Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Published: August 4, 2017 doi: 10.3791/55813
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

Summary

يتم تقييم أساليب مختلفة للتعامل مع بنية ثلاثية الأبعاد في الهلاميات المائية على أساس البروتين هنا فيما يتعلق بالخصائص المادية. شبكات ماكروبوروس هي فونكتيوناليزيد مع لاصقة الخلية ببتيد، وهو تقييم جدواها في خلية ثقافة استخدام اثنين من خطوط الخلية نموذجا مختلفاً.

Abstract

الهلاميات المائية تعتبر المواد الواعدة لتطبيقات الثقافة الخلية نظراً لقدرتها على توفير بيئات خلية رطب جداً. ميدان 3D قوالب يتزايد نظراً للتشابه المحتمل لتلك المواد إلى المصفوفة خارج الخلية الطبيعية. الهلاميات المائية على أساس البروتين واعدة خاصة لأنها يمكن أن تكون فونكتيوناليزيد بسهولة ويمكن تحقيق هياكل المعرفة بالخصائص الفيزيائية للتعديل. ومع ذلك، يقتصر إنتاج قوالب ماكروبوروس 3D لتطبيقات ثقافة الخلية باستخدام المواد الطبيعية غالباً ما خواصها الميكانيكية الأضعف مقارنة بتلك المواد الاصطناعية. هنا، تم تقييم طرق مختلفة لإنتاج ألبومين المصل البقري ماكروبوروس (BSA)-على أساس النظم المائية، مع أحجام المسام قابل للتعديل في النطاق من 10 إلى 70 ميكرومتر في دائرة نصف قطرها. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء أسلوب لإنشاء القنوات في هذه المواد على أساس البروتين التي عدة مئات ميكرون طويلة. وجرى تحليل الأساليب المختلفة لإنتاج المسام، فضلا عن تأثير حجم المسام على خصائص المواد مثل تورم نسبة ودرجة الحموضة واستقرار درجة الحرارة والسلوك تدهور الانزيمية،. وتم التحقيق أحجام المسام في الدولة الأصلية، وتورم من الهلاميات المائية باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. تم تقييم الجدوى لخلية ثقافة التطبيقات استخدام إدارات لاصقة خلية ببتيد تعديل نظام البروتين واثنين من خطوط الخلية النموذجية: خلايا سرطان الثدي البشرية (A549) وأدينوكارسينوميك البشرية السنخية القاعدية الخلايا الظهارية (MCF7).

Introduction

الهلاميات المائية هي المواد التي تشكل شبكات ثلاثية الأبعاد غير قابلة للذوبان قادرة على ربط كميات كبيرة من المياه. هذه المواد يمكن أن توفر الظروف البيئية الممتازة للخلايا الحية. حاليا، هناك اهتمام متزايد في توليد هياكل ثلاثية الأبعاد المائية وتطوير عمليات تكييف خواصها الكيميائية والفيزيائية. حالما يتحقق ذلك، يمكن أن يكون قالب لنمو الخلايا، والتلاعب بالسلوك الخلوية ولدت1،2،،من34. هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد ليس فقط خلق بيئة أكثر طبيعية وواقعية من نهج ثنائي الأبعاد التقليدية، ولكنها أيضا تكشف عن إمكانيات جديدة لنمو الخلايا الجذعية أو نماذج الورم5. مواد مختلفة تمتلك مجموعة من الخصائص التي تعتمد أساسا على حجم المسام هلام6. المسام تلعب دوراً حاسما في خلية ثقافة التطبيقات وهندسة الأنسجة، والنمو الموجه للخلايا الجذعية. على سبيل المثال، نشر الأوكسجين والمواد الغذائية من خلال المصفوفة، وكميات كافية يجب أن تكون قادرة على الوصول إلى الخلايا7. من ناحية أخرى، يجب إزالة نواتج الأيض الضارة بأقصى سرعة ممكنة، ويجب أن تكون مساحة كافية لنمو الخلايا المتوفرة7. ونتيجة لذلك، الخصائص المادية، وبالتالي حجم المسام، شدة التأثير التطبيقات المحتملة الفائدة وممكن للمصفوفة. اعتماداً على خصائص المواد، يمكن أن تحدث عمليات نمو الخلايا المختلفة في ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك تشكيل هياكل الخلايا العصبية؛ نمو وتمايز خلايا الجلد أو العظام؛ وتوجيه نمو خطوط الخلايا الجذعية الخاصة، مثل خلايا الكبد أو الخلايا الليفية2،3،،من89،،من1011. هو آخر نقطة حاسمة التأثير على إمكانية تطبيق مادة استقرارها نحو12من المؤثرات الخارجية. على سبيل المثال، المائية يجب الحفاظ على سلامتها الميكانيكية في خلية ثقافة وسائل الإعلام أو في جسم الإنسان.

