Summary
Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.
Abstract
Los hidrogeles son reconocidos como prometedores materiales para aplicaciones en cultura celular debido a su capacidad para proporcionar entornos celulares altamente hidratada. El campo de plantillas 3D está aumentando debido a la semejanza potencial de esos materiales a la matriz extracelular natural. Hidrogeles basados en proteína son particularmente prometedoras porque fácilmente puede ser funcionalizados y puede alcanzar estructuras definidas con propiedades fisicoquímicas ajustables. Sin embargo, la producción de plantillas 3D macroporoso para los usos de la cultura de célula utilizando materiales naturales a menudo está limitada por sus propiedades mecánicas más débiles comparados con los de materiales sintéticos. Aquí, se evaluaron diferentes métodos para producir macroporoso albúmina de suero bovino (BSA)-basado en sistemas de hidrogel, con tamaños de poro ajustable en el rango de 10 a 70 μm de radio. Además, se estableció un método para generar canales de este material basado en proteína que son varias cien micras de largo. Se analizaron los diferentes métodos para producir los poros, así como la influencia del tamaño de poro en material propiedades tales como relación, pH, estabilidad de la temperatura y el comportamiento de la degradación enzimática, la hinchazón. Tamaños de poro se investigaron en el estado nativo, hinchado de los hidrogeles mediante microscopía de láser confocal. La factibilidad de usos de la cultura de célula fue evaluada usando una pegamento celular RGD péptido modificación del sistema de proteína y dos líneas de celular modelo: células de cáncer de mama humano (A549) y adenocarcinomic alveolares basals epitelial las células humanas (MCF7).
Introduction
Los hidrogeles son materiales que forman redes 3D insolubles capaces de atar grandes cantidades de agua. Este tipo de materiales puede proporcionar excelentes condiciones ambientales para las células vivas. Actualmente, existe un creciente interés en la generación de estructuras tridimensionales de hidrogel y en el desarrollo de los procesos para adaptar sus propiedades químicas y físicas. Una vez que esto se logra, una plantilla para el crecimiento de las células y la manipulación del comportamiento celular puede ser generado1,2,3,4. Estas estructuras 3D no sólo crean un ambiente más natural y realista que los enfoques convencionales de dos dimensiones, pero también revelan nuevas posibilidades para el crecimiento de las células madre o tumor modelos5. Diferentes materiales poseen una serie de características que dependen principalmente del tamaño del poro del gel6. Los poros juegan un papel crucial en aplicaciones de cultivo celular, ingeniería de tejidos y el crecimiento dirigido de células madre. Por ejemplo, el oxígeno y los nutrientes difunden a través de la matriz, y cantidades adecuadas deben ser capaces de llegar a las células7. Por otro lado, metabolitos nocivos deben eliminarse lo antes posible, y espacio suficiente para el crecimiento de la célula debe estar disponible7. En consecuencia, las propiedades del material y por lo tanto el tamaño del poro, influyen severamente las posibles beneficio y posibles aplicaciones de la matriz. Dependiendo de las propiedades de los materiales, procesos de crecimiento de la célula diferentes pueden ocurrir en cultura celular 3D, incluyendo la formación de estructuras neuronales; el crecimiento y la diferenciación de las células de la piel o el hueso; y el crecimiento dirigido de líneas celulares especiales, como los hepatocitos o fibroblastos2,3,8,9,10,11. Otro de los puntos crucial que influyen en la posible aplicación de un material es su estabilidad hacia estímulos externos12. Por ejemplo, el hidrogel debe mantener su integridad mecánica en medios de cultivo celular o en el cuerpo humano.
En los últimos años de investigación en 3D de la célula cultura hidrogeles se intensificó, y se llevaron a cabo muchos estudios para resolver la arquitectura 3D de los sistemas13. Hidrogeles compuestos de componentes químicamente sintetizados comúnmente son investigados porque pueden ser sintetizados fácilmente y modificar químicamente y exhiben alta estabilidad (véase Zhu et al., 2011 una revisión)5. Sin embargo, las proteínas tienen muchas propiedades beneficiosas: como supuesto "polímeros de precisión", son biocompatibles; tienen una longitud definida; son relativamente fáciles de modificar; y tienen un gran número de sitios de destino14,15. En este sentido, se pueden generar estructuras altamente específicas, innovadoras para su aplicación en muchos campos. En este estudio, un hidrogel basado en proteína16 fue utilizado para demostrar la capacidad de métodos bien establecidos para influir en la arquitectura 3D del material. Además, también se investigó la capacidad de y la aplicabilidad a la generación de poro.
