Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Published: August 4, 2017 doi: 10.3791/55813
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

Summary

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Abstract

Hydrogels worden erkend als veelbelovende materialen voor cel cultuur toepassingen vanwege hun vermogen om bieden zeer gehydrateerd cel omgevingen. Het gebied van 3D sjablonen stijgt als gevolg van de potentiële gelijkenis van die materialen naar de natuurlijke extracellulaire matrix. Hydrogels op basis van eiwitten zijn bijzonder veelbelovend, omdat ze gemakkelijk kunnen worden matiemaatschappij en gedefinieerde structuren met verstelbare fysisch-chemische eigenschappen kunnen bereiken. De productie van de 3D sjablonen macroporeuze voor cel cultuur toepassingen met behulp van natuurlijke materialen wordt echter vaak beperkt door hun zwakkere mechanische eigenschappen vergeleken met die van synthetische materialen. Hier, verschillende methoden werden geëvalueerd om te produceren macroporeuze bovien serumalbumine (BSA)-gebaseerde hydrogel systemen, met verstelbare porie formaten in het bereik van 10 tot en met 70 µm in straal. Bovendien is een methode voor het genereren van kanalen in dit materiaal op basis van eiwitten die verschillende honderd micron lange opgericht. De verschillende methoden voor de productie van poriën, evenals de invloed van poriegrootte op materiaaleigenschappen zoals zwelling verhouding, pH, temperatuur stabiliteit en enzymatische afbraak gedrag, werden geanalyseerd. Porie maten werden onderzocht in de native, gezwollen Braziliaanse deelstaat de hydrogels met behulp van confocale laser scanning microscopie. De haalbaarheid voor cel cultuur toepassingen werd geëvalueerd aan de hand van een cel-lijm RGD peptide wijziging van het systeem van eiwit en twee model cellijnen: menselijke borstkankercellen (A549) en adenocarcinomic menselijke alveolaire basale epitheliale cellen (MCF7).

Introduction

Hydrogels zijn materialen die vormen van onoplosbare 3D netwerken kunnen grote hoeveelheden water bindend. Dergelijke materialen bieden uitstekende omgevingsvoorwaarden voor levende cellen. Op dit moment, er is steeds meer belangstelling in de generatie van driedimensionale hydrogel structuren en de ontwikkeling van procédés voor het aanpassen van hun chemische en fysische eigenschappen. Zodra dit gebeurt, kan een sjabloon voor de groei van cellen en de manipulatie van cellulaire gedrag gegenereerde1,2,3,4. Deze 3D structuren niet alleen maakt een meer natuurlijke en realistische omgeving dan conventionele tweedimensionale benaderingen, maar ze ook onthullen nieuwe mogelijkheden voor de groei van stamcellen of tumor5modellen. Verschillende materialen bezitten een aantal kenmerken die vooral afhankelijk zijn van de poriegrootte van het gel-6. De poriën spelen een cruciale rol in de gestuurde groei van stamcellen cel cultuur toepassingen en weefselkweek. Bijvoorbeeld, zuurstof en voedingsstoffen verspreiden via de matrix, en voldoende hoeveelheden moeten kunnen bereiken van de cellen7. Aan de andere kant, schadelijke metabolieten moeten zo spoedig mogelijk worden verwijderd, en moet voldoende ruimte bieden voor celgroei beschikbaar7. Bijgevolg beïnvloeden de eigenschappen van het materiaal, en dus de poriegrootte, ernstig de potentiële voordelen en mogelijke toepassingen van de matrix. Afhankelijk van de eigenschappen van het materiaal, kunnen verschillende celgroei processen optreden in de 3D-celkweek, met inbegrip van de vorming van neuronale structuren; de groei en differentiatie van huid of bot cellen; en de gestuurde groei van speciale stamcellijnen, zoals hepatocyten of fibroblasten2,3,8,9,10,11. Een ander cruciaal punt beïnvloeden de eventuele toepassing van een materiaal, is zijn stabiliteit naar externe prikkels12. Bijvoorbeeld, moet de hydrogel zijn mechanische integriteit in cel voedingsbodems of het menselijk lichaam.

