Summary
I denne artikel diskuteres en detaljeret protokol til kvantificering af telomerlængden ved hjælp af en modificeret terminalbegrænsningsfragmentanalyse, som giver hurtig og effektiv direkte måling af telomerlængde. Denne teknik kan anvendes på en række cellekilder til DNA til kvantificering af telomerlængden.
Abstract
Der er flere forskellige teknikker til måling af telomerlængden, hver med deres egne fordele og ulemper. Den traditionelle tilgang, Telomere Restriction Fragment (TRF) analyse, anvender en DNA hybridiseringsteknik, hvorved genomiske DNA-prøver fordøjes med restriktionsenzymer, efterlader telomere DNA-gentagelser og noget sub-telomer DNA. Disse adskilles af agarosegelelektroforese, overføres til en filtermembran og hybridiseres til oligonukleotidprober mærket med enten kemiluminescens eller radioaktivitet til visualisering af telomer-restriktionsfragmenter. Denne fremgangsmåde, når der kræves en større mængde DNA end andre teknikker, såsom PCR, kan måle telomer-længdefordelingen af en population af celler og tillader måling udtrykt i absolutte kilobaser. Dette manuskript demonstrerer en modificeret DNA-hybridiseringsprocedure til bestemmelse af telomerlængden. Genomisk DNA fordøjes først med restriktionsenzymer (som ikke skæresTelomerer) og adskilt af agarosegelelektroforese. Gelen tørres derefter, og DNA'et denatureres og hybridiseres in situ til en radioaktivt mærket oligonukleotidprobe. Denne in situ hybridisering undgår tab af telomere DNA og forbedrer signalintensiteten. Efter hybridisering afbildes gelerne under anvendelse af phosphorskærme, og telomerlængden kvantificeres ved anvendelse af et grafprogram. Denne procedure blev udviklet af laboratorierne i Drs. Woodring Wright og Jerry Shay ved University of Texas Southwestern 1 , 2 . Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af denne procedure, med nogle ændringer.
Introduction
Telomerer, der ligger i enderne af kromosomer, er nukleotid gentagelser af sekvensen TTAGGG (på humane kromosomer), der spiller en kritisk rolle i beskyttelsen af cellulær genetisk information 3 , 4 , 5 . Telomerer er adskillige tusinde basepar i længden og tjener til at beskytte integriteten af resten af kromosomet under DNA-replikation. Replikation af kromosomer er ikke perfekt, hvilket resulterer i, at enderne af kromosomet ikke bliver fuldstændigt kopieret. Denne ineffektivitet ved replikation betegnes som "end replikationsproblemet" og resulterer i tab af nogle af telomere-gentagelserne under hver runde af replikation 6 , 7 . Telomerlængden kan gendannes efter celledeling med telomerase, et enzym, der erstatter de tabte telomere sekvenser 8 , 9 . Telomerase er imidlertid ikkeAktiveret i de fleste humane somatiske celler, og som følge heraf vil telomerer med tiden forkortes, hvilket resulterer i en cellulær senescens 10 . På grund af telomereforkortelse betragtes telomerer som en biomarkør af aldring og risiko for aldersrelaterede sygdomme 11 , 12 . Derudover kan telomerlængden påvirkes af genetiske, miljømæssige og livsstilsfaktorer og andre stimuli såsom oxidativ stress, hvilket indikerer at telomerlængden kan spille en rolle som biomarkør i toksikologiske, epidemiologiske og adfærdsmæssige studier 13 , 14 , 15 .
Denne artikel demonstrerer en teknik til måling af telomerlængde ved anvendelse af en modificeret terminal-restriktionsfragment (TRF) analyse tilpasset fra Mender og Shay 2 og Kimura et al. 16 , og ligner Herbert, Shay og WrigHt 1 og haussmann og Mauck 17 Traditionelt involverer TRF-analyse en Southern blot-procedure. Southern blots betragtes som "guldstandarden" til undersøgelse af telomererlængde og anvendes aktivt til undersøgelse af leukocyttelomerlængde i epidemiologiske undersøgelser 18 . Denne TRF-analyse anvender fordøjet genomisk DNA, der efterlader telomere-gentagelserne. Dnafragmenterne separeres derefter ved gelelektroforese, denatureres og overføres til en nitrocellulosemembran. Telomere-sekvenserne hybridiseres til en telomer-oligonukleotidprobe. I stedet for at overføre de adskilte telomerer til en membran, bruger andre TRF-teknikker in-gel hybridiseringsteknikker med og uden denaturering af DNA'et. Inklusion af denaturering er vigtig, når man overvejer detektion af interstitielle telomerer, som er blevet rapporteret hos nogle arter 19 . Procedurer, der mangler denaturerende trin, opdager kun thE enkeltstrengede DNA-overhæng ved terminale telomerer og vil ikke binde til interstitielle telomere sekvenser 18 .
Udover TRF analyse er der flere andre teknikker til måling af telomerlængden, der hver især har deres egne fordele og ulemper. Flow-FISH-teknikken kan måle gennemsnitlig telomerlængde af individuelle celler af en distinkt celletype ved anvendelse af flowcytometri 16 , 20 . Selvom det nøjagtigt kan mærke telomerer med meget specifikke prober og reducere menneskelig fejl gennem automatisering, er Flow-FISH dyrere, mindre effektiv og kræver friske prøver og en højtuddannet tekniker, der begrænser sin evne til epidemiologiske undersøgelser 16 . Derudover tegner denne metode ikke for mulige ændringer i antallet af kromosomer i cellepopulationen. En anden teknik, qPCR, er almindeligt accepteret som et middel til måling af telomerlængden til epidemiologiske undersøgelser 21 .
TRF-proceduren har sine egne mangler, der begrænser brugen af det til nogle undersøgelser. TRF-teknikker kræver en stor mængde DNA sammenlignet med andre metoder (mellem 2 og 3 μg pr. Prøve). Dette begrænser teknikens anvendelser til at undersøge telomererlængden af kliniske prøver, for hvilke tilstrækkeligt genomisk DNA kan opsamles og kan ikke anvendes på nedbrydede DNA-prøver. Derudover er TRF-analysen kostbar og arbejdskrævende, hvilket kræver 4-5 dage for at give resultater. Imidlertid giver TRF en lav variationskoefficientGiver reproducerbarhed. Mens denne protokol er forskellig fra den traditionelle Southern blot (udnyttelse af in situ gel hybridisering), er de to teknikker grundlæggende de samme.
Teknikken præsenteret her er en kombination af en Southern blot og in-gel hybridisering; Associering af DNA-denatureringstrinnet fra Southern blots med in-gel hybridiseringen. Denne kombination har den ekstra fordel ved forbedret sondesignalstyrke sammenlignet med Southern blot og har konsekvent givet kvantificerbare resultater inden for vores laboratorium. Desuden giver anvendelsen af radioaktive sonder snarere end kemiluminescerende prober højere signalintensitet og giver mulighed for visualisering og kvantificering med en phosphorimager, hvilket gør analyserne af TRF brugervenlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genomisk DNA-ekstraktion
- Udfør en genomisk DNA-ekstraktion fra cellerne (her, cellelinje BJ-hTERT), der skal analyseres ved anvendelse af et kommercielt DNA-ekstraktionskit ifølge fabrikantens instruktioner.
- Mål DNA-koncentrationen med et spektrofotometer. Hvis DNA-koncentrationen er mindre end 100 μg / ml, præcipiteres DNA'et med ethanol og resuspenderes i et volumen TE-buffer (10 mM Tris-Cl; 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraeddikesyre), pH 8,0) for at sikre en DNA-koncentration af 100-600 μg / ml).
2. DNA Integrity Assessment
BEMÆRK: Denne del af protokollen beskriver en DNA-integritetsvurdering ved anvendelse af et gelelektroforesystem med en 11 cm x 14 cm gel. Andre systemer og gelstørrelser kan også anvendes, men spændings- og DNA-migrationstiden kan variere.
- Forbered en 1% agarosegel ved at kombinere 1 g elektroforese grade agarose i 100 ml 1x TAE buffer (40 mM Trer-base; 20 mM eddikesyre; 2 mM EDTA; PH 8,5) og mikrobølgeovn, indtil agarosen er opløst, og opløsningen er klar. Afkøl opløsningen ved stuetemperatur, indtil den når 50 ° C (ca. 15-20 minutter).
- Mens agaroseopløsningen køler, fremstilles gelstøbningsbakken ved at tilføre støbeendeporter til støbebakken. For at forhindre agaroselækage skal afkølingsportene fjernes til 4 ° C, inden de fastgøres til støbebakken.
