealfibrose-Ratten im Vergleich zu denen bei Mock-Ratten und Kontroll-Ratten unter Verwendung von qRT-PCR nach dem in diesem Manuskript vorgestellten Protokoll ( Abbildung 1 ) 8 .
Abbildung 1: Upregulierte miRNAs in der Peritonealmembran der peritonealen Fibrose-Ratten. QRT-PCR-Bestimmung der Expression von miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p in Mock-Ratten (n = 6) , Kontrollieren Ratten (n = 6) und peritoneale Fibrose Ratten (n = 6). Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler (Fehlerbalken). Varianzanalyse(ANOVA) wurde eingesetzt, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu untersuchen. Wenn statistische Signifikanz von ANOVA erkannt wurde, wurde Tukey-Test als Post-hoc-Analyse durchgeführt, um die Mittel von zwei verschiedenen Gruppen zu vergleichen. Unterschiede mit einem p-Wert <0,05 wurden als signifikant angesehen. Abkürzungen: qRT-PCR, quantitative Echtzeit-Reverse-Transkription Polymerase Kettenreaktion; MiRNAs, microRNAs; NS, nicht signifikant; *, P <0,05. Diese Figur wurde von Morishita et al. 8 (mit Erlaubnis). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Unter Verwendung des in diesem Manuskript dargestellten Protokolls wurden miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich gereinigt und unter Verwendung von qRT-PCR nachgewiesen. Die Zuverlässigkeit der qRT-PCR-Datenanalyse hängt von der Qualität der gereinigten miRNAs ab. Daher kann die Reinheit von miRNAs vor der qRT-PCR durch das Verhältnis der Extinktion bei 260 nm zu dem bei 280 nm überprüft werden, was mit einem Spektrophotometer gemessen werden kann. Wenn eine signifikante Amplifikation von miRNA nicht unter Verwendung von qRT-PCR erhalten werden kann, kann die Konzentration der Templat-cDNA erhöht werden. Die Konzentration jedes miRNA-spezifischen Primers kann auch erhöht werden.
Es gibt mehrere alternative Methoden, um das Niveau der miRNA-Expression, einschließlich Microarray, Northern Blotting und Ribonuklease-Schutz-Assay zu bestimmen. QRT-PCR ist ein empfindliches Hochdurchsatzverfahren, das eine minimale Probenmenge im Vergleich zum Northern-Blotting- oder Ribonuklease-Schutz-Assay erfordert. Mikroarrays ermöglichen die Untersuchung der expRession von zahlreichen miRNAs gleichzeitig, und die Daten zeigen im Allgemeinen eine starke Korrelation mit den durch qRT-PCR 17 erhaltenen Daten; Es wurde jedoch kein Konsens über eine Methodik erreicht, die die Gültigkeit von Vergleichen von Mikroarray-Daten zwischen den Forschungsgruppen bestätigen kann.
Dieses Protokoll hat folgende Einschränkungen. Zuerst wurde die Validierung der miRNA-Erkennung durch dieses Protokoll nicht in anderen Organen wie Leber, Lunge und Niere verifiziert. Zweitens ist es auch bei anderen Versuchstieren, wie Maus, Hamster, Hund und Schwein, nicht bestätigt worden. Die Plattform dieses Protokolls für die Reinigung von miRNAs unter Verwendung einer Biopolymer-zerkleinerten Spin-Säule und einer Siliciummembran-basierten Spin-Säule und der Nachweis von miRNAs unter Verwendung von qRT-PCR wurde berichtet, dass sie in der Lage sind, qualitativ hochwertige RNA aus Geweben zu reinigen Zeigt eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit für den Nachweis von miRNA Expression 10, 11 Wir haben auch gezeigt, dass der Nachweis der miRNA-Expression in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich mit diesem Protokoll durchgeführt werden kann. Dieses Protokoll kann für Studien verwendet werden, die das Profil der miRNA-Expression in der Peritonealmembran von Ratten in einer breiten Palette von pathologischen Zuständen untersuchen. Darüber hinaus können viele Proben zusammen mit diesem Protokoll behandelt werden, weil es einen einfachen Prozess beinhaltet. Daher ist dieses Protokoll für Studien nützlich, die eine Analyse des Expressionsprofils vieler miRNAs in verschiedenen pathologischen Zuständen der Peritonealmembran erfordern.
Bei der Erstellung dieses Protokolls sollten einige kritische Punkte beachtet werden. Zuerst sollten Proben, die gereinigte RNAs enthalten, auf Eis gelegt werden, um einen Abbau zu vermeiden. Darüber hinaus sollte der Schritt der Homogenisierung auf Eis durchgeführt werden, um RNAs vor Wärmeabbau zu schützen. Darüber hinaus sollten Peritonealmembranproben ausreichend homogenisiert werden, bis sie co habenIn Lysenreagenz leicht gelöst und die Verwendung eines Säulenschredders zur weiteren Homogenisierung wird empfohlen, da Peritonealmembranproben ein wesentliches Bindegewebe enthalten, das durch Homogenisierung resistent gegen Auflösung ist. Zweitens sollte die Stabilität des Expressionsniveaus der endogenen Kontrolle miRNA über den experimentellen Aufbau in qRT-PCR verifiziert werden. Dies ist notwendig, weil verschiedene pathologische Zustände, in denen dieses Verfahren verwendet werden kann, die Expressionsniveaus der endogenen Kontroll-miRNAs beeinflussen können, die die Ergebnisse kompromittieren können.
Abschließend haben wir ein Protokoll für die Reinigung und den Nachweis der microRNA-Expression in der Ratten-Peritonealmembran unter Verwendung von qRT-PCR beschrieben.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Wir danken Miyako Shigeta für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI (Grant Nummer 25461252) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
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