Summary
Aquí presentamos un protocolo para la detección de la expresión de microRNA en la membrana peritoneal de rata mediante la cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real. Este método es adecuado para estudiar el perfil de expresión de microARN en la membrana peritoneal de rata en varias condiciones patológicas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión del ARN mensajero post-transcriptionally. El perfil de expresión de miARN se ha investigado en diversos órganos y tejidos en ratas. Sin embargo, los métodos estándar para la purificación de miARNs y la detección de su expresión en la membrana peritoneal de rata no han sido bien establecidos. Hemos desarrollado un método eficaz y fiable para purificar y cuantificar miARNs utilizando cuantitativa en tiempo real de transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR) en la membrana peritoneal de rata. Este protocolo consta de cuatro pasos: 1) purificación de la muestra de membrana peritoneal; 2) purificación del ARN total incluyendo miARN de la muestra de membrana peritoneal; 3) transcripción inversa de miARN para producir cDNA; Y 4) qRT-PCR para detectar la expresión de miARN. Usando este protocolo, hemos determinado con éxito que la expresión de seis miRNAs (miARN-142-3p, miARN-21-5p, miRNA-221-3p, miARN-223-3p, miRNA-327, y miRNA-34a-5p)Significativamente en la membrana peritoneal de un modelo de fibrosis peritoneal de rata en comparación con los de los grupos de control. Este protocolo puede usarse para estudiar el perfil de la expresión de miARN en la membrana peritoneal de ratas en muchas condiciones patológicas.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) son cortos, no codificantes RNAs que post-transcriptionally regular la expresión de ARN mensajero (mRNA) 1 . Los cambios en la expresión de miRNAs regulan la expresión de muchos mRNAs que desempeñan papeles fundamentales en diversas condiciones patológicas, incluyendo el cáncer, la inflamación, los trastornos metabólicos y la fibrosis 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Por lo tanto, miRNAs tienen potencial como nuevos biomarcadores y objetivos terapéuticos 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . El perfil de expresión de miARN se ha determinado en varias ratasÓrganos y tejidos, incluyendo hígado, corazón, pulmón y riñón 9 . Sin embargo, los métodos estándar para la purificación y detección de miARNs en la membrana peritoneal de rata no han sido bien establecidos.
El objetivo general de este protocolo es purificar y detectar con éxito miARNs en la membrana peritoneal de rata. En primer lugar, se homogeneizó la muestra de membrana peritoneal utilizando un homogenizador de vidrio, seguido por la exposición a un sistema de destrucción de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga 10 . A continuación, el ARN total que incluía miARN se purificó a partir de la muestra de membrana peritoneal usando una columna de spin 10 basada en membrana de sílice. A continuación, el ADNc se sintetizó a partir del ARN total purificado utilizando transcriptasa inversa, poli (A) polimerasa y cebador oligo-dT 11 . Finalmente, la expresión de miARN se determinó por qRT-PCR utilizando un colorante intercalante [ 11] . La razón de ser de este protocolo es bEn base a estudios previos que mostraron una purificación y detección significativas de miARN en tejidos por un proceso simple 8 , 10 , 11 . Se ha informado que el uso de un sistema de biopolimerización en una columna de centrifugación de microcentrífuga y columna de giro basada en membrana de sílice puede purificar el ARN total de alta calidad de los tejidos 10 . Se ha informado que el método de sintetizar ADNc a partir de ARN total purificado usando transcriptasa inversa, poli (A) polimerasa y cebador oligo-dT, y el método para detectar la expresión de miARN mediante qRT-PCR utilizando colorante intercalante en este protocolo, Sensibilidad 11 . Además, se trata de un proceso sencillo, que ahorra tiempo y evita errores técnicos. Por lo tanto, este protocolo es útil en estudios que requieren una detección muy precisa y sensible de miARN en la membrana peritoneal de rata en una amplia gama de condiciones patológicas.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las directrices de Uso y Cuidado de Animales Experimentales de la Guía de la Universidad Médica de Jichi para Animales de Laboratorio.