وفي السنوات الأخيرة، البحث في الخلية 3D الثقافة الهلاميات المائية تكثيف وأجريت دراسات عديدة لحل أبنية 3D ل نظم13. الأكثر شيوعاً هي التحقيق الهلاميات المائية تتألف من مكونات مركباً كيميائيا لأنه يمكن بسهولة تصنيعه وتعديله كيميائيا وهم يعرضون الاستقرار عالية (انظر تشو et al.، 2011 لاستعراض)5. ولكن البروتينات لديها العديد من الخصائص المفيدة: حسب ما يسمى "الدقة البوليمرات،" هم متوافق حيويا؛ لديهم طول محدد؛ فسهلة نسبيا لتعديله؛ ولديهم عدد كبير من المواقع المستهدفة14،15. وفي هذا الصدد، يمكن إنشاء هياكل محددة للغاية، ومبتكرة للتطبيق في العديد من المجالات. في هذه الدراسة، استخدمت المائية المستندة إلى بروتين16 إثبات قدرة الطرق الراسخة للتأثير على بنية ثلاثية الأبعاد للمواد. وعلاوة على ذلك، كان أيضا التحقيق بقدرة وانطباقها على توليد المسامية.

وتتوفر العديد من التقنيات المختلفة لتعديل هياكل ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك أساليب بسيطة وتقنيات متطورة، ودرجة عالية من التخصص من حقول مختلفة من العلوم المادية. تقنية على نطاق واسع هو استخدام اليكتروسبينينج لإنشاء هياكل محددة تحديداً جيدا17. ألياف مشحونة يتم سحبها من التوصل إلى حل بمجال الكهربائي ويصلب ثم عند التعرض للأوكسجين. وبهذه الطريقة، يمكن أن تنتج ألياف في نطاق نانومتر عدة تصل إلى عدة ميكرون. تقنيات إضافية لضبط حجم وهيكل، وتوزيع المسام داخل المصفوفة هي الطباعة الحجرية الناعمة، والتصويرية، تركز هيدرودينامية، الرش الكهربائية والبيولوجية-الطباعة18،،من1920. هو عيب كبير لهذه التقنيات الاعتماد على معدات معينة، ومكلفة، وخاصة مواد كيميائية أو مواد. وعلاوة على ذلك، التجربة مع هذه التقنيات في كثير من الأحيان لا التحويل مباشرة للمواد القائمة على البروتين، والعديد من المواد الكيميائية وأساليب ليست خلية متوافقة.

من ناحية أخرى، لا يعتمد العديد من تقنيات المعدات الخاصة، وجعلها أسهل وأرخص لتطبيق وإعادة إنتاج. هو أسلوب واسع النطاق للتلاعب بهيكل الصب المذيبات21،،من2223. تضاف قبل رد فعل البلمرة الجسيمات وتوزع المتجانس تشبع الحل. بعد البلمرة، وتغيير الشروط، مثل إضعاف أو تغيير درجة حموضة، يؤدي إلى المذيب الجزيئات، بينما يظل المسام ضمن المواد. المواد الكيميائية المستخدمة في هذه التقنيات، مثل الملح والسكر والكيروسين، الجيلاتين والطباشير، رخيصة ومتاحة بسهولة. في التجميد، جمدت الهلاميات المائية منتفخة. التسامي اللاحقة من مراحل السائل تحت فراغ ومن ثم تنفيذ23،،من2425. التسامي المياه من الشبكة لطيف ما يكفي للحفاظ على هياكل ثلاثية الأبعاد المحددة للمواد. في الغاز رغوة، هو تدفق حل مع غاز في حين البلمرة يأخذ مكان، تاركة المسام داخل جل21. أن حجم وتوزيع المسام يمكن تعديلها تبعاً لتيار الغاز.

تشكيل المائية البروتين، هو رد فعل جيش صرب البوسنة مع كلوريد فوسفونيوم تيتراكيس (هيدروكسيميثيل) (تهبك) في رد فعل من نوع مانيش للسماح لتكوين روابط تساهمية بين الأمينات الأولية ومجموعات هيدروكسي جزيء رابط أربعة مسلحين26. تتم إزالة وسيطة الضارة الممكنة بواسطة الغسيل المفرط للمواد بعد حدوث رد فعل.

