Summary
Her presenterer vi en protokoll for påvisning av mikroRNA-ekspresjon i rotte peritoneal membran ved bruk av kvantitativ reaksjonstransskripsjons-polymerasekjedereaksjon i sanntid. Denne metoden er egnet for å studere mikroRNA ekspressjonsprofilen i rotte peritoneal membran i flere patologiske forhold.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er små, ikke-kodende RNA som regulerer messenger RNA-ekspresjon etter transskriptjonelt. MiRNA-uttrykksprofilen er undersøkt i forskjellige organer og vev i rotter. Standardmetoder for rensing av miRNAer og påvisning av deres ekspresjon i rotteperitonealmembran har imidlertid ikke vært godt etablert. Vi har utviklet en effektiv og pålitelig metode for å rense og kvantifisere miRNAer ved hjelp av kvantitativ revers-transkripsjons-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) i rotte peritoneal membran i sanntid. Denne protokollen består av fire trinn: 1) rensing av peritoneal membranprøve; 2) rensing av totalt RNA inkludert miRNA fra peritoneal membranprøve; 3) revers transkripsjon av miRNA for å produsere cDNA; Og 4) qRT-PCR for å oppdage miRNA-ekspresjon. Ved hjelp av denne protokollen bestemte vi vellykket at uttrykket av seks miRNAer (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p) økteSignifikant i peritonealmembranen av en peritoneal fibrose-modell i rotte sammenlignet med de i kontrollgrupper. Denne protokollen kan brukes til å studere profilen av miRNA-uttrykk i peritonealmembranen til rotter i mange patologiske forhold.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) er korte, ikke-kodende RNAer som post-transkriptjonelt regulerer messenger RNA (mRNA) ekspresjon 1 . Endringer i uttrykket av miRNA regulerer uttrykket for mange mRNAer som spiller pivotale roller i ulike patologiske forhold, inkludert kreft, betennelse, metabolske forstyrrelser og fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Derfor har miRNAer potensial som nye biomarkører og terapeutiske mål 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . MiRNA-ekspressjonsprofilen er bestemt i forskjellige rotterOrganer og vev, inkludert lever, hjerte, lunge og nyre 9 . Imidlertid har standardmetoder for rensing og deteksjon av miRNAer i rotteperitonealmembran ikke vært godt etablert.
Det overordnede målet med denne protokollen er å vellykke og oppdage miRNAer i rotteperitonealmembranen. For det første ble peritonealmembranprøven homogenisert ved bruk av en glasshomogenisator, etterfulgt av eksponering for et biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrosentrifugespinnkolonne 10 . Deretter ble totalt RNA inkludert miRNA renset fra peritonealmembranprøven ved anvendelse av en silikamembranbasert spinnkolonne 10 . Deretter ble cDNA syntetisert fra det rensede totale RNA ved hjelp av revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer 11 . Til slutt ble uttrykket av miRNA bestemt ved hjelp av qRT-PCR ved bruk av et interkalerende fargestoff 11 . Begrunnelsen for denne protokollen er bAsed på tidligere studier som viste signifikant rensing og deteksjon av miRNA i vev ved en enkel prosess 8 , 10 , 11 . Det har blitt rapportert at bruken av et biopolymer-fragmenteringssystem i en mikrosentrifuger-spaltkolonne og silikamembranbasert spinnkolonne kan rense høyverdig total RNA fra vev 10 . Fremgangsmåten for syntetisering av cDNA fra renset total RNA ved bruk av revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer, og metoden for å detektere miRNA-ekspresjon med qRT-PCR ved bruk av interkalerende fargestoff i denne protokollen, er rapportert å vise høy nøyaktighet og Følsomhet 11 . I tillegg er dette en enkel prosess, noe som sparer tid og forhindrer teknisk feil. Derfor er denne protokollen nyttig i studier som krever svært nøyaktig og sensitiv deteksjon av miRNA i rotte peritoneal membran i et bredt spekter av patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøksprotokoller ble godkjent av dyreetikkutvalget ved Jichi Medical University og ble utført i samsvar med retningslinjene for bruk og pleie av eksperimentelle dyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Peritoneum Prøveinnsamling
- Samle inn følgende elementer: 50 ml sentrifugerør med bomullsdrenket i isofluran, korkark, petriskål med fosfatbufret saltvann (PBS), kirurgisk saks og tang.