1. Colección de muestras de peritoneo
- Recoger los siguientes artículos: Tubo centrífugo de 50 ml con algodón empapado en isoflurano, lámina de corcho, placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS), tijeras quirúrgicas y fórceps.
- Eutanasiar una rata con una sobredosis de isofluorano, luego rociar la piel abdominal de la rata con etanol al 70%, y montar la rata en la hoja de corcho en la espalda.
- Haga una incisión longitudinal en la piel abdominal, los músculos y la membrana peritoneal usando las tijeras y la pinza.
- Recoger la membrana peritoneal con la pinza, y hacer incisiones horizontales en su parte superior a lo largo de la costilla inferior bajo el diafragma y en su lOwer en la región lateral usando las tijeras quirúrgicas. A continuación, realice incisiones longitudinales laterales para retirar la membrana peritoneal del cuerpo utilizando las tijeras quirúrgicas. A continuación, lavar con PBS en una placa de Petri.
- Cortar y recortar 20 mg (3-5 mm 2 ) de muestras de membrana peritoneal, que es un tamaño adecuado para los siguientes pasos, utilizando las tijeras quirúrgicas y fórceps.
2. Purificación de ARN totales de muestras de membrana peritoneal
NOTA: En este caso, las muestras de membrana peritoneal que pesan 20 mg se homogeneizan usando un homogeneizador de vidrio y un sistema de destrucción de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga. A continuación, el ARN total de la muestra de membrana peritoneal se aısla utilizando una columna de giro basada en membrana de sılice.
- Recoger los siguientes artículos: tubos de microcentrífuga de 1,5 ó 2,0 ml, etanol al 100%, cloroformo, homogeneizador de vidrio, hielo, sistema de destrucción de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga 10 10 , reactivo de lisis basado en fenol / guanidina, tampón de lavado que incluye guanidina y etanol (tampón de lavado 1), y tampón de lavado que incluye etanol (tampón de lavado 2).
- Colocar una muestra de membrana peritoneal de 20 mg en un homogeneizador de vidrio y añadir 700 μl del reactivo de lisis basado en fenol / guanidina.
- Homogeneizar la muestra de membrana peritoneal presionando lentamente el mazo sobre la muestra con torsión. Repita este proceso varias docenas de veces sobre hielo hasta que la muestra de membrana peritoneal se haya disuelto completamente en el reactivo de lisis basado en fenol / guanidina.
- Para homogeneización adicional, transferir el lisado homogeneizado al sistema de destrucción de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga en un tubo de recogida de 2,0 ml. A continuación, centrifugar a 14.000 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Transferir el lisado homogeneizado a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Añadir 140 μl de cloroformo al lisado homogeneizado y tapar la cubaE firmemente. A continuación, mezcle el tubo por inversión durante 15 s.
- Incubar las muestras durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se centrifuga a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante (usualmente 300 μl) a un nuevo tubo de microcentrífuga sin alterar el precipitado, y añadir 1,5 veces su volumen (usualmente 450 μl) de etanol al 100%. A continuación, mezcle la muestra agitando vorticialmente durante 5 s.
- Pipetar hasta 700 μL de la muestra en una columna de giro basada en membrana de sílice colocada en un tubo de recogida de 2,0 ml. Cierre la tapa de la columna. A continuación, centrifugar a 15.000 xg durante 15 s. Después de la centrifugación, descartar el flujo en el tubo de recogida.
- Añadir 700 μl de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice para lavar rigurosamente la muestra. Cierre la tapa de la columna. A continuación, centrifugar a 15.000 xg durante 15 s. Después de la centrifugación, descartar el flujo en el tubo de recogida.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 a la membrana de síliceRane basado en spin columna para eliminar cualquier rastro de sal. Cierre la tapa de la columna. A continuación, centrifugar a 15.000 xg durante 15 s. Después de la centrifugación, descartar el flujo en el tubo de recogida.
- Repita 2.11.