وتوضح هذه الدراسة إمكانية علاج مواد المستندة إلى جيش صرب البوسنة مع تقنيات مختلفة لمعالجة وتكييف حجم المسام. كل من التقنيات يمكن استخدامها في أي مختبر في العالم، حسب الضرورة أي معدات خاصة. وباﻹضافة إلى ذلك، معلمات مختلفة، مثل نسبة تضخم والتحلل الأنزيمي واستقرار الأس الهيدروجيني وحساسية درجة الحرارة، تم فحص ومقارنة مع بعضها البعض، لا سيما احترام لتأثير مختلف التقنيات على توليد أبنية 3D. وأخيراً، كانت فونكتيوناليزيد المواد مع الببتيدات لاصقة خلية للتحقيق في إمكانية تطبيق المواد على الخلية والثقافة. واستخدمت اثنين من خطوط الخلية نموذجا مختلفاً: A549 و MCF7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد المائية

  1. مزيج 200 مغ من جيش صرب البوسنة مع 1 مل من منزوع ح2س لإنشاء 20% (w/v) جيش صرب البوسنة الأوراق المالية (الأسهم الحل A).
  2. ميليلتر 165 مزيج من تهبك الحل (134 ملغ/مل) مع 4.835 مل مياه لإنشاء تهبك الأسهم الحل (حل الأسهم ب).
  3. تزن 1 ملغ الببتيد (1,111.1 g/mol) ككسجكسرجدس (أو ما يعادل ببتيد لاصقة الخلية)، وتمييع في 100 ميليلتر من العقيم ح2س للحصول على حل 10 ملغ/مل (حل الأسهم ج).
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية، ويحتاج فقط إلى إدراجها إذا كان المقصود المائية لخلية ثقافة التطبيق.
  4. إزالة الجزء السفلي من لوحة 96-جيدا واستبداله بالاغطية البلاستيكية القابلة للإزالة.
    ملاحظة: للوحات المستخدمة هنا، الأسفل يمكن بسهولة إزالة عن طريق تطبيق الضغط على الجزء السفلي من كل بئر؛ ببساطة سوف تسقط أسفل البلاستيك رقيقة.
  5. مزيج 100 ميليلتر من حل جيش صرب البوسنة الأسهم (A) و 100 ميليلتر من تهبك الأسهم الحل (ب) (اختياري: 4 ميليلتر حل الأسهم ج الهلاميات المائية فونكتيوناليزيد، خلية لاصقة) في لوحة 96-جيدا للحصول على 200 ميليلتر من المائية. خلط المكونات التي بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 5 مرات لضمان المائية موحدة بعد البلمرة.
  6. ضع لوحة 96-جيدا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة حوالي 10 دقائق حتى يتم بلمرة الهلاميات المائية كافة بشكل صحيح.
  7. بعناية وبطء إزالة الأغطية البلاستيكية من الجزء السفلي من اللوحة.
  8. اضغط الهلاميات المائية الخروج من لوحة 96-جيدا باستخدام ختم صغيرة وتحويلها إلى أنابيب 1.5 مل مع PBS العقيمة، درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: قد الهلاميات المائية شكل أسطواني، مع ارتفاع 8 مم وقطرها حوالي 4 ملم.
  9. تخزين في الهلاميات المائية في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) عند 4 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر.

2-التجميد الهلاميات المائية

  1. ملء أنابيب 1.5 مل مع 500 ميليلتر من العقيمة منزوع ح2س وإزالة الغطاء. نقل الهلاميات المائية إلى رد فعل 1.5 مل الأنابيب باستخدام ملعقة.
  2. لف الأنابيب 1.5 مل محكم مع البارافين الفيلم في أقل من ثلاث طبقات لكل قنينة. استخدام إبرة لاختراق الثقوب الصغيرة في الفيلم لتمكين الإصدار الغاز من الأنبوب.
  3. للانتقال إلى إحدى الخطوات التالية:
    1. نقل القنينة إلى حل النتروجين السائل لمدة 5 دقائق لضمان أن المياه والمائية تجمد تماما. فورا بعد إزالة من النيتروجين السائل، نقل في القنينات لتجميد مجفف لمنع المواد من ذوبان الجليد.
      ملاحظة: هذا الإجراء ينتج المسام حول 10-15 ميكرون في دائرة نصف قطرها.
    2. الاحتفاظ قارورة في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها تجميد الهلاميات المائية بطء. فورا بعد إزالة من-20 درجة مئوية، نقل في القنينات لتجميد مجفف لمنع المواد من ذوبان الجليد.
      ملاحظة: هذا الإجراء ينتج المسام عن 50-60 ميكرومتر في دائرة نصف قطرها.
  4. بعد 24 ساعة (وتبخر الماء في وحول المائية الكامل)، ذوبان المواد قبل إزالته من تجميد مجفف.
    ملاحظة: يمكن تحليل أحجام المسام مع الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (الخطوة 5، "هيدروجيل التصور").

3-الجسيمات النض

  1. إعداد المائية كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 1-5.
  2. مباشرة بعد خلط المكونات، إضافة كلوريد الصوديوم حتى يحدث التشبع (36 ملغ/مل). إضافة الملح حتى كريستال ملح يمكن اعتبار في الحل ترسبات بيضاء.
  3. نقل لوحة 96-جيدا إلى شاكر ويهز حتى تتم البلمرة (حوالي 10 دقائق). إزالة الهلاميات المائية من اللوحة، كما هو موضح في الخطوات 1.7-1.8.
  4. احتضان الهلاميات المائية لمالا يقل عن 24 ساعة في RT في الماء المعقم على شاكر (20 لفة في الدقيقة) الوتي الملح من القالب المائية. تخزين في الهلاميات المائية عند 4 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني لتصل إلى عدة أشهر.

4. تكوين القناة

  1. تحضير الهلاميات المائية كما هو موضح في الخطوة 1. إزالة المائية من الحل باستخدام كماشة وإزالة المياه الزائدة مع ورقة ماصة جداً ووضعه على رأس كتلة من الثلج الجاف.
  2. تجميد المائية لمدة 30 ثانية وإزالته بعناية من الكتلة. لا تضر المائية؛ استخدام ملعقة بعناية لتتخلص من خارج الكتلة. نقل المائية إلى أنبوب 1.5 مل والجافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

5-Hydrogel التصور

  1. تحضير حلاً أسهم والرودامين ب بتمييع 1 مغ والرودامين ب في 10 مل من برنامج تلفزيوني. إعداد إضعاف مسلسل بتمييع الحل والرودامين الأسهم في برنامج تلفزيوني حتى يتم التوصل إلى تركيز من 0.001 مغ/مل (عامل التخفيف: 100)
  2. إزالة المائية من حل تخزين (مثلاً، من الخطوة 2.4.) ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل مع 1 مل من محلول والرودامين ب 0.01 ملغ/مل. البقع المائية بين عشية وضحاها في حل والرودامين ب في الرايت
  3. وفي اليوم التالي نقل المائية التي تصور إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) والمياه والصرف الصحي على الأقل 3 ح.
  4. نقل المائية إلى شريحة μ 8 جيدا وتغطية ذلك مع برنامج تلفزيوني.
  5. قطع شرائح صغيرة من أصل المائية (حوالي 0.5 مم في الارتفاع) باستخدام شفرة.
  6. باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر، تصور المائية على طول موجي 514 nm (الهدف: "المفوضية الأوروبية" خطة-نيوفلوار 40 x/1.30 النفط DIC M27، وضع المسح الضوئي الطائرة: 514 شمال البحر الأبيض المتوسط، والتكبير: 1 X).