- Euthanize en rotte med en overdose isofluoran, spray deretter ryggskinnets rygg med 70% etanol, og monter råtten på korkplaten på ryggen.
- Gjør et langsgående snitt i bukhud, muskel og peritoneal membran ved hjelp av saks og pincet.
- Plukk opp peritonealmembranen ved hjelp av tang og gjør horisontale snitt på sin øvre del langs den laveste ribbenbenet under membranen og på lØver side på lateralområdet ved hjelp av kirurgiske saks. Deretter gjør du langsgående langsgående snitt for å fjerne peritonealmembranen fra kroppen ved hjelp av kirurgiske saks. Deretter vasker det med PBS i en petriskål.
- Klipp ut og trim 20 mg (3-5 mm 2 ) peritoneale membranprøver, som er en passende størrelse for de følgende trinnene, ved hjelp av kirurgiske saks og pincet.
2. Rensende totale RNA fra peritoneale membranprøver
MERK: Her blir homogeniserende peritoneale membranprøver som veier 20 mg homogenisert ved hjelp av en glasshomogenisator og et biopolymer-shredding-system i en mikrosentrifug-spinnkolonne. Deretter isoleres totalt RNA fra peritonealmembranprøven ved å bruke en silikamembranbasert spinnkolonne.
- Samle opp følgende elementer: 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugerør, 100% etanol, kloroform, glasshomogenisator, is, biopolymer-shredding-system i en mikrosentrifugerspaltkolonne 10 10 , fenol / guanidinbasert lysisreagens, vaskebuffer innbefattende guanidin og etanol (vaskebuffer 1) og vaskebuffer innbefattende etanol (vaskebuffer 2).
- Sett en 20 mg peritoneal membranprøve inn i en glasshomogenisator og tilsett 700 μL av fenol / guanidinbasert lysisreagens.
- Homogeniser peritonealmembranprøven ved langsomt å presse pestelen til prøven med vridning. Gjenta denne prosessen flere dusin ganger på is til peritonealmembranprøven har fullstendig oppløst i fenol / guanidinbasert lysisreagens.
- For ytterligere homogenisering, overfør homogenisert lysat til biopolymer-shredding-systemet i en mikrocentrifug-spinnkolonne i et 2,0 ml oppsamlingsrør. Sentrifuger den deretter ved 14.000 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Overfør det homogeniserte lysatet til et nytt mikrocentrifugerør.
- Tilsett 140 μL kloroform til det homogeniserte lysatet og lakk tubenE sikkert. Deretter blandes røret ved inversjon i 15 s.
- Inkuber prøvene i 2-3 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger dem deretter ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (vanligvis 300 μL) til et nytt mikrocentrifugerør uten å forstyrre bunnfallet, og sett 1,5 ganger volumet (vanligvis 450 μL) 100% etanol. Bland deretter prøven ved vortexing i 5 s.
- Pipetter opptil 700 μl av prøven i en silikamembranbasert spinnkolonne plassert i et 2,0 ml oppsamlingsrør. Lukk lokket på kolonnen. Sentrifuger den deretter ved 15.000 xg i 15 s. Etter sentrifugering, kast bort gjennomløpet i oppsamlingsrøret.
- Tilsett 700 μl vaskebuffer 1 til silikamembranbasert spinnkolonne for å vaske prøven strengt. Lukk lokket på kolonnen. Sentrifuger den deretter ved 15.000 xg i 15 s. Etter sentrifugering, kast bort gjennomløpet i oppsamlingsrøret.
- Tilsett 500 μl vaskebuffer 2 til kisel-membranenRane-basert spin kolonne for å fjerne noe spor av salt. Lukk lokket på kolonnen. Sentrifuger den deretter ved 15.000 xg i 15 s. Etter sentrifugering, kast bort gjennomløpet i oppsamlingsrøret.
- Gjenta 2.11.
- Sentrifuger den silikamembranbaserte spinnkolonnen igjen ved 15.000 xg i 1 min. Etter sentrifugering, kast bort gjennomløpet i oppsamlingsrøret.
- Plasser den silikamembranbaserte spin-kolonnen i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør. Deretter overfør 25 μL RNase-fri vann inn i kolonnen. Lukk lokket på kolonnen. La prøven stå ved romtemperatur i 5 minutter. Sentrifuger den deretter ved 15.000 xg i 1 min.
- Overfør 25 μL eluatet som inneholder totalt RNA til et nytt mikrocentrifugerør. Deretter oppbevares ved -80 ° C før bruk.
3. Omvendt transkripsjon av totalt RNA
MERK: Referanse og overholdelse av minimumsinformasjon for publisering av kvantitativ sanntids-PCR-ekspertIMS (MIQE) retningslinjer oppfordrer bedre praksis og hjelp til å oppnå pålitelige og utvetydige resultater 12 .
MERK: Her er totalt 1,0 μg isolert RNA omvendt transkribert ved bruk av revers transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT primer.
- Samle følgende elementer: 1,5 ml mikrocentrifugerør; Åtte brønn strip rør; RNase-fri vann; is; Revers transkriptase kit (se materialetabell) 11 .
- Klargjør en masterblandingsløsning som inneholder 2,0 μL 10x nukleinsyreblanding, 2,0 μL revers transkriptase-blanding (fra settet) og 4,0 μL 5x hi-spec buffer for totalt 8,0 μL per rør.
- Dispense 8,0 μL master mix løsning (fra settet) i hvert rør.
- Mål mengden av totale RNAer ved hjelp av et spektrofotometer. Tilsett 1,0 μg isolerte totale RNAer renset fra peritoneal membranprøven til hvert rør.
MERK: qRT-PCR kan utføres usiNg totalt RNA som en mal uten revers transkripsjon for kvalitetskontroll av rensede totale RNA. Hvis noe DNA er forurenset, observeres uventede amplifikasjonsprodukter ved hjelp av qRT-PCR. - Tilsett RNase-fri vann til hvert rør til totalt 20 μl. Deretter blandes grundig ved pipettering og sentrifugeres i 15 s.
- Inkuber prøvene i 60 minutter ved 37 ° C. Inkubér øyeblikkelig i 5 minutter ved 95 ° C.
MERK: Dette trinnet kan utføres i en termisk syklus. - Overfør cDNA til et nytt mikrocentrifugerør og fortynn ti ganger (1:10) med RNase-fri vann.
- Oppbevar fortynnet cDNA på is midlertidig og ved -80 ° C i lang tid før bruk.
4. qRT-PCR av miRNA
MERK: qRT-PCR av miRNA utføres ved bruk av interkalerende fargestoff. Her primere for RNA, U6 små kjernefysiske 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p ble brukt.
- Samle følgende elementer: 1,5 ml mikrocentrifugerør, 96-brønn reaksjonsplate for qRT-PCR, klebende film for 96-brønn reaksjonsplaten, miRNA-spesifikke primere, grønt fargestoffbasert PCR-sett (se materialetabell) 11 og en Sanntids PCR-instrument.
- Klargjør en masterblanding som inneholder 12,5 μL 2x PCR-masterblanding, 2,5 μL 5 μM hver miRNA primer oppløst i nukleasefritt vann og 1,25 μL 10x universell primer for hver brønn.
- Dispensér 22,5 μL masterblanding i hver brønn på 96-brønnsplaten.
- Tilsett 2,5 μL mal cDNA til hver brønn.
- Pak platen med limfilm til 96-brønn reaksjonsplaten. Sentrifuger deretter platen ved 1000 xg i 30 s.
- Kjør PCR-syklusprogrammet med sanntids PCR-instrument og programvare som følger.
- Sett platen i sanntids PCR-instrumentet. I sanntids-PCR-programvaren definerer du eksperimentelle egenskaper (input eksperimentellNavn, velg "96 brønner" for den eksperimentelle typen instrument, velg "2 - ΔΔCT metode" for kvantiseringsmetoden, velg "SYBR grønne reagenser" for reagenset for å detektere målsekvensen, velg "standard rampehastighet" for Instrumentkjøring).
- Deretter tilordne navn til prøver og mål miRNAer i hver brønn. Prøver testes alltid i to eksemplarer eller tre eksemplarer for å oppnå nok data for validering av resultatene. Velg referanseprøve og endogen kontroll. Velg "none" for fargen som skal brukes som passiv referanse.
- Legg inn et reaksjonsvolum på "20 μL" og følgende PCR-syklusforhold i sanntids PCR-programvaren i henhold til instruksjonene: forinkubasjon ved 95 ° C i 15 minutter og deretter 40 sykluser ved denaturering ved 94 ° C i 15 s , Annealing ved 55 ° C i 30 s, og forlengelse ved 70 ° C i 30 s.
- Analyser qRT-PCR-data uSyng programvaren til sanntids PCR-instrumentet. Bekreft at terskelen og basislinjen som automatisk bestemmes av programvare, passer i hver brønn.
- Kontroller terskelsyklusen for mål-miRNA i hver prøve. Terskelsyklusen er skjæringspunktet mellom en forsterkningskurve og en terskellinje. Normaliser deretter uttrykksnivået for mål-miRNAer mot RNU6-2 som en endogen kontroll, og beregne det relative uttrykksnivået for mål-miRNAer ved hjelp av 2 - AΔCT- metoden 13 .
MERK: Det skal bemerkes at stabiliteten av uttrykksnivået for endogen kontroll miRNA skal verifiseres. I dette eksperimentet ble RNU6-2 bekreftet å bli uttrykt på høyt nivå og relativt uavhengig over hver gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som presenteres her er basert på vår tidligere rapporterte studie 8 . Vi undersøkte miRNA-uttrykksprofilen i peritoneal fibrose. Peritoneal fibrose er en viktig komplikasjon ved peritonealdialyse. Det er preget av tap av mesotelcellens monolag og overflødig akkumulering av ekstracellulære matriks komponenter, og er forbundet med peritoneal membransvikt 14 , 15 . En peritoneal fibrose rotte modell ble produsert ved intraperitoneal injeksjon av 100 ml / kg peritonealdialysevæske (2,5% glukose, 100 mM NaCl, 35 mM natriumlaktat, 2 mM CaCl2 og 0,7 mM MgCl2 inneholdende 20 mM metylglyoksal) i 5 Dager i uken i 3 uker til hannrotter i alderen 12 uker og med kroppsvekter på 230-250 g 16 . Følgende grupper fungerte som kontroller: rotter uten behandling (mock rotter) og rotter injisertMed peritonealdialysevæske uten metylglyoksal (kontrollrotter). Basert på miRNA microarray screening, fant vi at nivåene av seks miRNAer (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p) Signifikant økt i peritonealmembranen hos peritoneale fibrose rotter sammenlignet med de i rotte rotter og kontrollrotter ved å bruke qRT-PCR etter protokollen presentert i dette manuskriptet ( figur 1 ) 8 .
Figur 1: Upregulated miRNAs i peritoneal membran av peritoneal fibrosis rotter. QRT-PCR-bestemmelse av uttrykket av miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 og miRNA-34a-5p i rotte rotter (n = 6) , Kontrollrotter (n = 6) og peritoneale fibrose rotter (n = 6). Verdier er gjennomsnittlig ± standardfeil (feilfelt). Analyse av varians(ANOVA) ble ansatt for å undersøke forskjeller mellom grupper. Hvis statistisk signifikans ble oppdaget av ANOVA, ble Tukeys test utført som en post-hoc-analyse for å sammenligne midlene til to forskjellige grupper. Forskjeller med p-verdi <0,05 ble ansett som signifikante. Forkortelser: qRT-PCR, kvantitativ revers-transkripsjons-polymerasekjedereaksjon i sanntid; MiRNAs, microRNAs; NS, ikke signifikant; *, P <0,05. Denne figuren er blitt modifisert fra Morishita et al. 8 (med tillatelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved bruk av protokollen presentert i dette manuskriptet ble miRNAer i rotteperitonealmembran vellykket renset og detektert ved å bruke qRT-PCR. Pålideligheten av qRT-PCR-dataanalysen avhenger av kvaliteten på rensede miRNAer. Derfor kan renheten av miRNAs kontrolleres før qRT-PCR ved forholdet mellom absorbans ved 260 nm og det ved 280 nm, som kan måles ved bruk av et spektrofotometer. Når signifikant amplifisering av miRNA ikke kan oppnås ved bruk av qRT-PCR, kan konsentrasjonen av mal-cDNA økes. Konsentrasjonen av hver miRNA-spesifikk primer kan også økes.
Det finnes flere alternative metoder for å bestemme nivået av miRNA-ekspresjon, inkludert mikroarray, Northern blotting og ribonuclease protection assay. QRT-PCR er en sensitiv, høy gjennomstrømningsprosedyre som krever en minimal mengde prøve sammenlignet med Northern Blotting eller Ribonuclease Protection Assay. Microarrays muliggjør utredning av expRession av mange miRNAer samtidig, og dataene viser generelt en sterk korrelasjon med dataene som er oppnådd av qRT-PCR 17 ; Det er imidlertid ikke blitt enige om en metode som kan bekrefte gyldigheten av sammenligninger av mikroarray data mellom forskergrupper 18 .
Denne protokollen har følgende begrensninger. For det første har validering av miRNA-deteksjon ved denne protokollen ikke blitt verifisert i andre organer som lever, lunge og nyre. For det andre har det heller ikke blitt verifisert i andre eksperimentelle dyr, inkludert mus, hamster, hund og gris. Plattformen til denne protokollen for rensing av miRNAer ved bruk av en biopolymer-shredding-spinnkolonne og en silikamembranbasert spinnkolonne og deteksjon av miRNAer ved bruk av qRT-PCR har blitt rapportert å kunne rense høy kvalitet RNA fra vev og Viser høy nøyaktighet og sensitivitet for påvisning av miRNA-uttrykk 10, 11 . Vi viste også at deteksjon av miRNA-ekspresjon i rotteperitonealmembran kan velges med denne protokollen. Denne protokollen kan brukes til studier som undersøker profilen av miRNA-ekspresjon i peritonealmembranen hos rotter i et bredt spekter av patologiske forhold. I tillegg kan mange prøver behandles sammen ved hjelp av denne protokollen fordi det innebærer en enkel prosess. Derfor er denne protokollen nyttig for studier som krever analyse av uttrykksprofilen til mange miRNAer i forskjellige patologiske tilstander i peritonealmembranen.
Flere viktige punkter bør holdes i tankene når du følger denne protokollen. Først skal prøver som inneholder rensede RNA, plasseres på is for å unngå nedbrytning. I tillegg skal trinnet med homogenisering utføres på is for å beskytte RNAer mot varmedbrytning. Videre bør peritoneale membranprøver være tilstrekkelig homogenisert til de har koMpletely oppløst i lysisreagens, og bruk av en kolonnekniver for videre homogenisering anbefales fordi peritoneale membranprøver inneholder betydelig bindevev som er motstandsdyktig mot oppløsning ved homogenisering. For det andre bør stabiliteten av uttrykksnivået for endogen kontroll miRNA verifiseres over den eksperimentelle oppsettet i qRT-PCR. Dette er nødvendig fordi forskjellige patologiske forhold der denne prosedyren kan brukes, kan påvirke ekspressionsnivåene av endogene kontrollmRNAer, noe som kan kompromittere resultatene.
Til slutt har vi beskrevet en protokoll for rensing og deteksjon av mikroRNA-ekspresjon i rotte peritoneal membran ved å bruke qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Miyako Shigeta for sin gode tekniske støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av JSPS KAKENHI (bevilgningsnummer 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
