Summary
Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d'ADN pour quantifier la longueur des télomères.
Abstract
Il existe plusieurs techniques différentes pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec leurs propres avantages et inconvénients. L'approche traditionnelle, l'analyse du fragment de restriction Telomere (TRF), utilise une technique d'hybridation d'ADN dans laquelle les échantillons d'ADN génomique sont digérés avec des enzymes de restriction, laissant derrière eux des répétitions d'ADN de télomères et un certain ADN sous-télomérique. Ceux-ci sont séparés par une électrophorèse sur gel d'agarose, transférés dans une membrane filtrante et hybridés à des sondes oligonucléotidiques marquées avec chimioluminescence ou radioactivité pour visualiser des fragments de restriction telomère. Cette approche, tout en nécessitant une plus grande quantité d'ADN que d'autres techniques telles que la PCR, peut mesurer la répartition de la longueur des télomères d'une population de cellules et permet une mesure exprimée en kilobases absolues. Ce manuscrit démontre une procédure d'hybridation d'ADN modifiée pour déterminer la longueur des télomères. L'ADN génomique est d'abord digéré avec des enzymes de restriction (qui ne coupent pasTélomères) et séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel est ensuite séché et l'ADN est dénaturé et hybride in situ à une sonde oligonucléotidique radiomarquée. Cette hybridation in situ évite la perte d'ADN des télomères et améliore l'intensité du signal. Après l'hybridation, les gels sont imagés à l'aide d'écrans phosphores et la longueur des télomères est quantifiée à l'aide d'un programme graphique. Cette procédure a été développée par les laboratoires des Drs. Woodring Wright et Jerry Shay à l'Université du Texas Southwestern 1 , 2 . Ici, nous présentons une description détaillée de cette procédure, avec quelques modifications.
Introduction
Les télomères, situés aux extrémités des chromosomes, sont des répétitions nucléotidiques de la séquence TTAGGG (sur les chromosomes humains) qui jouent un rôle essentiel dans la protection de l'information génétique cellulaire 3 , 4 , 5 . Les télomères ont plusieurs milliers de paires de bases et servent à protéger l'intégrité du reste du chromosome pendant la réplication de l'ADN. La réplication des chromosomes n'est pas parfaite, de sorte que les extrémités du chromosome ne sont pas complètement copiées. Cette inefficacité dans la réplication est appelée «problème de réplication de fin» et entraîne la perte de certaines des répétitions de télomères au cours de chaque cycle de réplication 6 , 7 . La longueur de la télomère peut être restaurée après la division cellulaire par la télomérase, une enzyme qui remplace les séquences des télomères perdus 8 , 9 . La télomérase, cependant, n'est pasActivé dans la plupart des cellules somatiques humaines et, par conséquent, au fil du temps, les télomères se raccourciront, entraînant éventuellement une sénescence cellulaire 10 . En raison du raccourcissement des télomères, les télomères sont considérés comme un biomarqueur du vieillissement et le risque de maladies liées à l'âge 11 , 12 . En outre, la longueur des télomères peut être affectée par des facteurs génétiques, environnementaux et de style de vie et d'autres stimuli tels que le stress oxydatif, ce qui indique que la longueur des télomères peut jouer un rôle de biomarqueur dans les études toxicologiques, épidémiologiques et comportementales 13 , 14 , 15 .
Cet article démontre une technique de mesure de la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée (TRF) adaptée de Mender et Shay 2 et Kimura et al. 16 , et similaire à Herbert, Shay et WrigHt 1 et Haussmann et Mauck 17 . Traditionnellement, l'analyse des TRF implique une procédure Southern Blot. Les transferts de Southern sont considérés comme «l'étalon de l'or» pour étudier la longueur des télomères et sont activement utilisés pour examiner la longueur des télomères leucocytaires dans les études épidémiologiques 18 . Cette analyse TRF utilise l'ADN génomique digéré en laissant les répétitions des télomères. Les fragments d'ADN sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel, dénaturés et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les séquences de télomères sont hybridées avec une sonde d'oligonucléotide télomère. Plutôt que de transférer les télomères séparés sur une membrane, d'autres techniques de TRF utilisent des techniques d'hybridation en gel avec et sans dénaturation de l'ADN. L'inclusion de la dénaturation est importante lorsque l'on considère la détection des télomères interstitiels, qui ont été signalés dans certaines espèces 19 . Les procédures qui ne comportent pas les étapes de dénaturationLes rayons d'ADN monocaténaires sur les télomères terminaux et ne se lient pas aux séquences interstitielles des télomères 18 .
Outre l'analyse TRF, il existe plusieurs autres techniques de mesure de la longueur des télomères qui ont chacun leurs propres avantages et inconvénients. La technique Flow-FISH peut mesurer la longueur moyenne des télomères de cellules individuelles d'un type cellulaire distinct en utilisant la cytométrie en flux 16 , 20 . Bien qu'il puisse étiqueter avec précision des télomères avec des sondes hautement spécifiques et réduire les erreurs humaines par l'automatisation, Flow-FISH est coûteux, moins efficace et nécessite des échantillons frais et un technicien hautement qualifié, ce qui limite sa capacité à des études épidémiologiques 16 . En outre, cette méthode ne tient pas compte des changements potentiels dans le nombre de chromosomes dans la population cellulaire. Une autre technique, qPCR, est largement acceptée comme moyen de mesure de la longueur des télomères pour les études épidémiologiques 21 .
La procédure TRF a ses propres lacunes qui limitent son utilisation pour certaines études. Les techniques TRF nécessitent une grande quantité d'ADN par rapport à d'autres méthodes (entre 2 et 3 μg par échantillon). Cela limite les applications de la technique à l'examen de la longueur des échantillons cliniques des télomères pour lesquels un ADN génomique suffisant peut être collecté et ne peut être utilisé sur des échantillons d'ADN dégradés. De plus, l'analyse des TRF est coûteuse et nécessite beaucoup de main-d'œuvre, nécessitant 4 à 5 jours pour produire des résultats. Cependant, le TRF donne un faible coefficient de varianceEn accordant sa reproductibilité. Alors que ce protocole est différent de l'échappement Southern traditionnel (utilisant une hybridation sur gel in situ), les deux techniques sont fondamentalement les mêmes.
La technique présentée ici est une combinaison d'un transfert de Southern et d'une hybridation en gel; Associant l'étape de dénaturation d'ADN des transferts de Southern avec l'hybridation en gel. Cette combinaison a le bénéfice supplémentaire de la puissance du signal de sonde améliorée par rapport au transfert de Southern et a consisté à produire des résultats quantifiables dans notre laboratoire. En outre, l'utilisation de sondes radioactives plutôt que de sondes chimioluminescentes donne une intensité de signal plus élevée et permet la visualisation et la quantification avec un agent de phosphorimagerie, ce qui rend les analyses du TRF faciles à utiliser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extraction d'ADN génomique
- Effectuer une extraction d'ADN génomique à partir des cellules (ici, ligne cellulaire BJ-HTERT) à analyser à l'aide d'un kit commercial d'extraction d'ADN, conformément aux instructions du fabricant.
- Mesurer la concentration d'ADN avec un spectrophotomètre. Si la concentration d'ADN est inférieure à 100 μg / mL, précipiter l'ADN avec de l'éthanol et ré-endiguer dans un volume de tampon TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (acide éthylènediaminetétracétique) pH 8,0) afin d'assurer une concentration d'ADN de 100 à 600 μg / mL).
2. Evaluation de l'intégrité de l'ADN
NOTE: Cette partie du protocole décrit une évaluation de l'intégrité de l'ADN à l'aide d'un système d'électrophorèse sur gel avec un gel de 11 cm x 14 cm. D'autres systèmes et tailles de gel peuvent également être utilisés, mais la tension et le temps de migration de l'ADN peuvent varier.
- Préparer un gel d'agarose à 1% en combinant 1 g d'agarose d'électrophorèse dans 100 ml de tampon 1x TAE (40 mM TrEst-base; Acide acétique 20 mM; EDTA 2 mM; PH 8,5) et micro-ondes jusqu'à dissolution de l'agarose et la solution est limpide. Refroidir la solution à température ambiante jusqu'à ce qu'elle atteigne 50 ° C (environ 15 à 20 min).
- Alors que la solution d'agarose est en train de refroidir, préparer un plateau de moulage par gel en ajoutant des portes d'extrémité de coulée sur le plateau de coulée. Pour éviter les fuites d'agarose, refroidir les portes d'extrémité à 4 ° C avant de fixer au bac de coulée.
- Une fois que la solution d'agarose a refroidi à 50 ° C, ajouter 10 μL de bromure d'éthidium (10 mg / mL dans dH 2 O) et verser la solution d'agarose dans le bac de coulée de gel. Ajouter le peigne au plateau de coulée.
- Laisser durcir la solution d'agarose pendant 45 minutes à température ambiante.
- Préparer des échantillons d'ADN pour l'électrophorèse en diluant 25 ng d'ADN génomique en utilisant un tampon TE 1x à un volume final de 9 μL et ajouter 1 μL de 10 x Colorant de chargement (0,25% (p / v) de bleu de bromophénol, xylène de 0,25% (p / v) Cyanol FF, 30% (v / v) de glycerol). Bien mélanger.
- Exécuter la migration de l'ADN à 100 V pendant environ 2 h ou jusqu'à ce que le colorant bleu de bromophénol soit à peu près à mi-chemin du gel.
- Image du gel en utilisant un transilluminateur à lumière ultraviolette ou équivalent.
NOTE: Les échantillons d'ADN avec une bonne intégrité ont des bandes de poids moléculaire élevé sans coloration (due à l'ADN cisaillé ou cassé). Si les bandes d'ADN sont imprégnées, elles ont une faible intégrité et ne conviennent pas à l'analyse Southern Blot, et l'ADN doit être ré-isolé avec des cellules fraîches.
3. Digestion de l'ADN génomique
- Effectuer la digestion de l'ADN génomique dans un volume final de 20-40 μL.
REMARQUE: les volumes sont plus importantsQue 40 μL déborderont les puits du gel d'agarose.- Combinez 3 μg d'ADN génomique et la quantité appropriée de tampon de digestion ADN 10x (fourni avec les enzymes de restriction) afin que la concentration finale soit 1x, dans un microtube. Ajouter 1 μL d'enzyme de restriction RsaI (10 000 U / mL) et 1 μL d'enzyme de restriction HinfI (10 000 U / mL) à chaque tube. Ajustez le volume final à l'aide de H 2 O stérile et désionisé. Bien mélanger. Centrifuger brièvement (10-15 s à 16 000 xg) pour s'assurer que tous les composants se trouvent au bas du tube.
- Incuber les digestions à 37 ° C pendant ≥16 h. Après la digestion, stocker l'ADN digéré à 4 ° C ou -20 ° C pendant au plus 2 jours si nécessaire 17 .
4. Electrophorèse en gel d'ADN génomique
REMARQUE: Cette partie du protocole décrit une procédure d'utilisation d'un système d'électrophorèse sur gel de 20 cm x 25 cm. Électro de gel différentLes systèmes de phoresis peuvent être utilisés, mais plusieurs variables peuvent être modifiées, y compris la tension, le temps de migration et la quantité de tampon d'électrophorèse ajoutée au système afin d'obtenir des résultats optimaux.
- Préparer une solution d'agarose à 0,6% en combinant 2,25 g d'agarose en électrophorèse sur gel avec 375 ml de tampon d'électrophorèse, soit 1x TAE soit 0,5 fois TBE (base de Tris 110 mM, acide borique 90 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3).
REMARQUE: pour les télomères inférieurs à 8 000 kB, 0,5% de TBE est recommandé, tandis que 1x TAE est recommandé pour les télomères entre 8 000 kB et 20 000 kB 1 . - Micro-ondes la solution jusqu'à dissolution de l'agarose et la solution est claire. Laisser refroidir la solution pendant 15 à 20 min à température ambiante ou jusqu'à ce que l'agarose atteigne 50 ° C.
- Alors que la solution d'agarose se refroidit, préparer le système d'électrophorèse sur gel pour la moulage par gel comme décrit à l'étape 2.2. Verser la solution de gel d'agarose dans un bac de fonte de gel. Placez un peigne dansLe gel. Laisser durcir le gel pendant 45 minutes à la température ambiante.
- Préparer les échantillons d'ADN digérés pour l'électrophorèse. Pour une réaction de 40 uL, ajouter 0,4 μl de colorant de chargement 10x dans chaque échantillon d'ADN digéré. Centrifuger brièvement (10-15 s, 16 000 xg) pour s'assurer que toute la solution se trouve au bas du tube.
- Préparez le système d'électrophorèse sur gel pour la migration de l'ADN. Retirez les barrières et le peigne du gel. Remplissez le système d'électrophorèse sur gel avec 1x TAE ou 0,5x TBE à la ligne de remplissage, en veillant à ce que le gel soit complètement immergé dans le tampon.
- Chargez les puits du gel avec les échantillons d'ADN de sorte qu'il y ait un puits blanc entre les échantillons. Évitez de provoquer des bulles ou de perforer le gel. Ajouter 10 μL d'une échelle d'ADN dans les puits sur les extrémités opposées du gel.
REMARQUE: Le type d'échelle d'ADN dépend de la longueur des télomères, qui varieront d'une personne à l'autre et entre des sources de cellules. - Exécuter l'électrophorèse sur gel à 150 V pendant 30 minutes pour déplacer rapidement l'ADN dans le gel; Puis réglez la tension à 57 V et passez pendant 18-24 h.
5. Gel d'imagerie fluorescente et d'hybridation
- Après 18-24 h, éteignez la source d'alimentation en électrophorèse sur gel. Retirez le bac de moulage de gel avec le gel du tampon d'électrophorèse. Couper le coin supérieur droit du gel pour servir de référence pour l'orientation du gel.
- Préparez un morceau de papier filtre en découpant le papier d'une taille légèrement supérieure à celle du gel. Placez le papier filtre sur le dessus du gel dans le bac de coulée et laissez le papier absorber la solution excédentaire sur le gel. Retirez soigneusement les bulles d'air entre le papier filtre et le gel en utilisant une pipette en tant que rouleau pour presser les bulles par les côtés.
- Retirez le gel du bac de coulée en faisant basculer le gel et filtrez le papier afin que le papier soit sous le gel. Transférer le gel avec le papier filtre dans un sèche-gel et couvrir leGel avec une pellicule en plastique. Retirez toutes les bulles d'air entre l'enveloppe en plastique et le gel à l'aide d'une pipette en tant que rouleau.
- Sécher le gel pendant 2 h à 50 ° C.
- Une fois séché, retirez l'emballage plastique et transférez le gel et filtrez le papier dans un plat en verre contenant 250 ml d'eau désionisée (suffisant pour couvrir le gel). Retirez avec précaution le papier filtre et incubez le gel à température ambiante pendant 15 min. Le gel sera mince, ferme et facile à manipuler sans déchirure.
- Préparer une solution de SSC 5x (NaCl 750 mM, citrate de sodium 75 mM) dans de l'eau désionisée.
- Posez le gel sur un filet en nylon (12 po x 12 po). Roulez le filet de nylon et le gel ensemble en vous assurant que le gel n'est pas en contact avec lui-même. Placez le maillage et le gel dans un tube d'hybridation ( par exemple , 12 dans le tube avec 1,5 de diamètre).
REMARQUE: Lorsqu'il est correctement enroulé, le gel sera en contact avec la maille en nylon des deux côtés. - Combiner 100 mL de 5x SSC et 12 μL de nucléaire fluorescent vert aCid et placez-le dans le tube d'hybridation. Protégez la solution de la lumière et incupez pendant 30 min à 42 ° C dans un four à hybridation avec rotation.
- Retirez le filet en nylon / gel du tube d'hybridation, roulez-le et placez-le dans un plat en verre contenant 250 ml d'eau désionisée et retirez doucement le filet de nylon. Imagez le gel en utilisant un phosphorimager. Utilisez les paramètres fluorescents: 520 BP, 40 Bleu et 488 nm. Réglez le tube photomultiplicateur (PMT) sur 375, le plan focal à +3 mm et la sensibilité à la normale. Enregistrez l'image dans un fichier.
6. Hybridation
- Préparer la sonde de télomère radioactif.
- Combiner 2 μL (2 ng) de sonde de télomère (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μL de 10x tampon de réaction de polynucléotide kinase, 3 μL de γ 32 P-dATP (6 000 Ci / mmol), 4 μL de T4 L'eau désionisée stérile, polynucléotidique kinase et exempte de DNase à un volume final de 20 μL dans une micrTube d'ocentrifugeuse.
Attention: Suivez la sécurité et les réglementations radioactives des installations lors de l'utilisation de la radioactivité.
- Combiner 2 μL (2 ng) de sonde de télomère (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μL de 10x tampon de réaction de polynucléotide kinase, 3 μL de γ 32 P-dATP (6 000 Ci / mmol), 4 μL de T4 L'eau désionisée stérile, polynucléotidique kinase et exempte de DNase à un volume final de 20 μL dans une micrTube d'ocentrifugeuse.
- Centrifuger brièvement (10 à 30 s à 16 000 xg) et incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 h. Centrifuger 10 à 30 s à 16 000 xg et incuber à 65 ° C pendant 20 minutes pour arrêter la réaction.
- En utilisant une colonne de microspin à la Chromatographie G-25, mélanger le contenu de la colonne par vortex, puis centrifuger pendant 1 min à 700 xg à température ambiante. Jeter le filtrat.
- Charger la solution de sonde radioactive dans la colonne de Chromatographie G-25 et centrifuger pendant 2 min à 700 x g. Enregistrer le filtrat.
REMARQUE: Retenez le filtrat car il contient la sonde de télomère radioactive. La sonde radioactive peut être stockée à 4 ° C si nécessaire. - Préparez 250 ml d'une solution de dénaturation composée de NaCl 1,5 M et de NaOH 0,5 M dans de l'eau désionisée stérile.
- Placez le gel dans un plat en verre contenant 250 mL de solution dénaturant et d'incubationA mangé pendant 15 min à température ambiante. Enlevez la solution dénaturante et remplacez-les par 250 ml d'eau désionisée stérile. Incuber pendant 10 minutes sur un agitateur orbital (40 - 50 tr / min) à température ambiante.
- Préparez 250 ml de solution de neutralisation composée de 1,5 NaCl et d'acide tris-chlorhydrique 0,5 M, pH 8,0 dans de l'eau stérile désionisée.
- Retirez l'eau désionisée et remplacez-la par une solution de neutralisation de 250 ml et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.
- Pendant l'incubation dans la solution de neutralisation, préparer 50 ml de solution d'hybridation composée de 5x SSC, 5 fois de solution de Denhardt (0,1% de polymère synthétique non ionique, 0,1% de polyvinylpyrrolidine, 0,1% d'albumine de sérum bovin), 10 mM de phosphate disodique (Na 2 HPO 4 ) et 1 mM de pyrophosphate de sodium décahydrate tetrabasique (Na 4 P 2 O 7.10 H 2 O) dans de l'eau désionisée stérile.
- Rouler le gel en maille de nylon et le placer dans le tube d'hybridation (étape5.7). Ajouter 20 ml de la solution d'hybridation et incuber dans un four à hybridation à 42 ° C pendant 10 minutes avec rotation.
- Retirer la solution d'hybridation et remplacer par 20 ml d'une solution d'hybridation fraîche. Ajouter la totalité de la sonde télomère et incuber dans un four à hybridation à 42 ° C pendant la nuit avec rotation.
7. Lavage de gel, exposition au phosphore et imagerie radio
- Préparer 500 ml d'une solution SSC 2x (NaCl 300 mM, citrate de sodium 30 mM) dans de l'eau désionisée stérile.
- Préparer 250 mL de SSC 0,1x (NaCl 15 mM, citrate de sodium 1,5 mM) et 0,1% de Dodécyl Sulfate de Sodium (SDS) dans de l'eau désionisée.
- Retirez le gel et la maille du tube d'hybridation et placez-les dans un plat en verre contenant 250 mL de 2x SSC. Déroulez et retirez le filet en nylon du plat. Placez le plat en verre sur un agitateur orbital et incubez pendant 15 min à température ambiante.
- Retirez le SSC 2x et remplacez-le par 250 mL de 0.1x SSC et 0.1% de solution SDS, et incuber pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante.
- Pendant l'incubation, exposez l'écran Phosphor à la gomme d'image pendant 15 min.
- Retirez le SSC 0.1x et la solution SDS à 0,1% et remplacez-les par 250 ml de SSC 2x. Incuber pendant 15 minutes sur un agitateur orbital.
- Retirez le gel de la solution 2x SSC et enroulez le gel dans une pellicule plastique ou placez-la dans une poche thermoscellable. Retirez toutes les bulles et les poches d'air entre le gel et l'enveloppe en plastique ou la poche en plastique. Placez le gel dans une cassette d'exposition avec l'écran Phopshor. Exposez l'écran Phosphor au gel pendant la nuit.
- Image de l'écran Phosphor exposé à l'aide d'un phosphorimager.
8. Quantification de longueur Telomere
- Ouvrez le fichier phosphorimager contenant l'image fluorescente du gel coloré à l'acide nucléique fluorescent vert ( Figure 1 ).
- Sélectionnez 'Outils' puis 'Distance de Pixel9 ;. À l'aide de la souris, tracez une ligne du fond du gel au milieu de la première bande de marqueur et enregistrez la distance. Répétez cette procédure pour chaque marqueur ( Figure 2 ). Ces distances seront utilisées dans le programme graphique comme décrit ci-dessous.
- Ouvrir l'image phosphorique du gel radiomarqué ( Figure 3 ). Sélectionnez 'Object Manager', puis 'Grid'. Réglez la grille sur 1 colonne et 150 lignes. Réglez la grille de sorte qu'elle s'étende du haut du gel au fond du gel. Réglez la largeur de la grille pour égaler la largeur de la voie, en cliquant sur le bord de la grille et en faisant glisser la largeur de la grille pour égaler la largeur de la voie.
- Copiez cette grille (de sorte que la largeur et la hauteur des boîtes restent les mêmes) et déplacez la deuxième grille vers une voie vide (à des fins d'arrière-plan). Continuez à copier et à déplacer des grilles supplémentaires pour les voies supplémentaires de l'échantillon.
REMARQUE: une fois terminé, il devrait y avoirDes grilles pour chaque voie d'échantillonnage et une grille d'une voie vide pour l'arrière-plan ( Figure 4 ). - Sélectionnez «Analyse» puis «Rapport de volume». Sélectionnez toutes les grilles du rapport. Une fois le rapport de volume affiché, double-cliquez sur le rapport pour activer la feuille de calcul. Enregistrez le fichier tableur. Les données pour ce fichier seront Sous la voie «Volume».
- Ouvrez un programme graphique approprié et créez une nouvelle donnée et un tableau. Sélectionnez 'Y: Entrez et tracez une seule valeur Y pour chaque point' puis sélectionnez 'Créer'.
- Étiqueter la première colonne (colonne X) comme «Distance mesurée» et étiqueter la deuxième colonne (colonne Y) comme «poids moléculaire». Entrez les poids moléculaires marqueurs de chaque bande marqueur dans la colonne Y. Entrez les distances de migration obtenues à l'étape 8.2 correspondant à chaque marqueur de poids moléculaire.
- Passez à 'Analyse' et sélectionnez 'Analyser', puis 'régresser non linéaire'On (curve fit) 'et sélectionnez' OK '. À l'écran suivant, sélectionnez 'Exponentiel, puis' Dégradation d'une phase '. Sélectionnez l'onglet 'Plage' et entre '150' dans 'nombre de points qui définissent la courbe' et cochez 'Créer un tableau de coordonnées XY pour exporter ou copier la courbe vers un autre programme'.
REMARQUE: Le résultat, «ajustement non linéaire de données 1», contient le poids moléculaire pour chaque distance dans la rangée Y. - Pour l'analyse des voies d'échantillonnage, sélectionnez une zone d'analyse qui est au-dessus et en dessous des bandes de télomères réelles. N'utilisez pas toute la longueur de la voie ( Figure 5 ). Déterminer les emplacements du réseau pour la zone d'analyse de chaque voie.
- Sélectionnez 'Fichier', 'Nouveau' 'Créer une nouvelle table et un graphique'. Sélectionnez 'Y: Entrez et tracez une seule valeur Y pour chaque point' puis sélectionnez 'Créer'. Copiez et collez les valeurs de volume de la ligne d'arrière-plan (valeurs d'intensité) à partir du fichier de tableurDans la première colonne (X) et les valeurs de volume (valeurs d'intensité) de la voie de l'échantillon dans la première colonne Y. S'il y a plusieurs voies d'échantillonnage, copiez chaque ensemble de valeurs de volume du fichier de tableur dans des colonnes Y supplémentaires dans le programme graphique fichier.
- Supprimez les valeurs de la colonne d'arrière-plan (X) et de chaque voie d'échantillon (Y) qui se situent en dehors des domaines d'analyse déterminés à l'étape 8.8.
REMARQUE: le tableau de données ne doit contenir que des valeurs dans les emplacements de grille correspondant aux domaines d'analyse. - Sélectionnez Analyse, puis «Analyser» et «transformer». Cliquez sur 'OK'. Sélectionnez 'Transformer les valeurs Y en utilisant Y = YX'. Cela transformera les données en Data 2 (valeur d'intensité transformée (Y) = intensité de l'échantillon (Y) - intensité de fond (X)).
- Sélectionnez l'analyse puis «Analyser», «Analyse des colonnes» et «Statistiques des colonnes». Sélectionnez OK. L'onglet Résultats 'Col. Statistiques de Transform of Data 2 'montreSous la rangée 'Somme', Σ (Int i ).
- Sélectionnez 'Fichier', 'Nouveau', 'Créer une nouvelle table et un graphique'. Sélectionnez 'Y: Entrez et tracez une seule valeur Y pour chaque point' puis sélectionnez 'Créer'. Copiez et collez les données de la colonne Y de la page des résultats 'Nonlin fit of Data 1, Curve' dans la nouvelle colonne X. Copiez et collez les données de la colonne Y de la page de résultats 'Transformer les données 2' dans la nouvelle colonne Y. Sélectionnez l'analyse puis «Analyser» et «Transformer». Cliquez sur 'OK'. Sélectionnez 'Transformer les valeurs Y en utilisant Y = Y / X'.
- Sélectionnez l'analyse puis «Analyser», «Analyse des colonnes» et «Statistiques des colonnes». Sélectionnez OK. L'onglet Résultats 'Col. Les statistiques de Transform of Data 3 'se présentent sous la rangée' Sum ', Σ (Int i / MW i ). MW = poids moléculaire.
- Pour calculer la longueur moyenne des télomères (TL) pour chaque échantillon, utilisez leFormule TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trois concentrations d'ADN (1, 2 et 3 μg) isolées à partir de la lignée cellulaire BJ-HTERT (fibroblastes de prépuce humain immortalisé par la télomérase) 22 et des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été analysées pour la longueur des télomères. Le tableau 1 montre les affectations de voies pour chaque échantillon d'ADN. La figure 1 montre une tache fluorescente d'acide nucléique du gel. Les normes de poids moléculaire sont clairement visibles. On a déterminé la distance entre le haut du gel et chaque poids moléculaire standard ( figure 2 ). La figure 3 montre l'image phosphorique du gel suite à une hybridation avec la sonde télomère. Les bandes de télomères sont représentées sous forme de frottis dans chaque voie. Des grilles de 150 boîtes ont été calculées pour chaque voie plus une voie de fond ( Figure 4 ). Les domaines d'analyse correspondant aux zones de laLe gel contenant les bandes télomères pour chaque ensemble d'échantillons est présenté à la figure 5 . Des voies de fond distinctes ont été sélectionnées pour chaque ensemble d'échantillons afin de s'assurer que les intensités de fond étaient similaires pour chaque ensemble d'échantillons (pistes marquées B de la figure 5 ). Le tableau 2 montre les longueurs de fragments de restriction telomere pour chaque échantillon. La longueur moyenne des télomères dans la ligne cellulaire immortalisée hTERT (BJ-HTERT) est supérieure à celle observée dans les PBMC humaines (comparer les voies 2, 4 et 6 avec les voies 10, 12 et 14 de la figure 3 ). Ces résultats démontrent également que la quantité d'ADN génomique analysée dans chaque voie est essentielle à l'obtention d'un signal détectable suite à l'hybridation. Pour les échantillons avec des télomères assez uniformes ( c. -à-d. La ligne cellulaire BJ-HTERT), seulement 1 μg a été détecté en utilisant cette procédure (bien que le signal soit très faible). Cependant, pour les échantillons avec des télomères qui ont unUne variance plus grande ( c.-à - d . Les PBMC humaines), la quantité minimale d'ADN fournissant un signal fiable est de 2 μg.
Figure 1 : Gel coloré acide acide nucléique fluorescent vert. Phosphorimage du gel d'agarose séché coloré avec une tache d'acide nucléique fluorescente verte montrant l'emplacement des bandes d'échelle d'ADN (pistes 1 et 8). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Détermination de la distance de migration de la bande de marquage . Les flèches bleues indiquent la distance mesurée depuis le haut du gel jusqu'àCh bande d'échelle ADN. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie phosphorique des échantillons d'ADN Probed avec la sonde Telomere. Les voies 2, 4 et 6 contiennent de l'ADN de BJ-HTERT (respectivement 1, 2 et 3 μg). Les allées 10, 12 et 14 contiennent des ADN PBMC humains (1, 2 et 3 μg, respectivement). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : emplacement de la grille. Capture d'écran montrant l'emplacement de150 grilles de comptage pour chaque voie analysée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Domaines d'analyse. Phosphorimage des bandes de télomères montrant les zones d'analyse sélectionnées pour chaque ensemble d'échantillons. Les voies 2, 4 et 6 contiennent l'ADN BJ-HTERT; Les voies 10, 12 et 14 contiennent de l'ADN de PBMC humain. B = lignes de fond. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| voie | Échantillon |
| 1 | Échelle d'ADN |
| 2 | BJ-HTERT 1 &# 181; g |
| 3 | Blanc |
| 4 | BJ-HTERT 2 μg |
| 5 | Blanc |
| 6 | BJ-HTERT 3μg |
| 7 | Blanc |
| 8 | Échelle d'ADN |
| 9 | Blanc |
| dix | PBMC 1μg |
| 11 | Blanc |
| 12 | PBMC 2μg |
| 13 | Blanc |
| 14 | PBMC 3μg |
| Échantillons d'ADN séparés sur 0,6% de gel d'agarose |
Tableau 1: Affectations d'échantillons d'ADN d'agarose.
| Exemple (piste) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Longueur moyenne de Telomere = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1oug (1) | 268691 | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416337 | -142585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286653 | 62845 | 4.561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524123 | 3.586944286 |
Tableau 2: Calculs moyens de la longueur des télomères.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Après électrophorèse, le frottis d'ADN génomique est supérieur à 800 pb. Cela peut se produire si les enzymes de restriction sont défectueuses ou si des enzymes supplémentaires (comme décrit ci-dessus) sont nécessaires. Une deuxième explication possible est que la protéine est toujours attachée à l'ADN. Lors de la détermination de la concentration d'ADN par spectrophotomètre, le ratio 260/280 devrait être d'environ 1,8. Si ce rapport est <1,5, il existe une contamination des protéines qui peut entraver la digestion des enzymes de restriction. Soit l'échantillon d'ADN devrait être ré isolé, soit il faudrait éliminer la protéine avec une digestion par proteinase K et une extraction au phénol: chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol. L'utilisation d'un kit commercial d'isolation d'ADN entraîne habituellement un ADN avec un ratio 260/280 de 1,8 à 1,85.
Après l'exposition du gel à un écran phosphoreux, il n'y a pas de fragments de télomères détectés. Cela peut résulter d'une mauvaise sonde de télomère radiomarquée, une hybridation incorrecteDes conditions ou une quantité insuffisante d'ADN génomique de départ. Lors de la préparation de la sonde de télomère, à la fin de la centrifugation de la colonne G-25, il devrait y avoir une radioactivité facilement détectable dans l'écoulement (représentant la sonde télomère radiomarquée). Si la radioactivité n'est pas détectée, il y a eu un problème avec la préparation de la sonde. Il est également important de s'assurer que la température d'hybridation ne dépasse pas 42 ° C (pour éviter la fusion de la sonde: modèle complexe) et que le tampon d'hybridation immerge complètement le gel dans la chambre d'hybridation. La quantité minimale d'ADN génomique qui fournit des télomères détectables est de 2,0 à 3,0 μg. Des quantités plus petites de matière de départ peuvent entraîner une très faible perte de signal après l'hybridation.
Ce protocole nécessite 2-3 μg pour chaque détermination de la longueur des télomères. Si les échantillons doivent être exécutés en double ou en triple, il faut 6-12 μg d'ADN. Cela empêche La procédure est-elle utilisée sur des échantillons avec une quantité limitée d'ADN. La procédure est assez laborieuse nécessitant 3-4 jours pour être complétée. Le nombre d'échantillons analysés à la fois est limité au nombre de plates-formes d'électrophorèse sur gel et à la taille du peigne à gel d'agarose. En conséquence, il est moins idéal pour les études utilisant un grand nombre d'échantillons (tels que des études épidémiologiques).
Les techniques d'hybridation d'ADN des télomères séparés par électrophorèse sur gel restent l'étalon-or pour déterminer la longueur des télomères. Aucune autre procédure ne mesure directement la longueur des télomères, ce qui entraîne des dimensions réelles des télomères.
Il existe plusieurs étapes critiques dans cette procédure. Tout d'abord, l'échantillon d'ADN doit avoir une bonne intégrité, c'est -à- dire non ciselé. L'ADN qui est cisaillé peut entraîner de faux résultats de longueur des télomères. Il est également important que les digestions d'ADN soient complètes. La digestion de l'ADN génomique devrait entraîner un frottis d'ADN de 800 pb ou moins"Xref"> 2. Pour assurer une bonne digestion, certaines procédures ont décrit un total de 6 enzymes de restriction (plutôt que RsaI et Hinf1 comme décrit dans cette procédure). Les enzymes de restriction supplémentaires comprennent HhaI, MspI, HaeIII et AluI 2 . Une deuxième étape critique consiste à permettre au gel d'agarose de courir assez longtemps pour obtenir une séparation appropriée de l'ADN digéré. S'il y a une meilleure séparation, il y a une meilleure précision dans les analyses. Le temps de fonctionnement du gel devrait être assez long afin que les fragments d'ADN représentant 1 Kbp soient situés au fond du gel ( Figure 1 ). Selon la taille du gel et la tension de l'électrophorèse, cela peut nécessiter de 12 à 24 h. Une troisième étape critique est l'hybridation. Il doit y avoir suffisamment de tampon d'hybridation dans le tube de chambre pour immerger tout le gel lorsque le tube est horizontal. Des niveaux insuffisants de tampon d'hybridation peuvent entraîner une hybridation inégale de la sonde télomère.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien de l'installation partagée de l'Université de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology, soutenue en partie par le prix P30CA047904.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