Existen muchas técnicas diferentes modificar estructuras 3D, incluyendo métodos sencillos y técnicas sofisticadas y altamente especializadas de diversos campos de la ciencia de los materiales. Una técnica generalizada es el uso de electrospinning para generar estructuras bien definidas17. Cargada fibras se tiran de una solución por un campo eléctrico y luego solidifican con la exposición al oxígeno. De esta manera, se pueden producir las fibras en la gama de varios nanómetros hasta varias micras. Técnicas adicionales para ajustar el tamaño, estructura y distribución de los poros dentro de la matriz son la litografía blanda, Fotolitografía, enfoque hidrodinámico, electro-rociado y bio-impresión18,19,20. Un inconveniente importante de estas técnicas es su dependencia de equipos específicos, caros y productos químicos especiales o materiales. Además, experiencia con estas técnicas a menudo no es directamente transferible a los materiales basados en proteína, y muchos de los productos químicos y métodos no son compatibles la célula.
Por otra parte, muchas de las técnicas no se apoyan en equipos especiales, haciéndolos más fácil y más barato aplicar y reproducir. Un método generalizado para la manipulación de la estructura es de fundición solvente21,22,23. Las partículas se agregan antes de la reacción de polimerización y se distribuyen de forma homogénea para saturar la solución. Después de la polimerización, un cambio de condiciones, como una disolución o un cambio de pH, conduce a la solvatación de las partículas, mientras que los poros permanecen dentro del material. Los productos químicos utilizados en estas técnicas, tales como sal, azúcar, parafina, gelatina y tiza, son baratos y fácilmente disponibles. En la liofilización, son congelados hidrogeles hinchados. La sublimación posterior de las fases líquidas bajo un vacío es entonces realizado23,24,25. La sublimación del agua de la red es lo suficientemente suave para mantener las estructuras 3D específicas del material. En el gas que hace espuma, una solución es transmitida con un gas mientras que la polimerización ocurre, dejando poros en el gel de21. El tamaño y la distribución de los poros pueden ajustarse dependiendo de la corriente del gas.
Para formar el proteína del hidrogel, BSA está reaccionada cloruradas tetrakis (hidroximetil) fosfonio (THPC) en una reacción tipo Mannich para permitir la formación de enlaces covalentes entre aminas primarias y los grupos hidroxilo de la molécula de vinculador de cuatro brazos26. Posibles productos intermedios nocivos se eliminan por lavado excesivo del material después de que la reacción ocurra.
Este estudio demuestra la posibilidad de tratar un material a base de BSA con diversas técnicas para manipular y adaptar el tamaño de los poros. Cada una de las técnicas puede utilizarse en cualquier laboratorio a nivel mundial, ya que ningún equipo especial es necesario. Además, diferentes parámetros, tales como relación de hinchazón, degradabilidad enzimática, estabilidad de pH y sensibilidad de la temperatura, fueron examinados y comparados con otras, especialmente respetan a la influencia de las diferentes técnicas en la generación de arquitecturas de 3D. Por último, los materiales fueron funcionalizados con péptidos de célula-adhesivo para investigar la posible aplicación de los materiales para cultivo celular. Se utilizaron dos líneas celulares de diferentes modelos: A549 y MCF7.
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Protocol
1. hidrogel preparación
- Mezclar 200 mg de BSA con 1 mL de desionizada de H2O para crear acciones de BSA 20% (p/v) (solución stock A).
- Mezcla 165 μl de solución de THPC (134 mg/mL) con 4,835 mL de agua desionizada para crear THPC stock (solución stock B).
- Pesar 1 mg de KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) péptido (o un péptido celular adhesiva equivalente) y diluirlo en 100 μl de estéril de H2O para obtener una solución de 10 mg/mL (solución C).
Nota: Este paso es opcional y sólo debe incluirse si el hidrogel es para uso de cultivo celular. - Quitar la parte inferior de una placa de 96 pocillos y reemplazarlo con envoltura de plástico extraíble.
Nota: Para las placas de aquí, la parte inferior se puede quitar fácilmente aplicando presión a la parte inferior de cada pocillo; el fondo plástico delgado simplemente se cae. - Mezclar 100 μl de solución stock de BSA (A) y 100 μl de THPC stock solución (B) (opcional: 4 μL de solución madre C para hidrogeles funcionalizados, adhesivo de célula) en la placa de 96 pocillos para obtener 200 μL de hidrogel. Mezclar los componentes mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 5 veces para garantizar un hidrogel uniforme después de la polimerización.
- Coloque la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente (RT) durante unos 10 minutos hasta que los hidrogeles se polimerizan correctamente.
- Cuidadosamente y lentamente retire el envoltorio plástico de la parte inferior de la placa.
