בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר
Summary
הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.
Abstract
מודלים מאתר של המחלה הן תנאי הכרחי למחקר מדעי. עם זאת, כלי אבחון רבים כגון אנדוסקופיה או הדמיה טומוגרפי לא שגרתי מועסקים במודלים של בעלי חיים. המפרט ניסיוני קונבנציונאלי מסתמכים בדרך כלל על ניתוח לאחר המוות ו- ex-vivo , אשר למנוע בדיקות מעקב התוך אישי, להגדיל את מספר חיות מחקר צריך. טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות מאפשר את ההערכה לא פולשנית, החוזרות על עצמן, כמותיים, תלת מימדי של הגששים פלורסנט. היא רגישה מאוד, מאפשר את השימוש מקבלי מולקולרית, אשר מאפשר זיהוי ספציפי, איפיון מטרות מולקולריות שונות. בפרט, יישוב הגששים מייצגים כלי חדשני עבור ניתוח ביטוי גנים הפעלה וחלבון, דלקת, מחלות אוטואימוניות, זיהום, מחלת כלי דם, נדידת תאים, tumorigenesis, וכו ‘. במאמר זה, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב על זו טכנולוגיית הדמיה מתוחכמות זיהוי ויוו , אפיון של דלקת (קרי, הסתננות מקרופאג F4/80-חיוביים) מודל מאתר בשימוש נרחב של דלקת מעיים. טכניקה זו עשויה לשמש גם בתחומים אחרים מחקר ‘, כגון מעקב תא או תאי מערכת החיסון.
Introduction
מודלים בעלי חיים נמצאים בשימוש נרחב במחקר מדעי, הליכים פולשנית רבים קיים צג פעילות המחלה, חיוניות, כגון כימות של שינויים במשקל הגוף או הניתוח של דם, שתן וצואה. עם זאת, אלה רק פרמטרים הפונדקאית עקיף עלולות גם להשתנות בין-אישי. הם לעתים קרובות חייב לקבל השלמה על ידי ניתוח לאחר המוות של רקמות הדגימה, אשר מונע טורי התבוננות בנקודות הזמן חוזרות, ישיר התבוננות פיזיולוגיים או פתולוגית תהליכים בתוך vivo. טכניקות הדמיה מתוחכם של חיית-קטן הופיעו, כולל קרוס הדמיה סקציות הדמיה אופטית, אנדוסקופיה, אשר מאפשר את פריט חזותי ישיר של תהליכים אלה ומאפשר גם ניתוחים חוזרים של חיות באותו1 , 2 , 3. בנוסף, האפשרות לפקח שוב ושוב מצבים שונים של מחלת החיה אותו עשוי להקטין את מספר בעלי חיים לצורך, אשר עשוי להיות נחשק אתיקה בעלי חיים מנקודת מבט.
מספר טכניקות דימות אופטי שונות קיימות עבור ויוו פלורסצנטיות הדמיה. במקור, הדמיה קונאפוקלית הועסק ללמוד משטח ואירועים פלורסנט מהסבא4,5. לאחרונה, עם זאת, הטומוגרפיה מערכות המאפשרות עבור הערכות רקמות תלת מימד כמותי כבר מפותחת6. זה הושג באמצעות הפיתוח של הגששים פלורסנט הפולטות אור בספקטרום (ניר)-סגול, מציע קליטה נמוכה, גלאי רגיש, מקורות אור מונוכרומטי7. ואילו טכניקות הדמיה הצלבה מסורתיים, כגון טומוגרפיה (CT), דימות תהודה מגנטית (MRI) או אולטרסאונד (ארה ב), מסתמכים בעיקר על פרמטרים פיזיים והמחש מורפולוגיה, הדמיה אופטית יכולים לספק מידע נוסף על תהליכים מולקולריים הבסיסי באמצעות פלורסנט אנדוגני או אקסוגני רגשים8.
ההתקדמות בביולוגיה מולקולרית סייעו כדי להקל על הדור של הגששים מולקולרית פלורסנט חכם, ממוקד עבור מספר גדל והולך של מטרות. לדוגמה, ספיגת קולטן בתיווך והפצה באזור היעד נתון, ניתן לאבחן באמצעות נוגדנים התווית על-ידי נגזרת carbocyanine9. השפע של נוגדנים זמינים, ניתן שכותרתו שישמשו המשדרים ספציפיים באזורים נגישים אחרת של הגוף, מספק תובנות ותהליכי מולקולרית הסלולר במודלים של tumorigenesis, ניווניות, חסר תקדים מחלות לב וכלי דם, אוטואימונית, דלקתיות7.
במחקר זה, אנו מתארים את השימוש בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה במודל של מאתר של קוליטיס כיבית. לתוספי נתרן גופרתי (DSS)-קוליטיס המושרה הוא מודל העכבר המושרה כימי סטנדרטי של דלקת מעיים הדומה מעי דלקתיות המחלה (מחלת המעי הדלקתי)10. זה שימושי במיוחד להעריך את התרומה של מערכת החיסון המולדת להתפתחות של דלקת מעיים11. מאז הגיוס, הפעלה, חדירה של ומונוציטים ו מקרופאגים לייצג שלבים קריטיים בפתוגנזה של מחלת המעי הדלקתי, ויזואליזציה של הגיוס שלהם וקינטיקה של חדירה חיוניים ניטור, לדוגמה, את השפעת חומרים טיפולית פוטנציאל גם עם הגדרת פרה12. אנחנו מתארים את תנאי הגיוס של קוליטיס DSS ומדגימים בתיווך טומוגרפיה אפיון מקרופאג חדירה לתוך רירית המעיים באמצעות טומוגרפיה מולקולרית פלורסצנטיות עבור הפריט החזותי ספציפי של סמן מונוציט/מקרופאג F4/80 13. בנוסף, אנחנו להמחיש שגרות עזר ומשלימה, כגון נוגדנים labelling; הגדרת הניסוי; ניתוח ופרשנות של תמונות שהושג, מתאם עם המפרט קונבנציונלי כגון מדדי פעילות המחלה, flow cytometry ניתוח היסטולוגית, ואת אימונוהיסטוכימיה. נדון מגבלות של הטכניקה הזאת השוואות כדי שיטות הדמיה אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות טכניקות הדמיה רפואית התפתחו במהירות בשנים האחרונות, אנחנו עדיין מוגבלת היכולת לזהות תהליכים דלקתיים או גידולים, כמו גם מחלות אחרות, בשלבי ההתפתחות. עם זאת, דבר זה חיוני להבנה הגידול, הפלישה, או גרורות, תהליכים תאיים בהתפתחות של מחלות דלקתיות ומחלות ניווניות, וכלי דם אימונולוגי. ואילו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים גב’ סוניה Dufentester, גב אלקה וובר, גב’ נעמה Niepagenkämper לסיוע טכני מעולה.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
Riferimenti
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