- Centrifugar de nuevo la columna de rotación basada en membrana de sílice a 15.000 xg durante 1 min. Después de la centrifugación, descartar el flujo en el tubo de recogida.
- Coloque la columna de rotación basada en membrana de sílice en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. A continuación, transfiera 25 μL de agua libre de RNasa a la columna. Cierre la tapa de la columna. Dejar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min. A continuación, centrifugar a 15.000 xg durante 1 min.
- Transferir el 25 μL de eluato que contiene el ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga. A continuación, guárdelo a -80 ° C antes de usarlo.
3. Transcripción inversa del ARN total
NOTA: Referencia y adherencia a la información mínima para la publicación de PCR cuantitativa en tiempo real Exper(MIQE) promueven mejores prácticas y ayudan a obtener resultados confiables e inequívocos 12 .
NOTA: En este caso, un total de 1,0 μg de ARN aislado es transcrita inversamente usando la transcriptasa inversa, poli (A) polimerasa y el cebador oligo-dT.
- Recoja los siguientes artículos: tubos de microcentrífuga de 1,5 ml; Tubos de tira de ocho pocillos; Agua libre de RNasa; hielo; Kit de transcriptasa inversa (ver tabla de materiales) 11 .
- Preparar una solución de mezcla maestra que contenga 2,0 μl de mezcla de ácido nucleico 10x, 2,0 μl de mezcla de transcriptasa inversa (del kit) y 4,0 μl de tampón de alta especificación 5x para un total de 8,0 μl por tubo.
- Dispense 8,0 μl de solución de mezcla maestra (del kit) en cada tubo.
- Mida la cantidad de ARNs totales usando un espectrofotómetro. Añadir 1,0 μg de ARN total aislado purificado de la muestra de membrana peritoneal a cada tubo.
NOTA: qRT-PCR se puede realizar usiNg ARN total como una plantilla sin transcripción inversa para el control de calidad de RNAs purificados totales. Si se contamina cualquier ADN, se observan productos de amplificación inesperados por qRT-PCR. - Añada agua sin RNasa a cada tubo hasta un total de 20 μl. A continuación, mezcle bien pipeteando y centrifugando durante 15 s.
- Incubar las muestras durante 60 minutos a 37 ° C. Incubar inmediatamente durante 5 minutos a 95 ° C.
NOTA: Este paso se puede realizar en un termociclador. - Transferir ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga y diluir diez veces (1:10) con agua libre de RNasa.
- Almacenar el ADNc diluido en hielo temporalmente, ya -80 ° C durante mucho tiempo antes de su uso.
4. qRT-PCR de miARN
NOTA: qRT-PCR de miARN se realiza utilizando colorante intercalante. En este sentido, los cebadores para ARN, U6 nuclear pequeño 2 (RNU6-2), miARN-142-3p, miARN-21-5p, miARN-221-3p, miARN-223-3p, miARN-327 y miARN-34a-5p fueron usados.
- Recoger los siguientes artículos: tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, placa de reacción de 96 pocillos para qRT-PCR, película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos, cebadores específicos para miARN, kit PCR basado en tinte verde 11 Instrumento de PCR en tiempo real.
- Preparar una mezcla maestra que contenga 12,5 μL de 2x mezcla maestra PCR, 2,5 μL de 5 μM de cada cebador de miARN disuelto en agua libre de nucleasa y 1,25 μl de cebador universal 10x para cada pocillo.
- Dispense 22,5 μl de mezcla maestra en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
- Añadir 2,5 mu l de ADNc de molde a cada pocillo.
- Sellar la placa con una película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos. A continuación, centrifugar la placa a 1.000 xg durante 30 s.
- Ejecute el programa de ciclo de PCR con el instrumento de PCR en tiempo real y el software de la siguiente manera.
- Coloque la placa en el instrumento de PCR en tiempo real. En el software de PCR en tiempo real, definir las propiedades experimentales (entrada experimentalNombre, elija "96 pozos" para el tipo experimental de instrumento, elija "Método 2 - ΔΔCT " para el método de cuantificación, elija "Reactivos verdes SYBR" para que el reactivo detecte la secuencia objetivo, elija "velocidad rampa estándar" Ejecución del instrumento).