- Når agaroseopløsningen er afkølet til 50 ° C, tilsættes 10 μl ethidiumbromid (10 mg / ml i dH20) og hæld agaroseopløsningen i gelstøbningsbakken. Tilsæt kammen til støbebakken.
- Lad agaroseopløsningen hærdes i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Klargør DNA-prøver til elektroforese ved at fortynde 25 ng genomisk DNA ved anvendelse af 1x TE buffer til et slutvolumen på 9 μl og tilsæt 1 μl 10x Loading Dye (0,25% (vægt / volumen) bromphenolblåt, 0,25% (vægt / volumen) xylen Cyano-FF, 30% (vol / vol) glycerol). Bland godt.
- Kør DNA-migrationen ved 100 V i ca. 2 timer eller indtil bromphenolblåt farvestof er ca. halvvejs gennem gelen.
- Billedet gelen ved hjælp af en ultraviolet lys transilluminator eller tilsvarende.
BEMÆRK: DNA-prøver med god integritet har bånd med høj molekylvægt uden smøring (det skyldes skåret eller brudt DNA). Hvis DNA-båndene er smurt, har de lav integritet og er ikke egnede til Southern blot-analysen, og DNA'et skal genisoleres med friske celler.
3. Genomisk DNA-fordøjelse
- Udfør fordøjelsen af det genomiske DNA i et slutvolumen på 20-40 μl.
BEMÆRK: Mængder størreEnd 40 μl vil overløb brøndene i agarosegelen.- Kombiner 3 μg genomisk DNA og den passende mængde 10x DNA-fordøjelsesbuffer (forsynet med restriktionsenzymer), således at den endelige koncentration er 1x i en mikrotube. Tilsæt 1 μL RsaI restriktionsenzym (10.000 U / ml) og 1 μl HinfI restriktionsenzym (10.000 U / ml) til hvert rør. Juster det endelige volumen ved hjælp af steril, deioniseret H 2 O. Bland godt. Centrifuger kort (10-15 s ved 16.000 xg) for at sikre, at alle komponenter er i bunden af røret.
- Inkubér fordøjelsen ved 37 ° C i 16 timer. Efter fordøjelsen opbevares det fordøjede DNA ved 4 ° C eller -20 ° C i højst 2 dage, hvis det er nødvendigt 17 .
4. Genomisk DNA-gelelektroforese
BEMÆRK: Denne del af protokollen beskriver en fremgangsmåde til brug af et 20 cm x 25 cm gelelektroforesystem. Forskellige gelelektronikPhoresis-systemer kan anvendes, men adskillige variabler må muligvis ændres, herunder spænding, migrationstid og mængde elektroforesebuffer tilsat til systemet for at give optimale resultater.
- Fremstil 0,6% agaroseopløsning ved at kombinere 2,25 g gelelektroforese grade agarose med 375 ml elektroforesebuffer, enten 1x TAE eller 0,5x TBE (110 mM Tris base; 90 mM borsyre; 2,5 mM EDTA; pH 8,3).
BEMÆRK: For telomerer mindre end 8.000 kB anbefales 0,5x TBE, mens 1x TAE anbefales til telomerer mellem 8.000 kB og 20.000 kB 1 . - Mikrobølgeopløsningen opløses, indtil agarosen er opløst, og opløsningen er klar. Lad opløsningen afkøle i 15 - 20 minutter ved stuetemperatur eller indtil agarosen når 50 ° C.
- Mens agaroseopløsningen køler, fremstilles gelelektroforesystemet til gelstøbning som beskrevet i trin 2.2. Hæld agarosegelopløsningen i en gelstøbningsbakke. Placer en kam iGelen. Lad gelen hærde i 45 min afdækket ved stuetemperatur.
- Forbered de fordøjede DNA-prøver til elektroforese. Til en 40 uL reaktion tilsættes 0,4 μl 10x ladningsfarvestof i hver prøve af fordøjet DNA. Kort centrifuge (10-15 s, 16.000 xg) for at sikre, at hele opløsningen er i bunden af røret.
- Forbered gelelektroforesystemet til DNA-migration. Fjern endeportene og kammen fra gelen. Fyld gelelektroforesystemet med 1x TAE eller 0,5x TBE til påfyldningslinjen, så gelen er helt nedsænket i bufferen.
- Indsæt gelens brønde med DNA-prøverne, således at der er en blank brønd mellem prøver. Undgå at forårsage bobler eller punktere gelen. Tilsæt 10 μl af en DNA-stige i brønde på de modsatte ender af gelen.
BEMÆRK: Typen af DNA-stige vil afhænge af længden af telomererne, som vil variere fra person til person og mellem cellekilder. - Kør gelelektroforese ved 150 V i 30 minutter for hurtigt at flytte DNA'et ind i gelen; Juster derefter spændingen til 57 V og kør i 18-24 timer.
5. Gel fluorescerende billeddannelse og hybridisering
- Efter 18-24 timer skal du slukke for gelelektroforeseffektkilden. Fjern gelstøbningsbakken med gelen fra elektroforesebufferen. Skær det øverste højre hjørne af gelen for at tjene som reference for gelens orientering.
- Klargør et stykke filterpapir ved at skære papiret til en lidt større størrelse end gelen. Placer filterpapiret oven på gelen i støbebakken, og lad papiret opsuge overskydende opløsning på gelen. Fjern forsigtigt luftboblerne mellem filterpapiret og gelen ved hjælp af en pipette som en rulle for at klemme boblerne ud gennem siderne.
- Fjern gelen fra støbebakken ved at vende gelen og filtrer papiret over, så papiret ligger under gelen. Overfør gelen med filterpapiret til en geltørrer og dækselGel med plastfolie. Fjern alle luftbobler mellem plastikpladen og gelen ved hjælp af en pipette som en rulle.
- Tør gelen i 2 timer ved 50 ° C.
- Når du har tørret, skal du fjerne plastfolien og overføre gelen og filtrerpapiret til en glasskål, der indeholder 250 ml deioniseret vand (tilstrækkeligt til at dække gelen). Fjern forsigtigt filterpapiret og inkubér gelen ved stuetemperatur i 15 minutter. Gelen bliver tynd, fast og nem at manipulere uden at rive.
- Forbered 5x SSC opløsning (750 mM NaCl; 75 mM natriumcitrat) i deioniseret vand.
- Læg gelen på toppen af et nylonnet (12 i x 12 i). Rull nylonnet og gel sammen og sørg for, at gelen ikke er i kontakt med sig selv. Placer mesh og gel i et hybridiseringsrør ( fx 12 i rør med 1,5 i diameter).
BEMÆRK: Når rullen er korrekt rullet, kommer gelen i kontakt med nylonnetet på begge sider. - Kombiner 100 ml 5x SSC og 12 μL grøn fluorescerende nukleinsyre aCid plet, og placere i hybridiseringsrøret. Beskyt opløsningen fra lys og inkuber i 30 minutter ved 42 ° C i en hybridiseringsovn med rotation.
- Fjern nylonsnit / gel fra hybridiseringsrøret, rull op og læg fladt i en glasskål, der indeholder 250 ml deioniseret vand, og fjern forsigtigt nylonnet. Billedet gelen ved hjælp af en phosphorimager. Brug fluorescerende indstillinger: 520 BP, 40 Blue og 488 nm. Indstil fotomultiplikatorrøret (PMT) til 375, brændpunktet til +3 mm og følsomheden til normal. Gem billedet til en fil.
6. Hybridisering
- Forbered den radioaktive telomere sonde.
- Kombiner 2 μL (2 ng) telomere probe (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μl 10x polynukleotidkinase-reaktionsbuffer, 3 μl y32P-dATP (6.000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynukleotidkinase og DNase fri, sterilt deioniseret vand til et slutvolumen på 20 μl i en mikrOcentrifugerør.
Forsigtig: Følg faciliteternes radioaktive sikkerhed og forskrifter ved brug af radioaktivitet.
- Kombiner 2 μL (2 ng) telomere probe (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μl 10x polynukleotidkinase-reaktionsbuffer, 3 μl y32P-dATP (6.000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynukleotidkinase og DNase fri, sterilt deioniseret vand til et slutvolumen på 20 μl i en mikrOcentrifugerør.
- Kort centrifuge (10-30 s ved 16.000 xg) og inkuber i vandbad ved 37 ° C i 1 time. Centrifuge i 10-30 s ved 16.000 xg og inkuber ved 65 ° C i 20 min for at stoppe reaktionen.
- Ved anvendelse af en G-25 kromatografisk mikrospointsøjle blandes kolonneindholdet ved vortexing og derefter centrifugeres i 1 minut ved 700 xg ved stuetemperatur. Kassér filtratet.
- Indlæs den radioaktive sondeopløsning i G-25-kromatografikolonnen og centrifuger i 2 minutter ved 700 x g. Gem filtratet.
BEMÆRK: Behold filtratet, da dette indeholder den radioaktive telomere sonde. Den radioaktive sonde kan opbevares ved 4 ° C, hvis det er nødvendigt. - Fremstil 250 ml denatureringsopløsning bestående af 1,5 M NaCl og 0,5 M NaOH i sterilt deioniseret vand.
- Placer gelen i en glasskål, der indeholder 250 ml denatureringsopløsning og inkubSpiste i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern denatureringsopløsningen og udskift med 250 ml sterilt deioniseret vand. Inkubér i 10 minutter på en orbital shaker (40-50 rpm) ved stuetemperatur.
- Tilbered 250 ml neutraliseringsopløsning sammensat af 1,5 NaCl og 0,5 M Tris-saltsyre, pH 8,0 i sterilt deioniseret vand.
- Fjern deioniseret vand og erstat med 250 ml neutraliseringsopløsning og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Under inkubationen i neutraliseringsopløsningen fremstilles 50 ml hybridiseringsopløsning bestående af 5x SSC, 5x Denhardts opløsning (0,1% ikke-ionisk syntetisk polymer, 0,1% polyvinylpyrrolidin, 0,1% bovint serumalbumin), 10 mM dinatriumphosphat (Na2HPO 4 ) og 1 mM natriumpyrophosphattetrabasisk decahydrat (Na4P207.10H20) i sterilt deioniseret vand.
- Rul gelen i nylonnet og sæt i hybridiseringsrøret (trin5.7). Tilsæt 20 ml hybridiseringsopløsningen og inkuber i en hybridiseringsovn ved 42 ° C i 10 minutter med rotation.
- Fjern hybridiseringsopløsningen og erstat med 20 ml frisk hybridiseringsopløsning. Tilsæt helheden af telomeresonden og inkuber i en hybridiseringsovn ved 42 ° C natten over med rotation.
7. Gel vask, fosfor skærm eksponering og radio billeddannelse
- Tilbered 500 ml 2x SSC opløsning (300 mM NaCl; 30 mM natriumcitrat) i sterilt deioniseret vand.
- Tilbered 250 ml 0,1x SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM natriumcitrat) og 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i deioniseret vand.
- Fjern gelen og maskeres fra hybridiseringsrøret og læg i en glasskål, der indeholder 250 ml 2x SSC. Løsn og fjern nylonnetet fra parabolantenne. Placer glasskålen på en orbital shaker og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern 2x SSC og udskift med 250 mL 0.1x SSC og 0.1% SDS-opløsning og inkuber i 15 minutter på en orbital shaker ved stuetemperatur.
- Under inkubationen udsættes Fosfor-skærmen for billedviskeren i 15 minutter.
- Fjern 0,1x SSC og 0,1% SDS opløsning og erstat med 250 ml 2x SSC. Inkubér i 15 minutter på en orbital shaker.
- Fjern gelen fra 2x SSC-opløsning, og luk gelen i plastfolie eller læg den i en varmeforseglet pose. Fjern alle bobler og luftlommer mellem gelen og plastfolien eller plastposen. Placer gelen i en eksponeringskassette med Phopshor-skærmen. Udsæt fosforskærmen på gelen natten over.
- Billedet af det eksponerede phosphorskærm ved hjælp af en phosphorimager.
8. Telomer længde kvantificering
- Åbn phosphorimager-filen indeholdende det fluorescerende billede af den grønne fluorescerende nukleinsyrefarvede gel ( figur 1 ).
- Vælg 'Værktøjer' og derefter 'Pixelafstand'9 ;. Ved hjælp af musen tegner du en linje fra bunden af gelen godt til midten af det første markørbånd og optager afstanden. Gentag denne procedure for hvert markørbånd ( figur 2 ). Disse afstande vil blive brugt i grafeprogrammet som beskrevet nedenfor.
- Åbn phosphorimagen af den radiomærkede gel ( figur 3 ). Vælg 'Object Manager' og derefter 'Grid'. Indstil gitteret til 1 kolonne og 150 rækker. Juster gitteret, så det strækker sig fra toppen af gelen til bunden af gelen. Juster bredden af gitteret, så den svarer til bredden af banen, klik på kanten af gitteret og træk bredden af gitteret til at svare til bredden af banen.
- Kopier dette net (så bredden og højden af kasserne forbliver ens), og flyt det andet net til en tom kørsel (til baggrundsformål). Fortsæt med at kopiere og flytte yderligere gitter til yderligere prøvebaner.
BEMÆRK: Når det er færdigt, skal der væreGitter for hver prøvebane og et gitter af en tom kørebane til baggrund ( figur 4 ). - Vælg "Analyse" og derefter "Volume Report". Vælg alle net for rapporten. Når volumerapporten er vist, skal du dobbeltklikke på rapporten for at aktivere regnearksprogrammet. Gem regnearkfilen. Dataene for denne fil bliver Under volumenbanen.
- Åbn et passende grafprogram og opret en ny data og tabel. Vælg 'Y: Indtast og plot en enkelt Y-værdi for hvert punkt' og vælg derefter 'Opret'.
- Mærk den første kolonne (Kolonne X) som 'Målt afstand' og mærk den anden kolonne (Kolonne Y) som 'Molekylvægt'. Indtast markørmolekylvægten for hvert markørbånd i kolonne Y. Indtast migrationsafstandene opnået i trin 8.2 svarende til hver molekylvægtmarkør.
- Gå til 'Analyse' og vælg 'Analyser' og derefter 'nonlinear regressi'På (kurveformet) 'og vælg' OK '. På det næste skærmbillede skal du vælge 'Eksponentiel og derefter' One phase decay '. Vælg fanen 'Range' og indtast '150' i 'antal point, der definerer kurven' og kryds 'Opret en tabel med XY-koordinater for at eksportere eller kopiere kurven til et andet program'.
BEMÆRK: Resultatet, 'ikke-lineær pasform i data 1', indeholder molekylvægten for hver afstand i Y-rækken. - Ved analyse af prøvebanerne skal du vælge et område med analyse, der ligger over og under de faktiske telomerbånd. Brug ikke hele længden af banen ( Figur 5 ). Bestem gridstederne for analysen af hver bane.
- Vælg 'Fil', 'Ny' 'Opret ny tabel og graf'. Vælg 'Y: Indtast og plot en enkelt Y-værdi for hvert punkt' og vælg derefter 'Opret'. Kopier og indsæt baggrundsbanevolumenværdierne (intensitetsværdier) fra regnearkfilenInd i den første kolonne (X) og volumenværdierne (intensitetsværdier) fra prøvebanen til den første kolonne Y. Hvis der er flere prøvebaner, skal du kopiere hvert sæt volumenværdier fra regnearkfilen til yderligere Y-kolonner i grafeprogrammet fil.
- Slet værdierne fra baggrundsøjlen (X) og hver prøvebane (Y), der ligger uden for analyserne, bestemt i trin 8.8.
BEMÆRK: Datatabellen skal kun indeholde værdier i de netsteder, der svarer til analysens områder. - Vælg Analyse, derefter 'Analysér' og 'transform'. Klik på 'OK'. Vælg 'Transform Y-værdier ved hjælp af Y = YX'. Dette vil omdanne dataene i data 2 (transformeret intensitetsværdi (Y) = stikintensitet (Y) - baggrundsintensitet (X)).
- Vælg Analyse derefter 'Analyser', 'Kolonneanalyse' og 'Kolonnestatistik'. Vælg OK. Resultatfanen 'Col. Statistikker for Transform of Data 2 'viserUnder 'Sum' rækken, Σ (Int i ).
- Vælg 'Fil', 'Ny', 'Opret ny tabel og graf'. Vælg 'Y: Indtast og plot en enkelt Y-værdi for hvert punkt' og vælg derefter 'Opret'. Kopier og indsæt Y-kolonnedata fra resultatsiden 'Nonlin fit of Data 1, Curve' i den nye X-kolonne. Kopier og indsæt Y-kolonnedata fra resultatsiden 'Transform of Data 2' i den nye Y-kolonne. Vælg Analyse og derefter 'Analysér' og 'Transformér'. Klik på 'OK'. Vælg 'Transform Y-værdier ved hjælp af Y = Y / X'.
- Vælg Analyse derefter 'Analyser', 'Kolonneanalyse' og 'Kolonnestatistik'. Vælg OK. Resultatfanen 'Col. Transformationsdata for data 3 'vises under' Sum 'rækken, Σ (Int i / MW i ). MW = molekylvægt.
- For at beregne den gennemsnitlige telomerlængde (TL) for hver prøve, skal du brugeFormel TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre koncentrationer af DNA (1, 2 og 3 μg) isoleret fra cellelinjen BJ-hTERT (telomerase-immortaliserede humane forhuden fibroblaster) 22 og humane perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) blev analyseret for telomerlængde. Tabel 1 viser baneopgaverne for hver DNA-prøve. Figur 1 viser en nukleinsyre-fluorescerende farve af gelen. Molekylvægtstandarderne er tydeligt synlige. Afstanden fra toppen af gelen til hver molekylvægtstandard blev bestemt ( figur 2 ). Figur 3 viser fosforimagen af gelen som følge af hybridisering med telomererproben. Telomerbåndene vises som udtværinger i hver bane. Rister med 150 bokse blev beregnet for hver bane plus en baggrundsbane ( figur 4 ). De analyser, der svarer til områderne iGel indeholdende telomerbåndene for hvert sæt prøver er vist i figur 5 . Separate baggrundsbaner blev udvalgt for hvert sæt prøver for at sikre, at baggrundsintensiteterne var ens for hvert prøvesæt (baner markeret B i figur 5 ). Tabel 2 viser telomer-restriktionsfragmentlængderne for hver prøve. Den gennemsnitlige telomerlængde i den immortaliserede hTERT-cellelinie (BJ-hTERT) er højere end den, der ses i humane PBMC'er (sammenligner bane 2, 4 og 6 med bane 10, 12 og 14 i figur 3 ). Disse resultater viser også, at mængden af genomisk DNA analyseret i hver bane er kritisk til opnåelse af et detekterbart signal efter hybridisering. For prøver med telomerer, der er ret ensartede ( dvs. BJ-hTERT-cellelinien) så lidt som 1 μg, kunne detekteres ved anvendelse af denne procedure (selvom signalet var meget svagt). For prøver med telomerer, der har aStørre varians ( dvs. humane PBMC'er), er den minimale mængde DNA, der tilvejebringer et pålideligt signal, 2 μg.
Figur 1 : Grøn fluorescerende nukleinsyre-farvet gel. Fosforimage af den tørrede agarosegel farvet med grøn fluorescerende nukleinsyrefarvning, der viser placeringen af DNA-stigebåndene (spor 1 og 8). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Bestemmelse af Marker Band Migration Distance . Blåpile angiver afstanden målt fra toppen af gelen til eaCh DNA stigen bånd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Fosforimage af DNA-prøver, der er proberet med telomererproben. Banerne 2, 4 og 6 indeholder BJ-hTERT DNA (henholdsvis 1, 2 og 3 μg). Banerne 10, 12 og 14 indeholder humant PBMC-DNA (henholdsvis 1, 2 og 3 μg). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Gitterplacering. Skærmbillede, der viser placeringen af150 tæller gitter for hver analyseret bane. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : Analyseområder. Fosforimage af telomerbånd, der viser de udvalgte analyser for hvert sæt prøver. Banerne 2, 4 og 6 indeholder BJ-hTERT DNA; Banerne 10, 12 og 14 indeholder humant PBMC-DNA. B = baggrundsbaner. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Lane | Prøve |
| 1 | DNA stige |
| 2 | BJ-HTERT 1 &# 181; g |
| 3 | Blank |
| 4 | BJ-hTERT 2 μg |
| 5 | Blank |
| 6 | BJ-hTERT 3 μg |
| 7 | Blank |
| 8 | DNA stige |
| 9 | Blank |
| 10 | PBMC'er 1 μg |
| 11 | Blank |
| 12 | PBMC'er 2 μg |
| 13 | Blank |
| 14 | PBMC'er 3 μg |
| DNA-prøver adskilt på 0,6% agarosegel |
Tabel 1: DNA-agaroseprøveopgaver.
| Prøve (bane) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Gennemsnitlig telomer længde = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | 268.691 | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103.204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148.411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416.337 | -142.585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286.653 | 62.845 | 4,561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524.123 | 3,586944286 |
Tabel 2: Gennemsnitlige Telomere Længde Beregninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter elektroforese er det genomiske DNA-smear højere end 800 bp. Dette kan ske, hvis restriktionsenzymerne er defekte, eller hvis der kræves yderligere enzymer (som beskrevet ovenfor). En anden mulig forklaring er, at proteinet stadig er bundet til DNA'et. Ved bestemmelse af DNA-koncentrationen ved spektrofotometer bør 260/280 forholdet være omkring 1,8. Hvis dette forhold er <1,5, er der proteinforurening, der kan forstyrre restriktionsenzymfordøjelsen. Enten ville DNA-prøven være nødvendigt at blive isoleret igen, eller proteinet ville blive fjernet med en proteinase K-fordøjelse og phenol: chloroformekstraktion efterfulgt af ethanoludfældning. Brugen af et kommercielt DNA isolationssæt resulterer rutinemæssigt i DNA med et 260/280 forhold på 1,8-1,85.
Efter eksponeringen af gelen på en phosphorskærm er der ikke fundet telomerfragmenter. Dette kan skyldes en dårlig radio-mærket telomere sonde, ukorrekt hybridiseringTilstande eller utilstrækkelig mængde af start-genomisk DNA. Ved fremstilling af telomere sonden bør centrifugering af G-25 søjlen let afsløres radioaktivitet i gennemstrømningen (repræsenterende den radiomærkede telomer-probe). Hvis der ikke registreres radioaktivitet, var der et problem med forberedelsen af sonden. Det er også vigtigt at sikre, at hybridiseringstemperaturen ikke overstiger 42 ° C (for at forhindre smeltning af sonden: skabelonkomplekset), og at hybridiseringsbufferen fuldstændigt nedsænker gelen i hybridiseringskammeret. Den mindste mængde genomisk DNA, der giver detekterbare telomerer, er 2,0-3,0 μg. Mindre mængder udgangsmateriale kan resultere i meget svagt til intet signal efter hybridisering.
Denne protokol kræver 2-3 μg for hver telomerlængdebestemmelse. Hvis prøverne skal køres i to eksemplarer eller tre eksemplarer, kræves der 6-12 μg DNA. Dette forhindrer th Proceduren er brugt på prøver med begrænset DNA-mængde. Proceduren er ret krævende, der kræver 3-4 dage at fuldføre. Antallet af prøver analyseret på et tidspunkt er begrænset til antallet af gelelektroforese rigge og størrelsen af agarosegelkammen. Som følge heraf er det mindre end ideelt til studier, der anvender stort antal prøver (såsom epidemiologiske undersøgelser).
DNA-hybridiseringsteknikker af telomerer separeret ved gelelektroforese forbliver guldstandarden til bestemmelse af telomerlængde. Ingen anden procedure måler direkte telomerlængden, hvilket resulterer i faktiske telomere størrelser.
Der er flere kritiske trin i denne procedure. For det første skal DNA-prøven have god integritet, dvs. ikke skåret. DNA, der er skåret, kan resultere i falske telomere længde resultater. Det er også vigtigt, at DNA-fordøjelsen er fuldstændig. Fordøjelsen af genomisk DNA skal resultere i et DNA-smear på 800 bp eller mindre"Xref"> 2. For at sikre en korrekt fordøjelse har nogle procedurer beskrevet i alt 6 restriktionsenzymer (i stedet for blot RsaI og Hinf1 som beskrevet i denne procedure). De yderligere restriktionsenzymer indbefatter HhaI, MspI, HaeIII og AluI2. Et andet kritisk trin tillader, at agarosegelen løber tilstrækkeligt langsomt til at opnå en ordentlig adskillelse af det fordøjede DNA. Hvis der er bedre adskillelse, så er der bedre præcision i analyserne. Gelens løbetid bør være tilstrækkelig lang, således at DNA-fragmenter, der repræsenterer 1 Kbp, er placeret i bunden af gelen ( figur 1 ). Afhængig af gelstørrelsen og spændingen af elektroforese kan dette kræve 12 til 24 timer. Et tredje kritisk trin er hybridiseringen. Der skal være tilstrækkelig hybridiseringsbuffer i kammerrøret til at nedsænke hele gelen, når røret er vandret. Utilstrækkelige niveauer af hybridiseringsbuffer kan resultere i ujævn hybridisering af telomer-proben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtten fra University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology fælles facilitet, der delvist understøttes ved tildeling P30CA047904.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
