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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Manipulation facile des Architectures à base de protéines Hydrogels pour Applications de Culture de cellules

Published: August 4, 2017 doi: 10.3791/55813
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

Summary

Différentes méthodes pour manipuler l’architecture tridimensionnelle en hydrogels à base de protéines sont évaluées ici en ce qui concerne les propriétés du matériau. Les réseaux macroporeux sont fonctionnalisés avec un peptide de la cellule-adhésif et leur faisabilité en culture cellulaire est évaluée à l’aide de deux lignées de cellules de modèle différent.

Abstract

Les hydrogels sont reconnus comme matière intéressante pour les applications de culture de cellules en raison de leur capacité à fournir des environnements de cellules fortement hydraté. Le domaine des modèles 3D est en hausse en raison de la ressemblance potentielle de ces matières à la matrice extracellulaire naturelle. Hydrogels à base de protéines sont particulièrement prometteuses car elles peuvent facilement être fonctionnalisés et peuvent atteindre les structures définies avec des propriétés physicochimiques réglables. Cependant, la production de modèles 3D macroporeux pour applications de culture de cellules à l’aide de matériaux naturels est souvent limitée par leurs caractéristiques mécaniques plus faibles comparés à ceux des matériaux synthétiques. Ici, différentes méthodes ont été évaluées pour produire macroporeux l’albumine sérique bovine (BSA)-systèmes d’hydrogel, avec la taille des pores réglable de l’ordre de 10 à 70 µm en rayon. En outre, une méthode pour générer des chaînes dans ce matériau à base de protéines qui sont plusieurs centaines microns de longs a été créée. Les différentes méthodes pour produire des pores, ainsi que l’influence de la taille des pores sur propriétés matérielles telles que gonflement ratio, pH, stabilité de la température et le comportement de la dégradation enzymatique, ont été analysés. La taille des pores ont été étudiée dans l’état natif, gonflée de l’hydrogel utilisant laser confocal, microscopie à balayage. La possibilité pour les applications de culture cellulaire a été évaluée en utilisant une cellule adhésive RGD peptide modification des protéines et deux lignées de cellules de modèle : cellules cancéreuses humaines (A549) et adenocarcinomic alvéolaires basale des cellules épithéliales humaines (MCF7).

Introduction

Les hydrogels sont des matériaux qui forment des réseaux insolubles 3D capable de se lier de grandes quantités d’eau. Ces matières peuvent fournir d’excellentes conditions environnementales pour les cellules vivantes. Actuellement, il y un intérêt croissant dans la génération de structures tridimensionnelles hydrogel et dans le développement de procédés d’adapter leurs propriétés chimiques et physiques. Une fois que ce résultat est obtenu, un modèle pour la croissance des cellules et la manipulation du comportement cellulaire peut être généré1,2,3,4. Ces structures 3D non seulement de créer un environnement plus naturel et réaliste que les approches classiques de deux dimensions, mais ils également révéler de nouvelles possibilités pour la croissance des cellules souches ou tumeur modèles5. Différents matériaux possèdent un éventail de caractéristiques qui dépendent principalement de la taille des pores du gel6. Les pores jouent un rôle crucial dans les applications de culture de cellules, génie tissulaire et la croissance dirigée de cellules souches. Par exemple, oxygène et nutriments diffusent à travers la matrice, et une quantité adéquate doit être en mesure d’atteindre les cellules de7. En revanche, les métabolites nuisibles doivent être retirés aussi vite que possible et suffisamment d’espace pour la croissance cellulaire doit être disponible7. Par conséquent, les propriétés du matériau et donc la taille des pores, influencent fortement les applications potentielles, avantage et, éventuellement, de la matrice. Selon les propriétés des matériaux, des processus différents-la croissance des cellules peuvent se produire dans une culture cellulaire 3D, y compris la formation des structures neuronales ; la croissance et la différenciation des cellules de la peau ou des os ; et la croissance dirigée spécial de lignées de cellules, comme les hépatocytes ou fibroblastes2,3,8,9,10,11. Un autre point crucial qui influent sur l’application éventuelle d’un matériau est sa stabilité à des stimuli externes12. Par exemple, l’hydrogel doit maintenir son intégrité mécanique dans les milieux de culture cellulaire ou le corps humain.

Ces dernières années, la recherche sur 3D cell culture hydrogels intensifiées, et de nombreuses études ont été menées pour résoudre les architectures 3D des systèmes13. Hydrogels composées d’éléments chimiquement synthétisés sont étudiées plus souvent parce qu’ils peuvent être facilement synthétisés et chimiquement modifiées et qu’ils présentent une haute stabilité (voir Zhu et al., 2011 pour un examen)5. Cependant, les protéines ont de nombreuses propriétés bénéfiques : comme ce que l'on appelle « polymères de précision, » ils sont biocompatibles ; ils ont une longueur définie ; ils sont relativement faciles à modifier ; et ils ont un grand nombre de cibles sites14,15. À cet égard, des structures très spécifiques et innovantes peuvent être générés pour application dans de nombreux domaines. Dans cette étude, un hydrogel à base de protéines16 a été utilisé pour démontrer l’aptitude des méthodes bien établies pour influencer l’architecture 3D de la matière. En outre, la capacité d’et l’applicabilité à la génération de pore a été également étudiée.

Il existe beaucoup de techniques différentes modifier des structures 3D, y compris les méthodes simples et des techniques sophistiquées, hautement spécialisés de différents domaines de la science des matériaux. Une technique très répandue est l’utilisation d’électrofilage pour générer des structures bien définies,17. Fibres chargées sont tirés d’une solution par un champ électrique et puis se solidifient au contact de l’oxygène. De cette façon, les fibres de l’ordre de quelques nanomètres à quelques microns peuvent être produites. Autres techniques pour régler la taille, la structure et la distribution des pores dans la matrice sont doux lithographie, photolithographie, focalisation hydrodynamique, electro-pulvérisation et bio-impression18,19,20. Un inconvénient important de ces techniques est leur dépendance envers l’équipement spécifique et coûteux et des produits chimiques spéciaux ou des matériaux. En outre, expérience avec ces techniques n’est souvent pas directement transférable aux matériaux à base de protéine, et la plupart des produits chimiques et méthodes ne sont pas portable compatible.

En revanche, beaucoup de techniques ne comptez pas sur un équipement spécial, ce qui les rend plus facile et moins coûteux à appliquer et à reproduire. Une méthode répandue pour la manipulation de la structure est coulée solvant21,22,23. Les particules sont ajoutés avant la réaction de polymérisation et sont distribués de façon homogène pour saturer la solution. Après la polymérisation, une modification des conditions, comme une dilution ou une modification de pH, mène à la solvatation des particules, tandis que les pores restent dans le matériau. Les produits chimiques utilisés dans ces techniques, comme le sel, sucre, paraffine, gélatine et la craie, sont bon marché et facilement disponible. En lyophilisation, hydrogels gonflés sont gelés. La sublimation subséquente des phases liquides sous un vide est ensuite effectué23,24,25. Sublimation de l’eau du réseau est assez douce pour maintenir les structures 3D spécifiques du matériau. En gaz écumant, une solution est transmis en continu avec un gaz alors que la polymérisation se déroule, en laissant les pores dans le gel de21. La taille et la distribution des pores est réglable selon le flux de gaz.

Pour former l’hydrogel de protéine, BSA réagit avec le chlorure de tétrakis (hydroxyméthyl) phosphonium (THPC) dans une réaction de Mannich-type afin de permettre la formation de liaisons covalentes entre les amines primaires et les groupes hydroxyles de la molécule de quatre bras linker26. Intermédiaires nuisibles possibles sont éliminés par lavage excessif du matériel après que la réaction se produit.

Cette étude démontre la possibilité de traiter un matériau à base de BSA avec différentes techniques pour manipuler et adapter la taille des pores. Chacune des techniques peut être utilisé dans n’importe quel laboratoire dans le monde entier, car aucun équipement spécial n’est nécessaire. En outre, différents paramètres, tels que taux de gonflement, dégradabilité enzymatique, stabilité de pH et sensibilité à la température, examinées et comparées entre elles, en particulier quant à l’influence des différentes techniques sur la génération des architectures 3D. Enfin, les matériaux ont été fonctionnalisés avec des peptides de cellule-adhésif pour examiner l’application possible du matériel pour la culture cellulaire. Deux lignées de cellules de différents modèles ont été utilisées : A549 et MCF7.

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Protocol

1. préparation de l’Hydrogel

  1. Mélanger 200 mg de BSA à 1 mL de désionisée H2O créer 20 % (p/v) BSA stock (stock solution A).
  2. Mix 165 µL de solution THPC (134 mg/mL) avec 4,835 mL d’eau désionisée pour créer THPC solution (solution mère B) mère.
  3. Peser à 1 mg de KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptide (ou un peptide de cellule-adhésif équivalent) et le diluer dans 100 µL de stérile H2O pour obtenir une solution de 10 mg/mL (solution mère C).
    Remarque : Cette étape est facultative et ne doit être inclus si l’hydrogel est destiné à la demande de culture de cellules.
  4. Supprimer le fond d’une plaque 96 puits et remplacez-le par une enveloppe en plastique amovible.
    Remarque : Pour les plaques utilisées ici, le fond s’éliminent facilement en appliquant une pression vers le bas de chaque puits ; le fond en plastique mince tomberont tout simplement.
  5. Mélanger 100 µL de la solution mère de BSA (A) et 100 µL de THPC stock solution (B) (en option : 4 µL de la solution C pendant les hydrogels fonctionnalisés, cellule-adhésif) dans la plaque à 96 puits d’obtenir 200 µL d’hydrogel. Mélanger les composants de pipetage de haut en bas au moins 5 fois pour garantir un hydrogel en uniform après polymérisation.
  6. Placer la plaque à 96 puits à température ambiante (RT) pendant environ 10 min jusqu'à ce que tous les hydrogels sont polymérisés correctement.
  7. Lentement et soigneusement retirer la pellicule de plastique du bas de la plaque.
  8. Appuyez sur les hydrogels hors de la plaque à 96 puits à l’aide d’un petit cachet et transférez-les sur tubes de 1,5 mL avec du PBS stérile, pH 7,4.
    Remarque : Les hydrogels ont une forme cylindrique, d’un diamètre d’environ 4 mm et une hauteur de 8 mm.
  9. Stocker les hydrogels en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C pendant plusieurs mois.

2. lyophilisation les Hydrogels

  1. Remplir les tubes de 1,5 mL avec 500 µL de stérile désionisée H2O et enlever le bouchon. Transférer les hydrogels dans les tubes de réaction de 1,5 mL à l’aide d’une spatule.
  2. Envelopper les tubes de 1,5 mL étroitement avec paraffine film-au moins trois couches pour chaque flacon. Utiliser une aiguille pour percer de petits trous dans le film pour permettre le dégagement de gaz dans le tube.
  3. Procédez à l’une des étapes suivantes :
    1. Transférer le flacon de solution d’azote liquide pendant 5 min afin de garantir que l’eau et hydrogel geler complètement. Immédiatement après le retrait de l’azote liquide, transférer les flacons dans le gel sèche pour éviter que le matériau de la fonte.
      Remarque : Cette procédure résultats pores environ 10 à 15 µm de rayon.
    2. Garder les flacons à-20 ° C durant la nuit à geler lentement les hydrogels. Immédiatement après le retrait de-20 ° C, transférer les flacons dans le gel sèche pour éviter que le matériau de la fonte.
      Remarque : Cette procédure résultats pores environ 50-60 µm en rayon.
  4. Après 24h (et l’évaporation complète de l’eau dans et autour de l’hydrogel), décongeler le matériau en le supprimant de la gel sèche.
    Remarque : La taille des pores peut être analysée avec laser confocal, microscopie (étape 5, « Visualisation de l’Hydrogel »).

3. particules lessivage

  1. Préparer l’hydrogel tel que décrit dans les étapes 1.1-1.5.
  2. Directement après mélange des composants, ajoutez NaCl jusqu'à ce que la saturation produit (36 mg/mL). Ajouter du sel jusqu'à ce qu’un cristal de sel peut être assimilé dans la solution un précipité blanc.
  3. Transférer la plaque 96 puits dans un shaker et agiter jusqu'à ce que la polymérisation se déroule (env. 10 min). Retirer les hydrogels de la plaque, comme décrit dans les étapes de 1,7 à 1,8.
  4. Incuber les hydrogels pendant au moins 24 h à RT dans de l’eau stérile sur un agitateur (20 tr/min) pour éluer tout le sel du modèle hydrogel. Stocker les hydrogels à 4 ° C dans du PBS pour plusieurs mois.

4. Formation de channel

  1. Préparer les hydrogels tel que décrit à l’étape 1. Retirer un hydrogel de solution à l’aide d’une pince, retirer l’eau excédentaire avec du papier absorbant et placez-le sur le dessus un bloc de glace sèche.
  2. Geler l’hydrogel pour 30 s et retirez-la avec précaution du bloc. Ne pas endommager l’hydrogel ; avec précaution, utilisez une spatule pour gratter le bloc. Transférer l’hydrogel dans un tube de 1,5 mL et faites-le sécher pendant une nuit à 37 ° C.

5. Hydrogel visualisation

  1. Préparer une solution la rhodamine B en diluant 1 mg de la rhodamine B dans 10 mL de PBS. Préparer une dilution en série en diluant la solution mère de rhodamine dans du PBS jusqu'à obtenir une concentration de 0,001 mg/mL (facteur de dilution : 100)
  2. Retirer l’hydrogel de la solution de stockage (par exemple, de l’étape 2.4.) et transférez-le dans un tube de 1,5 mL avec 1 mL de solution de la rhodamine B 0,01 mg/mL. Tache de l’hydrogel nuit à la solution de la rhodamine B à température ambiante.
  3. Le lendemain, transférer l’hydrogel qui doit être visualisé à 10 mL de PBS (pH 7,4) et lavage pendant au moins 3 h.
  4. Transférer l’hydrogel sur une 8 µ-lame bien et couvrir avec du PBS.
  5. Couper des tranches petits hors de l’hydrogel (environ 0,5 mm de hauteur) à l’aide d’une lame.
  6. En utilisant un confocal laser scanning microscope, visualiser l’hydrogel à une longueur d’onde de 514 nm (objectif : ce Plan-Neofluar 40 x / 1,30 huile DIC M27, mode de numérisation de plan : 514 nm et zoom : 1 X).

6. cellule Culture faisabilité

  1. Stérile-filtre tout stock solutions (A, B et C) avec un filtre de 0,45 µm.
  2. Préparer l’hydrogel comme décrit aux points 1.1 à 1.4, y compris le peptide de cellule-adhésif avant la polymérisation de l’hydrogel.
  3. Après mélange des composants, Pipeter immédiatement le mélange dans un 8 µ-slide bien jusqu'à ce que le fond est complètement couvert.
    Remarque : Cette étape doit être exécutée rapidement et directement après mélange des composants, comme la polymérisation a lieu quelques minutes dans la diapositive.
  4. Cellules de culture adhérence et passage pour obtenir une suspension de cellules individuelles en utilisant des techniques de culture cellulaire standard. Transférer les cellules dans le milieu, milieu de culture de cellule stérile DMEM additionné de sérum fœtal (SVF, 10 % (p/v)), la pénicilline-streptomycine (1 % (p/v)) et la solution d’acides aminés non essentiels (MEM, 1 % (p/v)).
  5. Compter les cellules avec un Neubauer comptant chambre et soigneusement pipette de 200 µL du nombre désiré de cellules (2 x 105 cellules/cm2) sur la surface de l’hydrogel.
  6. Colorer µ-8 bien avec le couvercle et le transférer dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2). Incuber pendant au moins 4 h à 37 ° C.
  7. Après au moins 4 h d’attachement cellulaire, laver les cellules deux fois avec 200 µL de culture de cellules stériles PBS.
  8. Fixer les cellules avec 200 µL de 3,7 % (v/v) de formaldéhyde pendant 10 min à RT et laver deux fois avec du PBS (~ 200 µL).
    NOTE : Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de formaldéhyde.
  9. Permeabilize les cellules avec 200 µL de 0,1 % Triton X pendant 5 min. Laver deux fois avec du PBS.
  10. Colorer les cellules avec la phalloïdine-rhodamine en mélangeant 5 µL de méthanol stock 195 µl de PBS et ajoutant aux cellules à RT. tache les cellules pendant 20 min dans le noir. Laver deux fois avec du PBS.
  11. Étudier les propriétés d’adhérence de cellules à l’aide d’un microscope confocal à 514 nm (objectif : ce Plan-Neofluar 40 x / 1,30 huile DIC M27, mode de numérisation de plan : 514 nm et zoom : 1 X). Analyser les images à l’aide d’un logiciel approprié (voir la Table des matières).

7. Propriétés Hydrogel

  1. Taux de gonflement.
    1. Sécher complètement les hydrogels à 37 ° C pendant au moins une journée.
    2. Peser chaque hydrogel et noter le poids exact.
    3. Remplir un tube de réaction de 2 mL par 1,5 mL de PBS.
    4. Transférer l’hydrogel dans ce tube de réaction de 2 mL et le plonger complètement dans du PBS.
    5. Laissez l’hydrogel au moins deux jours dans du PBS à la droite pour atteindre l’équilibre avec du PBS.
    6. Après trois jours, retirez l’hydrogel de la solution et sécher avec un mouchoir en papier pour enlever l’eau en excès de la surface de l’hydrogel.
    7. Peser l’hydrogel.
    8. Calculer le taux de gonflement à l’aide de la formule suivante :
      Equation
      où Wd est le poids du gel sec (étape 7.1.2.) et Ws , c’est le poids du gel humide (étape 7.1.7). Multiplier par 100 pour obtenir le pourcentage de ratio gonflement.
  2. stabilité de pH et de température.
    1. Transférer 5 mL de PBS dans un tube de réaction de 15 mL.
    2. Ajuster la solution au pH approprié (par exemple, pH 2, 7 ou 10) avec NaOH et HCl. apportent la solution à la température appropriée (p. ex., RT, 37 ° C ou 80 ° C).
    3. Transférer l’hydrogel qui doit être étudié pour sa stabilité dans la solution appropriée. Réajuster le pH si nécessaire.
      Remarque : Tous les hydrogels devrait être complètement gonflés à ce stade (voir le rapport de gonflement) pour éviter la mauvaise interprétation du poids à cause de l’enflure de la matière.
    4. Après certains intervalles de temps, retirer l’hydrogel de la solution (par exemple, chaque heure pendant 2 jours), sécher avec un mouchoir en papier très absorbant pour enlever l’excès d’eau et pesez-le.
  3. Dégradation enzymatique.
    1. Préparer une solution d’enzyme stock de 300 U trypsine et la pepsine, selon les instructions du fabricant.
    2. Transférer l’hydrogel (p. ex., à l’étape 1.8) à la solution appropriée.
      NOTE : Tous les hydrogels doivent être complètement gonflés à ce stade afin d’éviter la mauvaise interprétation du poids.
    3. Après certains intervalles de temps, retirer l’hydrogel de la solution (par exemple, chaque heure), sécher avec un mouchoir en papier très absorbant pour enlever l’excès d’eau et pesez-le.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs tiens à remercier la Fondation Baden-Württemberg pour leur soutien financier dans le cadre de la « Synthèse de matériaux Bioinspired » (Biotextiles-14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8%, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1% Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7% Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1.5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biochimie numéro 126 Hydrogel propriétés des matériaux des pores tailles culture cellulaire biopolymères architecture 3D
Manipulation facile des Architectures à base de protéines Hydrogels pour Applications de Culture de cellules
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Bodenberger, N., Kubiczek, D.,… More

Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

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