- A continuación, asignar nombres a las muestras y miRNAs objetivo en cada pozo. Las muestras se prueban siempre por duplicado o triplicado para obtener suficientes datos para la validación de los resultados. Seleccione la muestra de referencia y el control endógeno. Seleccione "ninguno" para que el tinte utilice como referencia pasiva.
- Introducir un volumen de reacción de "20 μl" y las siguientes condiciones de ciclo de PCR en el software de PCR en tiempo real de acuerdo con las instrucciones: preincubación a 95ºC durante 15 min y luego 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s , Recocido a 55 ° C durante 30 s, y extensión a 70 ° C durante 30 s.
- Analizar los datos qRT-PCR uCantar el software del instrumento de PCR en tiempo real. Confirme que el umbral y la línea base que son determinados automáticamente por el software son apropiados en cada pozo.
- Compruebe el ciclo umbral de miRNAs objetivo en cada muestra. El ciclo umbral es la intersección entre una curva de amplificación y una línea umbral. Luego, normalizar el nivel de expresión de miRNAs objetivo contra RNU6-2 como un control endógeno, y calcular el nivel de expresión relativa de miRNAs objetivo utilizando el método 2 - ΔΔCT [ 13] .
NOTA: Se debe observar que la estabilidad del nivel de expresión de miARN de control endógeno debe ser verificada. En este experimento, RNU6-2 se confirmó que se expresa a alto nivel y relativamente invariable a través de cada grupo.
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Representative Results
Los resultados presentados aquí se basan en nuestro estudio previamente informado 8 . Se investigó el perfil de expresión de miARN en la fibrosis peritoneal. La fibrosis peritoneal es una complicación importante en la diálisis peritoneal. Se caracteriza por la pérdida de la monocapa de células mesoteliales y el exceso de acumulación de componentes de la matriz extracelular, y se asocia con la falla de la membrana peritoneal [ 14 , 15] . Se produjo un modelo de rata de fibrosis peritoneal mediante la inyección intraperitoneal de 100 ml / kg de fluido de diálisis peritoneal (glucosa al 2,5%, NaCl 100 mM, lactato sódico 35 mM, CaCl2 2 mM y MgCl2 0,7 mM que contiene metilglioxal 20 mM) durante 5 Días a la semana durante 3 semanas a ratas macho, de 12 semanas de edad y con pesos corporales de 230-250 g 16 . Los grupos siguientes sirvieron como controles: ratas sin ningún tratamiento (ratas simuladas) y ratas inyectadasCon líquido de diálisis peritoneal sin metilglioxal (ratas control). Basado en miARN microarrays de detección, encontramos que los niveles de seis miRNAs (miARN-142-3p, miARN-21-5p, miRNA-221-3p, miARN-223-3p, miRNA-327, y miRNA-34a-5p) Significativamente mayor en la membrana peritoneal de ratas de fibrosis peritoneal en comparación con los de ratas simuladas y ratas de control, utilizando qRT-PCR siguiendo el protocolo presentado en este manuscrito ( Figura 1 ] [ 8] .
Figura 1: MiRNAs upregulated en la membrana peritoneal de las ratas de fibrosis peritoneal. QRT-PCR determinación de la expresión de miARN-142-3p, miARN-21-5p, miARN-221-3p, miARN-223-3p, miARN-327 y miARN-34a-5p en ratas simuladas (n = 6) , Ratas de control (n = 6) y ratas de fibrosis peritoneal (n = 6). Los valores son la media ± error estándar (barras de error). Análisis de variación(ANOVA) se empleó para investigar las diferencias entre los grupos. Si se detectó significación estadística mediante ANOVA, la prueba de Tukey se realizó como un análisis post hoc para comparar las medias de dos grupos diferentes. Las diferencias con un valor de p <0,05 se consideraron significativas. Abreviaturas: qRT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa; MiRNAs, microRNAs; NS, no significativo; *, P & lt; 0,05. Esta cifra ha sido modificada de Morishita et al. 8 (con permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Utilizando el protocolo presentado en este manuscrito, miRNAs en la membrana peritoneal de rata fueron purificados con éxito y detectado utilizando qRT-PCR. La fiabilidad del análisis de datos de qRT-PCR depende de la calidad de miRNAs purificados. Por lo tanto, la pureza de miRNAs se puede comprobar antes de qRT-PCR por la relación de absorbancia a 260 nm a la de 280 nm, que se puede medir con un espectrofotómetro. Cuando la amplificación significativa de miARN no puede obtenerse utilizando qRT-PCR, la concentración de cDNA molde puede ser aumentado. También se puede aumentar la concentración de cada cebador específico de miARN.
Hay varios métodos alternativos para determinar el nivel de expresión de miARN, incluyendo microarrays, Northern blotting, y ribonucleasa de protección de ensayo. La qRT-PCR es un procedimiento sensible de alto rendimiento que requiere una cantidad mínima de muestra en comparación con el ensayo de transferencia de Northern o de ribonucleasa. Microarrays permiten la investigación de la expDe numerosos miRNAs simultáneamente, y los datos generalmente muestran una fuerte correlación con los datos obtenidos por qRT-PCR 17 ; Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre una metodología que puede confirmar la validez de las comparaciones de los datos de microarrays entre los grupos de investigación [ 18] .
Este protocolo tiene las siguientes limitaciones. En primer lugar, la validación de la detección de miARN por este protocolo no se ha verificado en otros órganos como el hígado, pulmón y riñón. En segundo lugar, tampoco se ha verificado en otros animales experimentales, incluyendo ratón, hámster, perro y cerdo. Se ha informado que la plataforma de este protocolo para la purificación de miARN usando una columna de giro de biopolimerización y una columna de spin basada en membrana de sílice y detección de miARN usando qRT-PCR es capaz de purificar ARN de alta calidad de tejidos y Muestra alta precisión y sensibilidad para la detección de miARN expresión 10, 11 . También se demostró que la detección de la expresión de miARN en la membrana peritoneal de rata se puede llevar a cabo con éxito utilizando este protocolo. Este protocolo puede utilizarse para estudios que investigan el perfil de expresión de miARN en la membrana peritoneal de ratas en una amplia gama de condiciones patológicas. Además, muchas muestras pueden ser tratadas juntas usando este protocolo porque implica un proceso simple. Por lo tanto, este protocolo es útil para los estudios que requieren el análisis del perfil de expresión de muchos miRNAs en diversas condiciones patológicas de la membrana peritoneal.
Se deben tener en cuenta varios puntos críticos al seguir este protocolo. En primer lugar, las muestras que contienen ARN purificados deben colocarse sobre hielo para evitar la degradación. Además, el paso de homogeneización debe realizarse sobre hielo para proteger los ARN de la degradación por calor. Además, las muestras de membrana peritoneal deben ser adecuadamente homogeneizadas hasta queSe disuelve por completo en el reactivo de lisis y se recomienda el uso de una trituradora de columnas para homogeneización adicional porque las muestras de membrana peritoneal contienen tejido conectivo sustancial que es resistente a la disolución por homogeneización. En segundo lugar, la estabilidad del nivel de expresión de miARN de control endógeno debe ser verificada a través de la configuración experimental en qRT-PCR. Esto es necesario porque varias condiciones patológicas en las que este procedimiento puede ser utilizado pueden afectar los niveles de expresión de los miARN controlados endógenos, lo que puede comprometer los resultados.
En conclusión, hemos descrito un protocolo para la purificación y detección de la expresión de microRNA en la membrana peritoneal de rata utilizando qRT-PCR.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Queremos dar las gracias a Miyako Shigeta por su excelente apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado parcialmente por JSPS KAKENHI (concesión número 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
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