6-خلية ثقافة الجدوى

  1. عقيمة تصفية جميع الأسهم الحلول (أ وب وج) مع عامل تصفية 0.45 ميكرومتر.
  2. إعداد المائية كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.4، بما في ذلك الببتيد لاصقة الخلية قبل البلمرة المائية.
  3. بعد خلط المكونات، فورا "الماصة؛" الخليط في شريحة μ 8 جيدا حتى تغطي القاع تماما.
    ملاحظة: هذه الخطوة يجب إجراء سريعاً ومباشرة بعد خلط المكونات، كما تجري البلمرة في غضون دقائق في الشريحة.
  4. الثقافة التصاق الخلايا ومرور للحصول على تعليق خلية واحدة باستخدام تقنيات استزراع الخلايا القياسية. نقل الخلايا إلى المعالجون مسبقاً، دميم العقيمة خلية الثقافة المتوسطة وتستكمل مع المصل البقري الجنين (FBS، 10% (w/v))، البنسلين-ستربتوميسين (1% (w/v))، وحل الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM، 1% (w/v)).
  5. عد الخلايا مع نويباور العد الدائرة وعناية ماصة 200 ميليلتر من العدد المطلوب من الخلايا (2 × 105 خلايا/سم2) على سطح المائية.
  6. تغطية μ-الشريحة 8 جيدا مع الغطاء ونقلها إلى حاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2). احتضانها لمالا يقل عن 4 ح عند 37 درجة مئوية.
  7. بعد على الأقل 4 ح مرفق الهاتف الخلوي، غسل الخلايا مرتين مع 200 ميليلتر من الخلية العقيمة والثقافة برنامج تلفزيوني.
  8. إصلاح الخلايا مع 200 ميليلتر من فورمالدهايد 3.7% (v/v) لمدة 10 دقائق في الرايت ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني (~ 200 ميليلتر).
    ملاحظة: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الفورمالدهيد.
  9. بيرميبيليزي الخلايا مع 200 ميليلتر من 0.1% X تريتون لأدنى 5 يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  10. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على فالويدين-والرودامين بخلط 5 ميليلتر للأوراق المالية باثانول مع ميليلتر 195 من برنامج تلفزيوني وإضافتها إلى الخلايا في الرايت وصمة عار الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام. تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  11. التحقيق في خصائص التصاق الخلايا باستخدام مجهر [كنفوكل] في 514 nm (الهدف: "المفوضية الأوروبية" خطة-نيوفلوار 40 x/1.30 النفط DIC M27، وضع المسح الضوئي الطائرة: 514 شمال البحر الأبيض المتوسط، والتكبير: 1 X). تحليل الصور باستخدام البرمجيات المناسبة (انظر الجدول للمواد).

7-Hydrogel خصائص

  1. نسبة تضخم.
    1. تماما الجاف الهلاميات المائية في 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد على الأقل.
    2. تزن كل المائية وملاحظة الوزن الدقيق.
    3. ملء أنبوب رد فعل 2 مل مع 1.5 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. نقل المائية في هذا الأنبوب رد فعل 2 مل وتزج تماما أنه في برنامج تلفزيوني.
    5. ترك المائية مدة يومين على الأقل في برنامج تلفزيوني على RT للوصول إلى توازن مع برنامج تلفزيوني.
    6. بعد ثلاثة أيام، إزالة المائية من الحل والجافة منديل ورق لإزالة الماء الزائد من سطح المائية.
    7. تزن المائية.
    8. حساب نسبة تضخم باستخدام الصيغة التالية:
      Equation
      حيث ثد هو وزن هلام المجففة (الخطوة 7.1.2.) و Ws هو الوزن الرطب جل (الخطوة 7.1.7). تتضاعف مع 100 للحصول على % نسبة تضخم.
  2. استقرار الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة.
    1. نقل 5 مل من برنامج تلفزيوني لأنبوب 15 مل رد فعل.
    2. ضبط الحل على درجة الحموضة المناسبة (مثل درجة الحموضة 2 أو 7 أو 10) مع هيدروكسيد الصوديوم و HCl. إحضار الحل إلى درجة الحرارة المناسبة (مثلاً، الرايت، 37 درجة مئوية، أو 80 درجة مئوية).
    3. نقل المائية التي يتم التحقيق فيها لاستقرارها في الحل المناسب. تعديل درجة الحموضة إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: جميع الهلاميات المائية ينبغي تماما منتفخة عند هذه النقطة (انظر نسبة تضخم) لمنع التفسير غير صحيح للوزن بسبب تورم المواد.
    4. بعد فترات زمنية معينة، إزالة المائية من الحل (مثلاً كل ساعة لمدة تصل إلى 2 يوما)، الجافة مع أنسجة ورقة ماصة جداً إزالة الماء الزائد، وتزن عليه.
  3. تدهور الانزيمية.
    1. تعد حلاً إنزيم أسهم 300 ش التربسين وبيبسن، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    2. نقل المائية (مثلاً، من الخطوة 1.8) إلى الحل المناسب.
      ملاحظة: جميع الهلاميات المائية ينبغي تماما منتفخة عند هذه النقطة للحيلولة دون التفسير غير صحيح للوزن.
    3. بعد فترات زمنية معينة، إزالة المائية من الحل (مثلاً كل ساعة)، الجافة مع أنسجة ورقة ماصة جداً إزالة الماء الزائد، وتزن عليه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر "ستيفتونغ" بادن-فورتنبرغ لتقديم الدعم المالي في إطار "توليف مواد بيوينسبيريد" (بيوماتس-14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8%, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1% Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7% Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1.5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 126، المائية، خصائص المواد، المسام الأحجام، خلية ثقافة، البوليمرات الحيوية، والهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد
سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodenberger, N., Kubiczek, D.,… More

Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter