Summary
Här presenterar vi ett protokoll för detektering av mikroRNA-uttryck i rått-peritonealt membran med användning av kvantitativ omvänd transkriptions-polymeras kedjereaktion i realtid. Denna metod är lämplig för studier av mikroRNA-expressionsprofilen i råttor-peritonealt membran i flera patologiska tillstånd.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) är små icke-kodande RNA som reglerar Messenger RNA-uttryck efter transskriptionellt. MiRNA-expressionsprofilen har undersökts i olika organ och vävnader i råtta. Standardmetoder för rening av miRNA och detektering av deras uttryck i råttor peritonealt membran har emellertid inte varit väl etablerade. Vi har utvecklat en effektiv och tillförlitlig metod för att rena och kvantifiera miRNAs med hjälp av kvantitativ omvänd transkriptionspolymeras kedjereaktion (qRT-PCR) i råttor peritonealt membran i realtid. Detta protokoll består av fyra steg: 1) rening av peritonealt membranprov; 2) rening av totalt RNA inklusive miRNA från peritonealt membranprov; 3) omvänt transkription av miRNA för att producera cDNA; Och 4) qRT-PCR för att detektera miRNA-uttryck. Med hjälp av detta protokoll bestämde vi framgångsrikt att uttrycket av sex miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 och miRNA-34a-5p) ökadeSignifikant i peritonealmembranet hos en peritoneal fibrosmodell i råtta jämfört med de i kontrollgrupper. Detta protokoll kan användas för att studera profilen av miRNA-uttryck i peritonealt membran hos råttor under många patologiska förhållanden.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) är korta, icke-kodande RNA som post-transkriptionellt reglerar uttrycket RNA (mRNA) uttryck 1 . Förändringar i uttrycket av miRNA reglerar uttrycket av många mRNA som spelar pivotala roller i olika patologiska tillstånd, inklusive cancer, inflammation, metaboliska störningar och fibros 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Därför har miRNAs potential som nya biomarkörer och terapeutiska mål 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . MiRNA-expressionsprofilen har bestämts i olika råttorOrgan och vävnader, inklusive lever, hjärta, lung och njure 9 . Standardmetoder för rening och detektion av miRNA i råttor-peritonealmembran har emellertid inte varit väl etablerade.
Det övergripande målet med detta protokoll är att framgångsrikt rena och detektera miRNA i råtta-peritonealt membran. Först homogeniserades peritonealmembranprovet med användning av en glashomogenisator följt av exponering för ett biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrocentrifugspinnkolonn 10 . Därefter renades totalt RNA inklusive miRNA från peritonealt membranprov med användning av en silikamembranbaserad spinnkolonn 10 . Sedan syntetiserades cDNA från det renade totala RNA med användning av omvänt transkriptas, poly (A) -polymeras och oligo-dT-primer 11 . Slutligen bestämdes uttrycket av miRNA genom qRT-PCR med användning av ett interkalerande färgämne 11 . Skälen till detta protokoll är bAsed vid tidigare studier som visade signifikant rening och detektion av miRNA i vävnader genom en enkel process 8 , 10 , 11 . Det har rapporterats att användningen av ett biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrocentrifugspinnkolonn och silikamembranbaserad spinnkolonn kan rena högkvalitativt totalt RNA från vävnaderna 10 . Metoden att syntetisera cDNA från renat totalt RNA med användning av omvänt transkriptas, poly (A) -polymeras och oligo-dT-primer och metoden för att detektera miRNA-uttryck med qRT-PCR med användning av interkalerande färgämne i detta protokoll har rapporterats visa hög noggrannhet och Känslighet 11 . Dessutom är det en enkel process, vilket sparar tid och förhindrar tekniska fel. Därför är detta protokoll användbart i studier som kräver mycket noggrann och känslig detektering av miRNA i råtta peritonealt membran i ett brett spektrum av patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsöksprotokoll godkändes av djuretikutskottet i Jichi Medical University och utfördes i enlighet med riktlinjerna för användning och vård av experimentella djur från Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Peritoneum Provsamling
- Samla in följande föremål: 50 ml centrifugrör med bomullsdragen i isofluran, korkfolie, petriskål med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), kirurgiska sax och tång.
- Eutanera en råtta med en överdos av isofluoran, spraya sedan ryggradens rygg med 70% etanol och montera råttan på korkfolien på ryggen.
- Gör ett longitudinellt snitt i bukhud, muskler och peritonealt membran med hjälp av sax och pincett.
- Plocka upp peritonealt membran med hjälp av tang och gör horisontella snitt på sin övre del längs det lägsta revbenet under membranet och på dess lDen övre sidan på den laterala regionen med hjälp av kirurgiska saxen. Därefter gör laterala longitudinella snitt för att avlägsna peritonealmembranen från kroppen med hjälp av kirurgiska saxen. Tvätta sedan med PBS i en petriskål.
- Klipp ut och trimma 20 mg (3-5 mm 2 ) peritonealmembranprover, vilket är en lämplig storlek för följande steg, med hjälp av kirurgiska saxar och pincett.
2. Rening av totala RNA från peritoneala membranprover
OBS: Här homogeniseras peritoneala membranprover som väger 20 mg med hjälp av en glashomogenisator och ett biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrocentrifugspinnkolonn. Därefter isoleras totalt RNA från peritonealt membranprov med användning av en silikamembranbaserad spinnkolonn.
- Samla in följande föremål: 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugrör, 100% etanol, kloroform, glashomogenisator, is, biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrocentrifugspinnkolonn 10 10 , fenol / guanidinbaserat lysreagens, tvättbuffert innefattande guanidin och etanol (tvättbuffert 1) och tvättbuffert innefattande etanol (tvättbuffert 2).
- Sätt ett 20 mg peritonealt membranprov i en glashomogenisator och tillsätt 700 μL av fenol / guanidinbaserat lysreagens.
- Homogenisera peritonealt membranprov genom att långsamt trycka pesteln på provet med vridning. Upprepa denna process flera dussin gånger på is tills peritonealt membranprov har helt upplösts i fenol / guanidinbaserat lysreagens.
- För vidare homogenisering, överför homogeniserat lysat till biopolymer-fragmenteringssystemet i en mikrocentrifugspinnkolonn i ett 2,0 ml uppsamlingsrör. Centrifugera sedan den vid 14 000 xg under 3 minuter vid 4 ° C.
- Överför det homogeniserade lysatet till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 140 μL kloroform till det homogeniserade lysatet och häll tubenE säkert. Blanda sedan röret genom inversion i 15 s.
- Inkubera proven i 2-3 minuter vid rumstemperatur. Centrifugera sedan dem vid 12 000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten (vanligen 300 μL) till ett nytt mikrocentrifugrör utan att störa fällningen och tillsätt 1,5x dess volym (vanligtvis 450 μL) 100% etanol. Blanda sedan provet med vortex i 5 s.
- Pipettera upp till 700 μl av provet i en silikamembranbaserad spinnkolonn placerad i ett 2,0 ml uppsamlingsrör. Stäng locket på kolumnen. Centrifugera sedan den vid 15 000 xg under 15 s. Efter centrifugering kassera genomflödet i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 700 μl tvättbuffert 1 till den silikamembranbaserade spinnkolonnen för att tvätta provet strängt. Stäng locket på kolumnen. Centrifugera sedan den vid 15 000 xg under 15 s. Efter centrifugering kassera genomflödet i uppsamlingsröret.
- Tillsätt 500 μl tvättbuffert 2 till kiseldioxid-membranenRane-baserad spinnkolonn för att avlägsna eventuella spår av salt. Stäng locket på kolumnen. Centrifugera sedan den vid 15 000 xg under 15 s. Efter centrifugering kassera genomflödet i uppsamlingsröret.
- Upprepa 2.11.
- Centrifugera den silikamembranbaserade spinnkolonnen igen vid 15 000 xg under 1 min. Efter centrifugering kassera genomflödet i uppsamlingsröret.
- Placera den silikamembranbaserade spinnkolonnen i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör. Sedan överför 25 μL RNase-fri vatten i kolonnen. Stäng locket på kolumnen. Lämna provet vid rumstemperatur i 5 minuter. Centrifugera sedan den vid 15 000 xg under 1 min.
- Överför 25 μL eluatet innehållande totalt RNA till ett nytt mikrocentrifugrör. Spara sedan vid -80 ° C före användning.
3. Omvänd transkription av totalt RNA
OBS: Referens och efterlevnad av minsta information för publicering av kvantitativt realtids PCR ExperIMS (MIQE) riktlinjer uppmuntrar bättre praxis och hjälp för att få tillförlitliga och otvetydiga resultat 12 .
OBS: Här är totalt 1,0 μg isolerat RNA omvänd transkriberat med användning av revers transkriptas, poly (A) polymeras och oligo-dT-primer.
- Samla in följande föremål: 1,5 ml mikrocentrifugrör; Åtta brunnar RNasfritt vatten; is; Revers transkriptas kit (se material tabell) 11 .
- Förbered en masterblandningslösning som innehåller 2,0 μL 10x nukleinsyrablandning, 2,0 μL omvänd transkriptasblandning (från satsen) och 4,0 μL 5x hi-spec buffert för totalt 8,0 μL per rör.
- Dispensera 8,0 μL masterblandningslösning (från satsen) i varje rör.
- Mät kvantiteten av totala RNA med hjälp av en spektrofotometer. Tillsätt 1,0 μg isolerade totala RNA renade från peritonealt membranprov till varje rör.
OBS: qRT-PCR kan utföras usiNg totala RNA som en mall utan omvänd transkription för kvalitetskontroll av renade totala RNA. Om något DNA är förorenat observeras oväntade amplifieringsprodukter genom qRT-PCR. - Tillsätt RNasfritt vatten till varje rör till totalt 20 pl. Blanda sedan noggrant genom pipettering och centrifugera det i 15 s.
- Inkubera proven i 60 minuter vid 37 ° C. Inkubera omedelbart i 5 minuter vid 95 ° C.
OBS: Detta steg kan utföras i en termisk cykler. - Överför cDNA till ett nytt mikrocentrifugrör och späd tio gånger (1:10) med RNas-fritt vatten.
- Förvara den utspädda cDNAen på is temporärt och vid -80 ° C under lång tid före användning.
4. qRT-PCR av miRNA
OBS: qRT-PCR av miRNA utförs med användning av interkaleringsfärg. Här är primers för RNA, U6 små kärnor 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 och miRNA-34a-5p var använda.
- Samla in följande föremål: 1,5 ml mikrocentrifugrör, 96-brunnars reaktionsplatta för qRT-PCR, klisterfilm för 96-brunnars reaktionsplatta, miRNA-specifika primrar, grönfärgbaserat PCR-kit (se materialtabell) 11 och en Realtids PCR-instrument.
- Förbered en masterblandning innehållande 12,5 μL 2x PCR-mastblandning, 2,5 μL 5 μM varje miRNA-primer upplöst i nukleasfritt vatten och 1,25 μL 10x universell primer för varje brunn.
- Dispensera 22,5 μL masterblandning i varje brunn i 96-brunnsplattan.
- Tillsätt 2,5 μl mall cDNA till varje brunn.
- Tät plattan med klisterfilm för 96-brunnars reaktionsplatta. Centrifugera sedan plattan vid 1000 xg i 30 s.
- Kör PCR-cykelprogrammet med realtids PCR-instrument och programvara enligt följande.
- Ställ in plattan i realtids-PCR-instrumentet. I realtids-PCR-programvaran definierar du experimentella egenskaper (inmatnings experimentellNamn, välj "96 brunnar" för den experimentella typen av instrument, välj "2 - ΔΔCT- metod" för kvantifieringsmetoden, välj "SYBR grön reagens" för reagenset för att detektera målsekvensen, välj "standard ramphastighet" för Instrumentkörning).
- Sedan tilldela namn till proverna och rikta miRNA i varje brunn. Prover testas alltid i dubbla eller tre exemplar för att erhålla tillräckligt med data för validering av resultaten. Välj referensprov och endogen kontroll. Välj "none" för att färgämnet ska användas som passiv referens.
- Inmat en reaktionsvolym av "20 μL" och följande PCR-cykelförhållanden i realtids-PCR-mjukvaran i enlighet med instruktionerna: förinkubation vid 95 ° C i 15 minuter och därefter 40 cyklar av denaturering vid 94 ° C under 15 s , Glödgning vid 55 ° C i 30 s och förlängning vid 70 ° C under 30 s.
- Analysera qRT-PCR-data uSjunga programvaran i realtids PCR-instrumentet. Bekräfta att tröskeln och baslinjen som automatiskt bestäms av programvara är lämpliga i varje brunn.
- Kontrollera tröskelcykeln för mål-miRNA i varje prov. Tröskelvärdet är skärningen mellan en förstärkningskurva och en tröskellinje. Därefter normaliserar expressionsnivån av mål-miRNA mot RNU6-2 som en endogen kontroll och beräknar den relativa expressionsnivån för mål-miRNA med användning av 2 -ΔΔCT- metoden 13 .
OBS: Det bör noteras att stabiliteten hos expressionsnivån för endogen kontroll miRNA bör verifieras. I detta experiment bekräftades RNU6-2 att uttryckas på hög nivå och relativt invariant över varje grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten som presenteras här bygger på vår tidigare rapporterade studie 8 . Vi undersökte miRNA-expressionsprofilen i peritoneal fibros. Peritoneal fibros är en stor komplikation vid peritonealdialys. Det kännetecknas av förlust av mesotelcells-monoskiktet och överskott av ackumulering av extracellulära matriskomponenter och är associerad med peritonealt membransvikt 14 , 15 . En ryggmodell för peritoneal fibros framställdes genom intraperitoneal injektion av 100 ml / kg peritonealdialysvätska (2,5% glukos, 100 mM NaCl, 35 mM natriumlaktat, 2 mM CaCl2 och 0,7 mM MgCl2 innehållande 20 mM metylglyoxal) i 5 Dagar i veckan i 3 veckor för manliga råttor i åldern 12 veckor och med kroppsvikt på 230-250 g 16 . Följande grupper fungerade som kontroller: råttor utan behandling (mocka råttor) och injicerade råttorMed peritonealdialysvätska utan metylglyoxal (kontrollrotter). Baserat på miRNA microarray screening, fann vi att halterna av sex miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 och miRNA-34a-5p) Ökat signifikant i peritonealmembranet hos peritoneala fibros råttor jämfört med de hos mocka råttor och kontrollråttor, med användning av qRT-PCR enligt protokollet som presenteras i detta manuskript ( Figur 1 ) 8 .
Figur 1: Upregulated miRNAs i peritoneal membran av peritoneal fibrosis råttor. QRT-PCR-bestämning av uttrycket av miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 och miRNA-34a-5p i mocka råttor (n = 6) , Kontrollrotter (n = 6) och råttor av peritonealt fibros (n = 6). Värden är medelvärdet ± standardfelet (felfält). Variansanalys(ANOVA) användes för att undersöka skillnader mellan grupper. Om statistisk signifikans detekterades av ANOVA utfördes Tukeys test som en post-hoc-analys för att jämföra medlen av två olika grupper. Skillnader med p-värde <0,05 ansågs signifikanta. Förkortningar: qRT-PCR, kvantitativ omvänd transkriptions-polymerasekedjereaktion i realtid; MiRNAs, microRNAs; NS, inte signifikant; *, P <0,05. Denna siffra har modifierats från Morishita et al. 8 (med tillstånd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användning av protokollet som presenteras i detta manuskript renades miRNA i råttor-peritonealt membran med framgång och användes med användning av qRT-PCR. Tillförlitligheten av qRT-PCR-dataanalys beror på kvaliteten på renade miRNA. Därför kan renheten hos miRNA kontrolleras före qRT-PCR genom förhållandet absorbans vid 260 nm till det vid 280 nm, vilket kan mätas med användning av en spektrofotometer. När signifikant amplifiering av miRNA inte kan erhållas med användning av qRT-PCR, kan koncentrationen av mall cDNA ökas. Koncentrationen av varje miRNA-specifik primer kan också ökas.
Det finns flera alternativa metoder för att bestämma nivån av miRNA-uttryck, inklusive mikroarray, Northern blotting och ribonuclease protection assay. QRT-PCR är en känslig process med hög genomströmning som kräver en minimal mängd prov jämfört med Northern Blotting eller Ribonuclease Protection Assay. Microarrays möjliggör undersökning av expRession av många miRNAs samtidigt, och data visar generellt en stark korrelation med data erhållna av qRT-PCR 17 ; Emellertid har ingen överenskommelse nåtts om en metod som kan bekräfta validiteten av jämförelser av mikroarraydata mellan forskningsgrupper 18 .
Detta protokoll har följande begränsningar. För det första har validering av miRNA-detektering med detta protokoll inte verifierats i andra organ, såsom lever, lung och njure. För det andra har det inte heller verifierats i andra försöksdjur, inklusive mus, hamster, hund och gris. Plattformen för detta protokoll för rening av miRNAs med användning av en biopolymer-klyvande spinnkolonn och en silikamembranbaserad spinnkolonn och detektion av miRNA med användning av qRT-PCR har rapporterats kunna rening av högkvalitativt RNA från vävnader och Visar hög noggrannhet och känslighet för detektering av miRNA-uttryck 10, 11 . Vi visade också att detekteringen av miRNA-uttryck i råtta peritonealt membran kan genomföras framgångsrikt med användning av detta protokoll. Detta protokoll kan användas för studier som undersöker profilen av miRNA-uttryck i råttans peritoneala membran i ett brett spektrum av patologiska tillstånd. Dessutom kan många prover behandlas tillsammans med det här protokollet, eftersom det innebär en enkel process. Därför är detta protokoll användbart för studier som kräver analys av expressionsprofilen för många miRNA i olika patologiska tillstånd i peritonealmembranet.
Flera kritiska punkter bör beaktas när man följer detta protokoll. Först bör prover innehållande renade RNA placeras på is för att undvika nedbrytning. Dessutom bör homogeniseringssteget utföras på is för att skydda RNA från värmeförsämring. Vidare bör peritoneala membranprover homogeniseras tillräckligt tills de har koUpplöses mpletely i lysisreagens och användningen av en kolonnhackare för vidare homogenisering rekommenderas eftersom peritoneala membranprover innehåller väsentlig bindväv som är resistent mot upplösning genom homogenisering. För det andra bör stabiliteten hos expressionsnivån för endogen kontroll miRNA verifieras över experimentuppsättningen i qRT-PCR. Detta är nödvändigt eftersom olika patologiska tillstånd där denna procedur kan användas kan påverka expressionsnivåerna för endogena kontrollmRNA, vilket kan kompromissa med resultaten.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för rening och detektion av mikroRNA-uttryck i råtta peritonealt membran med användning av qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Miyako Shigeta för sitt utmärkta tekniska stöd. Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI (bidragsnummer 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