- Presione los hidrogeles de la placa de 96 pozos utilizando un sello pequeño y transferirlas a tubos de 1,5 mL con PBS estéril, pH 7,4.
Nota: Los hidrogeles tienen una forma cilíndrica, con un diámetro de aproximadamente 4 mm y 8 mm de altura. - Guarde los hidrogeles en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° C por hasta varios meses.
2. los hidrogeles de la liofilización
- Llenar tubos de 1,5 mL con 500 μl de estéril desionizada H2O y retire el tapón. Transferencia de los hidrogeles a los tubos de reacción de 1,5 mL con una espátula.
- Envuelva los tubos de 1,5 mL con parafina película-al menos tres capas de cada frasco. Utilice una aguja para perforar pequeños agujeros en la película para permitir la liberación de gas del tubo.
- Proceder a uno de los siguientes pasos:
- Transferir el frasco de solución de nitrógeno líquido durante 5 minutos garantizar que el agua y el hidrogel congelan completamente. Inmediatamente después de la eliminación de nitrógeno líquido, transferir los frascos a la congelación del secador para evitar que el material descongelado.
Nota: Este procedimiento resulta en poros de 10-15 μm de radio. - Mantener los frascos a-20 ° C durante la noche para congelar lentamente los hidrogeles. Inmediatamente después del retiro de-20 ° C, transferir los frascos a la congelación del secador para evitar que el material descongelado.
Nota: Este procedimiento resulta en poros de 50-60 μm de radio.
- Transferir el frasco de solución de nitrógeno líquido durante 5 minutos garantizar que el agua y el hidrogel congelan completamente. Inmediatamente después de la eliminación de nitrógeno líquido, transferir los frascos a la congelación del secador para evitar que el material descongelado.
- Después de 24 h y la completa evaporación del agua en y alrededor el hidrogel, descongelar el material mediante la eliminación de la congelación del secador.
Nota: Los tamaños de poro pueden ser analizados con láser confocal de barrido microscopía (paso 5, "Visualización de hidrogel").
3. partículas de lixiviación
- Preparar el hidrogel como se describe en los pasos 1.1-1.5.
- Después de mezclar los componentes, agregar directamente NaCl hasta saturación (36 mg/mL). Añadir la sal hasta un cristal de sal puede ser visto en la solución como un precipitado blanco.
- Transferir la placa de 96 pocillos a una coctelera y agite hasta que la polimerización tiene lugar (aproximadamente 10 min). Quite los hidrogeles de la placa, como se describe en pasos 1.7-1.8.
- Incubar los hidrogeles por al menos 24 h a temperatura ambiente en agua estéril en un agitador (20 rpm) a fin de eluir toda la sal de la plantilla de hidrogel. Almacenar los hidrogeles a 4 ° C en PBS por hasta varios meses.
4. canal formación
- Preparación de hidrogeles como se describe en el paso 1. Quitar un hidrogel de solución utilizando una pinza, quitar el exceso de agua con papel muy absorbente y colocarlo encima de un bloque de hielo seco.
- Congelar el hidrogel durante 30 s y retire cuidadosamente el bloque. No dañe el hidrogel; cuidadosamente con una espátula raspe el bloque. El hidrogel de transferencia a un tubo de 1,5 mL y secar toda la noche a 37 ° C.
5. hidrogel visualización
- Preparar una solución stock de rodamina B diluyendo 1 mg de rodamina B en 10 mL de PBS. Preparar una dilución seriada diluyendo la solución madre de rodamina en PBS hasta alcanzar una concentración de 0.001 mg/mL (factor de dilución: 100)
- Retire el hidrogel de la solución de almacenamiento (por ejemplo, en el paso 2.4.) y transferirlo a un tubo de 1,5 mL con 1 mL de solución de rodamina B 0,01 mg/mL. Mancha el hidrogel durante la noche en solución de rodamina B a TA.
- Al día siguiente, transferir el hidrogel que debe visualizarse a 10 mL de PBS (pH 7.4) y lavado durante al menos 3 horas.
- Transferir el hidrogel en un μ-diapositiva 8 bien y cubrirla con PBS.
- Cortar rodajas pequeñas del hidrogel (sobre 0,5 mm de altura) con una hoja.
- Usando un láser confocal de barrido microscopio, visualizar el hidrogel en una longitud de onda de 514 nm (objetivo: CE Plan-Neofluar 40 x / 1.30 aceite DIC M27, modo de escaneo plano: 514 nm y zoom: 1 X).
6. célula cultura viabilidad
- Filtro estéril todo stock soluciones (A, B y C) con un filtro de 0.45 μm.
- Preparar el hidrogel como se describe en los pasos 1.1-1.4, incluyendo el péptido de la célula-adhesivo antes de la polimerización de hidrogel.
- Después de mezclar los componentes, pipetear inmediatamente la mezcla en una μ-diapositiva 8 bien hasta la parte inferior está totalmente cubierta.
Nota: Este paso debe realizarse rápidamente y directamente después de mezclar los componentes, como la polimerización ocurre dentro de minutos en la diapositiva. - Cultura adhesión células y paso para obtener una suspensión unicelular utilizando técnicas de cultivo celular estándar. Transferir las células a precalentado, estéril medio de cultivo celular DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS, 10% (p/v)), penicilina-estreptomicina (1% (p/v)) y la solución de aminoácido no esencial (MEM, 1% (p/v)).
- Contar las células con un Neubauer contando a cámara y cuidadosamente 200 μL de pipeta del número de células (2 x 105 células/cm2) en la superficie del hidrogel.
- La μ-diapositiva 8 con la tapa de la cubierta y transferirlo a una incubadora (37 ° C, 5% CO2). Incubar durante al menos 4 h a 37 ° C.
- Después de al menos 4 h de accesorio de celular, se lavan las células dos veces con 200 μL de PBS de la cultura de célula estéril.
- Fijar las células con 200 μL de formaldehído de 3.7% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente y lavar dos veces con PBS (~ 200 μL).
Nota: Use equipo de protección personal cuando maneje formaldehído. - Permeabilizar las células con 200 μL de 0,1% Triton X 5 min lavado dos veces con PBS.
- Se tiñen las células con phalloidin-rodamina mezclando 5 μl del stock metanólica con 195 μl de PBS y agregarlo a las células en RT. mancha las células durante 20 min en la oscuridad. Lavar dos veces con PBS.
- Investigar las propiedades de adherencia de células utilizando un microscopio confocal en 514 nm (objetivo: CE Plan-Neofluar 40 x / 1.30 aceite DIC M27, modo de escaneo plano: 514 nm y zoom: 1 X). Analizar las imágenes utilizando el software apropiado (véase la Tabla de materiales).
7. hidrogel propiedades
- Relación de la inflamación.
- Secar completamente los hidrogeles a 37 ° C durante al menos un día.
- Pesar cada hidrogel y anote el peso exacto.
- Llene un tubo de ensayo de 2 mL con 1,5 mL de PBS.
- Transferir el hidrogel en este tubo de ensayo 2 mL y sumergirlo completamente en PBS.
- Deje el hidrogel durante al menos dos días en PBS a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio con el PBS.
- Después de tres días, retire el hidrogel de la solución y seque con un pañuelo de papel para eliminar el exceso de agua de la superficie del hidrogel.
- Peso del hidrogel.
- Calcular la relación hinchazón mediante la fórmula siguiente:
donde Wd es el peso del gel seco (paso 7.1.2.) y Ws es el peso del gel húmedo (paso 7.1.7). Multiplicar con 100 para obtener el porcentaje de cociente de la hinchazón.
- estabilidad de pH y temperatura.
- Transferir 5 mL de PBS a un tubo de ensayo de 15 mL.
- Ajustar la solución para el pH apropiado (por ejemplo, pH 2, 7 o 10) con NaOH y HCl. traer la solución a la temperatura apropiada (p. ej., RT, 37 ° C y 80 ° C).
- Transferir el hidrogel que es investigada por su estabilidad en la solución adecuada. Vuelva a ajustar el pH si es necesario.
Nota: Todos los hidrogeles deben ser completamente hinchados en este momento (ver la hinchazón) para evitar la interpretación errónea del peso debido a la hinchazón del material. - Después de ciertos intervalos de tiempo, retire el hidrogel de la solución (por ejemplo, cada hora hasta 2 días), secar con un pañuelo de papel muy absorbente para quitar exceso de agua y pesar.
- Degradación enzimática.
- Preparar una solución stock de enzima de 300 U tripsina y pepsina, según las instrucciones del fabricante.
- Transferir el hidrogel (p. ej., de paso 1.8) a la solución adecuada.
Nota: Todos los hidrogeles deben estar completamente inflamados en este punto para evitar la interpretación errónea del peso. - Después de ciertos intervalos de tiempo, retire el hidrogel de la solución (por ejemplo, cada hora), secar con un pañuelo de papel muy absorbente para quitar exceso de agua y pesar.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Baden-Württemberg Stiftung por su apoyo financiero en el marco de la "Síntesis de materiales Bioinspirados" (biomantos-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8%, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1% Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7% Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8%, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1.5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
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