In de afgelopen jaren onderzoek naar 3D cel cultuur hydrogels geïntensiveerd, en vele studies werden uitgevoerd om te lossen van de 3D-platforms van de systemen-13. Hydrogels bestaat uit chemisch gesynthetiseerde onderdelen zijn meestal onderzocht omdat zij kunnen gemakkelijk gesynthetiseerd en chemisch bewerkt en ze vertonen een hoge stabiliteit (Zie Zhu et al., 2011 herzieningsverzoek)5. Eiwitten hebben echter vele heilzame eigenschappen: als zogenaamde "precisie polymeren," ze zijn biocompatibel; ze hebben een gedefinieerde lengte; ze zijn relatief makkelijk te wijzigen; en ze hebben een groot aantal doel sites14,15. In dit opzicht kunnen zeer specifieke, innovatieve structuren worden gegenereerd voor toepassing op vele terreinen. In deze studie werd een op basis van eiwitten hydrogel16 gebruikt om aan te tonen van het vermogen van gevestigde methoden om de invloed van de 3D-architectuur van het materiaal. Bovendien, het vermogen en de toepasbaarheid op porie generatie werd eveneens onderzocht.

Veel verschillende technieken zijn beschikbaar voor het wijzigen van 3D-structuren, met inbegrip van zowel eenvoudige methoden en geavanceerde, zeer gespecialiseerde technieken uit verschillende gebieden van de materiaalkunde. Een wijdverbreide techniek is het gebruik van electrospinning voor het genereren van welomschreven structuren17. Geladen vezels zijn getrokken uit een oplossing door een elektrisch veld en vervolgens stollen bij blootstelling aan zuurstof. Op deze manier kunnen de vezels in de range van verschillende nanometer tot verschillende micron worden geproduceerd. Additionele technieken om af te stemmen op de grootte, structuur en verdeling van de poriën in de matrix zijn zachte lithografie fotolithografie, hydrodynamische gericht, electro-spuiten, en bio-afdrukken18,19,20. Een belangrijk nadeel van deze technieken is hun afhankelijkheid op specifieke en dure apparatuur en speciale chemische stoffen of materialen. Bovendien ervaring met deze technieken is vaak niet direct overdraagbaar naar materialen op basis van eiwitten, en veel van de chemicaliën en de methoden zijn niet cel compatibel.

Aan de andere kant, vertrouw veel technieken niet op speciale apparatuur, waardoor ze gemakkelijker en goedkoper om toe te passen en te reproduceren. Een wijdverbreide methode voor structuur manipulatie is oplosmiddel gieten21,22,23. Deeltjes zijn toegevoegd voordat de polymerisatie-reactie en homogeen worden verdeeld om te verzadigen van de oplossing. Na de polymerisatie leidt een verandering van omstandigheden, zoals een verdunning of een verandering van de pH, tot het oplossen van de deeltjes, terwijl de poriën binnen het materiaal blijven. De chemicaliën die worden gebruikt in deze technieken, zoals zout, suiker, paraffine, gelatine en krijt, zijn goedkoop en gemakkelijk beschikbaar. In het vriesdrogen, zijn gezwollen hydrogels bevroren. De daaropvolgende sublimatie van de vloeibare fasen onder een vacuüm is dan23,24,25uitgevoerd. Water sublimatie van het netwerk is zacht genoeg om de specifieke 3D structuren van het materiaal. In het gas wordt schuimvorming, wordt een oplossing gestreamd met een gas terwijl de polymerisatie plaats vindt, waardoor poriën binnen de gel-21. De grootte en de verdeling van de poriën kunnen worden aangepast afhankelijk van de gasstroom.

Om de eiwit hydrogel, is BSA reageerde met tetrakis (hydroxymethyl) fosfonium chloride (THPC) in een Mannich-type reactie te voorzien in de vorming van covalente bindingen tussen primaire amines en de hydroxy groepen van de vier-armige linker molecuul26. Mogelijk schadelijke tussenproducten worden verwijderd door overmatig wassen van het materiaal na de reactie optreedt.

Deze studie toont aan dat de mogelijkheid van het behandelen van een BSA gebaseerde materiaal met verschillende technieken om te manipuleren en aanpassen van de grootte van de poriën. Elk van de technieken kan worden gebruikt in elk laboratorium wereldwijd, zoals er geen speciale apparatuur nodig is. Bovendien verschillende parameters, zoals zwelling verhouding, enzymatische afbraak, stabiliteit van de pH en temperatuur gevoeligheid, zijn onderzocht en met elkaar vergeleken, met name de eerbiediging op de invloed van de verschillende technieken op de generatie van 3D platforms. De materialen werden ten slotte matiemaatschappij met cel-lijm peptiden te onderzoeken van de eventuele toepassing van de materialen op de cultuur van de cel. Twee verschillende model-cellijnen werden gebruikt: A549 en MCF7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogel voorbereiding

  1. Meng 200 mg BSA met 1 mL gedeïoniseerd H2O maken 20% (m/v) BSA voorraad (stock oplossing A).
  2. Mix-165 µL van THPC oplossing (134 mg/mL) met gedeïoniseerd water maken THPC 4.835 mL stockoplossing (stockoplossing B).
  3. Weeg 1 mg KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptide (of een gelijkwaardige cel-lijm-peptide) en Verdun het in 100 µL van steriele H2O te verkrijgen van een oplossing van 10 mg/mL (stockoplossing C).
    Opmerking: Deze stap is optioneel en moet alleen worden opgenomen als de hydrogel is bedoeld voor cel cultuur toepassing.
  4. Verwijder de onderkant van een 96-wells-plaat en vervang het met verwisselbare plastic wrap.
    Opmerking: Voor de platen hier gebruikt, de bodem kan gemakkelijk verwijderd worden door druk uit te oefenen op de bodem van elke put; de dunne plastic bodem zal gewoon uitvallen.
  5. Mix 100 µL van BSA stockoplossing (A) en 100 µL van THPC stockoplossing (B) (optioneel: 4 µL van stockoplossing C voor matiemaatschappij, cel-lijm hydrogels) in de 96-wells-plaat te verkrijgen van 200 µL hydrogel. Het mengen van de componenten door pipetteren omhoog en omlaag minstens 5 keer te waarborgen van een uniforme hydrogel na polymerisatie.
  6. Plaats de 96-wells-plaat bij kamertemperatuur (RT) voor ongeveer 10 minuten totdat alle hydrogels zijn goed polymeervorm.
  7. Zorgvuldig en langzaam verwijderen de plasticfolie vanaf de onderkant van de plaat.
  8. Druk op de hydrogels uit de 96-wells-plaat met een kleine stempel en overbrengen naar 1,5 mL buisjes met steriel PBS, pH 7.4.
    Opmerking: De hydrogels hebben een cilindrische vorm, met een diameter van ongeveer 4 mm en een hoogte van 8 mm.
  9. Bewaar de hydrogels in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C voor tot enkele maanden.

2. trekkers de Hydrogels

  1. Vul 1,5 mL tubes met 500 µL van steriel gedeïoniseerd H2O en verwijder de dop. De hydrogels overbrengen in de 1,5 mL reactie buizen met behulp van een spatel.
  2. Wikkel de 1,5 mL tubes strak met paraffine film-op ten minste drie lagen voor elk flesje. Gebruik een naald te doorboren van kleine gaatjes in de film om gas release uit de buis.
  3. Ga naar een van de volgende stappen uit:
    1. De flacon overbrengen in vloeibare stikstof oplossing gedurende 5 minuten om te garanderen dat het water en de hydrogel volledig bevriezen. Onmiddellijk na verwijdering uit de vloeibare stikstof, door de flesjes te overbrengen in de droger om te voorkomen dat het materiaal ontdooien bevriezing.
      Opmerking: Deze procedure resulteert in poriën over 10-15 µm in straal.
    2. De flesjes bij-20 ° C's nachts te langzaam het bevriezen van de hydrogels houden. Onmiddellijk na de verwijdering van-20 ° C, door de flesjes te overbrengen in de droger om te voorkomen dat het materiaal ontdooien bevriezing.
      Opmerking: Deze procedure resulteert in poriën over 50-60 µm in straal.
  4. Ontdooi het materiaal door te verwijderen uit de droger bevriezing na 24u (en de volledige verdamping van het water in en rond de hydrogel).
    Opmerking: De porie-grootte kunnen worden geanalyseerd met confocale laser scanning microscopie (stap 5, "Hydrogel visualisatie").

3. deeltje uitspoeling

  1. De hydrogel bereiden zoals beschreven in stappen 1.1-1.5.
  2. Direct na het mengen van de componenten, toevoegen NaCl totdat verzadiging optreedt (36 mg/mL). Voeg zout tot een zout kristal in de oplossing kan worden gezien als een witte neerslag.
  3. De 96-wells-plaat overbrengen in een shaker en schud totdat de polymerisatie vindt plaats (ongeveer 10 min). Verwijder de hydrogels uit de plaat, zoals beschreven in stappen 1.7-1.8.
  4. Incubeer de hydrogels gedurende ten minste 24 uur op RT in steriel water op een shaker (20 rpm) om alle zout uit de sjabloon hydrogel Elueer. Bewaar de hydrogels bij 4 ° C in PBS voor tot enkele maanden.

4. kanaal vorming

  1. Hydrogels bereiden zoals beschreven in stap 1. Verwijder een hydrogel uit oplossing met behulp van een tang, verwijderen het overtollige water met sterk absorberend papier, en plaats het op de top van een blok van droogijs.
  2. Bevriezen van de hydrogel voor 30 s en verwijder deze voorzichtig uit het blok. Geen schade berokkenen de hydrogel; zorgvuldig gebruik een spatel om het Schraap van het blok. De hydrogel overbrengen in een tube van 1,5 mL en droog het 's nachts bij 37 ° C.

5. Hydrogel visualisatie

  1. Bereid een stamoplossing rhodamine B door verdunnen 1 mg rhodamine B in 10 mL PBS. Maak een seriële verdunning door verdunning van de stockoplossing rhodamine in PBS tot een concentratie van 0,001 mg/mL wordt bereikt (verdunningsfactor: 100)
  2. De hydrogel verwijderen uit de opslag-oplossing (bijvoorbeeld van stap 2.4.) en het overbrengen naar een 1,5 mL-buis met 1 mL 0,01 mg/mL rhodamine B oplossing. Vlekken van de hydrogel overnachting in rhodamine B oplossing op RT.
  3. De volgende dag, transfer de hydrogel dat moet worden gevisualiseerd aan 10 mL PBS (pH 7.4) en wassen voor ten minste 3 uur.
  4. Breng de hydrogel op een µ-dia 8 goed en bedek het met PBS.
  5. Snij kleine segmenten uit de hydrogel (ongeveer 0,5 mm in hoogte) met behulp van een mes.
  6. Met behulp van een confocale laser scanning microscoop, visualiseren de hydrogel bij een golflengte van 514 nm (doelstelling: EG Plan-Neofluar 40 x / 1.30 olie DIC M27, vliegtuig scanmodus: 514 nm, en zoom: 1 X).

6. cel cultuur haalbaarheid

  1. Steriel-filter alle voorraad oplossingen (A, B en C) met een 0,45 µm filter.
  2. De hydrogel bereiden zoals beschreven in stappen 1.1-1.4, met inbegrip van de cel-lijm peptide vóór hydrogel polymerisatie.
  3. Na het mengen van de componenten, Pipetteer onmiddellijk het mengsel in een µ-dia 8 goed totdat de bodem is volledig bedekt.
    Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd snel en direct na het mengen van de componenten, zoals de polymerisatie vindt plaats binnen enkele minuten in de dia.
  4. Cultuur hechting cellen en doorgang naar het verkrijgen van een schorsing van de eencellige gebruik standaard cel cultuur technieken. Breng de cellen in voorverwarmde, steriele DMEM cel kweekmedium aangevuld met foetale runderserum (FBS, 10% (m/v)), penicilline-streptomycine (1% (m/v)) en niet-essentiële aminozuur oplossing (MEM, 1% (m/v)).
  5. Cellen tellen met een Neubauer tellen kamer en zorgvuldig Pipetteer 200 µL van het gewenste aantal cellen (2 x 105 cellen/cm2) op het oppervlak van de hydrogel.
  6. Bedek de µ-dia 8 goed met het deksel en het overbrengen in een incubator (37 ° C, 5% CO2). Incubeer gedurende ten minste 4 uur bij 37 ° C.
  7. Wassen na ten minste 4 uur van cellulaire bijlage, de cellen tweemaal met 200 µL van steriele celkweek PBS.
  8. Herstellen van de cellen met de 200 µL van 3,7% (v/v) formaldehyde voor 10 min op RT en spoel tweemaal met PBS (~ 200 µL).
    Opmerking: Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen bij hantering van formaldehyde.
  9. Permeabilize van de cellen met 200 µL van 0,1% Triton X gedurende 5 minuten wassen tweemaal met PBS.
  10. De cellen met phalloidin-rhodamine vlek door het mengen van 5 µL van methanol voorraad met 195 µL van PBS en toe te voegen aan de cellen op RT. vlek de cellen gedurende 20 minuten in het donker. Spoel tweemaal met PBS.
  11. Onderzoeken van de cel adhesie eigenschappen met behulp van een confocal microscoop op 514 nm (doelstelling: EG Plan-Neofluar 40 x / 1.30 olie DIC M27, vliegtuig scanmodus: 514 nm, en zoom: 1 X). Analyseren van de beelden met behulp van de juiste software (Zie de Tabel van de materialen).

7. Hydrogel eigenschappen

  1. Zwelling verhouding.
    1. Volledig drogen de hydrogels bij 37 ° C ten minste één dag.
    2. Wegen van elke hydrogel en noteer het exacte gewicht.
    3. Vul een reactiebuis 2 mL met 1,5 mL PBS.
    4. De hydrogel overboeken naar deze 2 mL reactiebuis en het volledig onderdompelen in PBS.
    5. Laat de hydrogel gedurende ten minste twee dagen in PBS op RT te bereiken evenwicht met de PBS.
    6. Na drie dagen de hydrogel verwijderen uit de oplossing en droog het met een tissue papier te verwijderen overtollige water van het oppervlak van de hydrogel.
    7. Weeg de hydrogel.
    8. Bereken de zwelling verhouding met de volgende formule:
      Equation
      waar Wd is het gewicht van de gedroogde gel (stap 7.1.2.) en Ws is het gewicht van de natte gel (stap 7.1.7). Vermenigvuldig met 100 om de zwelling verhouding procent.
  2. pH en temperatuur stabiliteit.
    1. 5 mL PBS overbrengen in een 15-mL reactiebuis.
    2. Pas de oplossing aan de juiste pH (bijvoorbeeld pH 2, 7 of 10) met NaOH en HCl. Breng de oplossing aan de juiste temperatuur (bijvoorbeeld RT, 37 ° C of 80 ° C).
    3. Overdracht van de hydrogel dat moet worden onderzocht voor de stabiliteit in de passende oplossing. Passen de pH zo nodig.
      Opmerking: Alle hydrogels moeten worden volledig gezwollen op dit punt (Zie de zwelling verhouding) om te voorkomen dat de onjuiste interpretatie van het gewicht als gevolg van de zwelling van het materiaal.
    4. Na bepaalde tijdsintervallen, de hydrogel verwijderen uit de oplossing (bijvoorbeeld elk uur tot maximaal 2 dagen), droog het met een sterk absorberend papier weefsel te verwijderen overtollige water, wegen.
  3. Enzymatische afbraak.
    1. Bereid een voorraad enzym oplossing van 300 U trypsine en pepsine, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. De hydrogel (bijvoorbeeld van stap 1.8) overbrengen naar de geschikte oplossing.
      Opmerking: Alle hydrogels moeten worden volledig gezwollen op dit punt om te voorkomen dat de onjuiste interpretatie van het gewicht.
    3. Na bepaalde tijdsintervallen, de hydrogel verwijderen uit de oplossing (bijvoorbeeld elk uur), droog het met een sterk absorberend papier weefsel te verwijderen overtollige water, wegen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedank Baden-Württemberg, Stiftung voor hun financiële steun in het kader van de "Bioinspired materiaal synthese" (BioMatS-14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8%, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1% Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7% Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1.5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).

Tags

Biochemie kwestie 126 Hydrogel de eigenschappen van het materiaal porie maten celcultuur biopolymeren 3D architectuur
Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodenberger, N., Kubiczek, D.,… More

Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter