Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

Summary

En este artículo, se discute un protocolo detallado para cuantificar la longitud de los telómeros usando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado que proporciona una medición directa rápida y eficiente de la longitud de los telómeros. Esta técnica puede aplicarse a una variedad de fuentes celulares de ADN para cuantificar la longitud de los telómeros.

Abstract

Existen varias técnicas diferentes para medir la longitud de los telómeros, cada una con sus propias ventajas y desventajas. El enfoque tradicional, el análisis de fragmentos de restricción Telomere (TRF), utiliza una técnica de hibridación de ADN mediante la cual las muestras de ADN genómico son digeridas con enzimas de restricción, dejando atrás las repeticiones del telómero y algún ADN sub-telomérico. Éstos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a una membrana de filtro y se hibridan con sondas de oligonucleótidos marcadas con quimioluminiscencia o radioactividad para visualizar fragmentos de restricción de telómeros. Este enfoque, aunque requiere una mayor cantidad de ADN que otras técnicas como la PCR, puede medir la distribución de la longitud de telómeros de una población de células y permite la medición expresada en kilobases absolutas. Este manuscrito demuestra un procedimiento de hibridación de ADN modificado para determinar la longitud de los telómeros. El ADN genómico se digiere primero con enzimas de restricción (que no se cortanTelómeros) y separados por electroforesis en gel de agarosa. El gel se seca entonces y el ADN se desnaturaliza y se hibrida in situ a una sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridación in situ evita la pérdida de ADN del telómero y mejora la intensidad de la señal. Después de la hibridación, se forman imágenes de los geles utilizando pantallas de fósforo y se cuantifica la longitud del telómero utilizando un programa de representación gráfica. Este procedimiento fue desarrollado por los laboratorios de los Dres. Woodring Wright y Jerry Shay en la Universidad de Texas Southwestern ^{1 , 2} . A continuación se presenta una descripción detallada de este procedimiento, con algunas modificaciones.

Introduction

Los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas, son repeticiones nucleotídicas de la secuencia TTAGGG (en los cromosomas humanos) que juegan un papel crítico en la protección de la información genética celular ^{3 , 4 , 5} . Los telómeros tienen varios miles de pares de bases de longitud y sirven para proteger la integridad del resto del cromosoma durante la replicación del ADN. La replicación de los cromosomas no es perfecta, resultando en que los extremos del cromosoma no estén completamente copiados. Esta ineficiencia en la replicación se denomina el "problema de replicación final" y resulta en la pérdida de algunas de las repeticiones telomere durante cada ronda de replicación [ ^{6 , 7]} . Telomere longitud puede ser restaurada después de la división celular por la telomerasa, una enzima que sustituye a las secuencias de telómeros perdidos ^{8 , 9} . La telomerasa, sin embargo, no esActivado en la mayoría de las células somáticas humanas y como resultado, con el tiempo, los telómeros se acortan, dando lugar eventualmente a la senescencia celular [ ^10] . Debido al acortamiento de telómeros, los telómeros se consideran un biomarcador del envejecimiento y el riesgo de enfermedades relacionadas con la edad ^{11 , 12} . Además, la longitud de los telómeros puede verse afectada por factores genéticos, ambientales y de estilo de vida y otros estímulos como el estrés oxidativo, lo que indica que la longitud de telómeros puede desempeñar un papel como biomarcador en estudios toxicológicos, epidemiológicos y de comportamiento ^{13 , 14 , 15} .

Este artículo demuestra una técnica para medir longitud de telómeros utilizando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado (TRF) adaptado de Mender y Shay ² y Kimura et al. ¹⁶ , y similar a Herbert, Shay y WrigHt ¹ y Haussmann y Mauck ¹⁷ . Tradicionalmente, el análisis de TRF implica un procedimiento de transferencia de Southern. Southern blots se consideran el "estándar de oro" para estudiar la longitud telómero y se utilizan activamente para examinar la longitud de los telómeros leucocitarios en estudios de epidemiología [ ^18] . Este análisis de TRF utiliza ADN genómico digerido que deja atrás las repeticiones teloméricas. Los fragmentos de ADN se separan después por electroforesis en gel, se desnaturalizan y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. Las secuencias de los telómeros se hibridan con una sonda de oligonucleótidos de telómeros. En lugar de transferir los telómeros separados a una membrana, otras técnicas de TRF utilizan técnicas de hibridación en gel con y sin desnaturalización del ADN. La inclusión de la desnaturalización es importante cuando se considera la detección de telómeros intersticiales, que han sido reportados en algunas especies [ ^19] . Los procedimientos que carecen de pasos desnaturalizantes sólo detectanE simple hundido ADN sobresale en telómeros terminales y no se vinculará a las secuencias de telómeros intersticiales [ ^18] .

Además del análisis de la TRF, existen varias otras técnicas para medir la longitud del telómero, cada una de las cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. La técnica Flow-FISH puede medir la longitud media de telómeros de células individuales de un tipo celular distinto mediante citometría ^de flujo ^{16 , 20} . Mientras que puede etiquetar con precisión los telómeros con sondas muy específicas y reducir el error humano a través de la automatización, Flow-FISH es caro, menos eficiente y requiere muestras frescas y un técnico altamente cualificado, limitando su capacidad para estudios epidemiológicos ¹⁶ . Además, este método no tiene en cuenta los posibles cambios en el número de cromosomas en la población celular. Otra técnica, qPCR, es ampliamente aceptada como un medio para medir la longitud de los telómeros para estudios epidemiológicos ^21] .

El procedimiento de TRF tiene sus propias deficiencias que limitan su uso para algunos estudios. Las técnicas de TRF requieren una gran cantidad de ADN en comparación con otros métodos (entre 2 y 3 μg por muestra). Esto limita las aplicaciones de la técnica al examen de la longitud de telómeros de las muestras clínicas para las que se puede recoger ADN genómico suficiente y no puede utilizarse en muestras de ADN degradadas. Además, el análisis de la TRF es costoso y requiere mucha mano de obra, requiriendo 4-5 días para obtener resultados. Sin embargo, el TRF produce un bajo coeficiente de varianzaConcediendo su reproducibilidad. Aunque este protocolo es diferente del tradicional Southern blot (utilizando la hibridación en gel in situ), las dos técnicas son fundamentalmente las mismas.

La técnica presentada aquí es una combinación de una transferencia de Southern y hibridación en gel; Asociando el paso de desnaturalización del ADN de las transferencias de Southern con la hibridación en gel. Esta combinación tiene el beneficio añadido de una intensidad de señal de sonda mejorada en comparación con la transferencia de Southern y ha proporcionado consistentemente resultados cuantificables dentro de nuestro laboratorio. Además, el uso de sondas radiactivas en lugar de sondas quimioluminiscentes produce una intensidad de señal más alta y permite la visualización y cuantificación con un fosforoimager, haciendo que los análisis de la TRF sean fáciles de usar.

Protocol

1. Extracción de ADN genómico

1. Realizar una extracción de ADN genómico de las células (en este caso, la línea celular BJ-hTERT) para ser analizado utilizando un kit comercial de extracción de ADN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro. Si la concentración de ADN es inferior a 100 μg / ml, precipitar el ADN con etanol y resuspender en un volumen de tampón TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (ácido etilendiaminotetraacético), pH 8.0), para asegurar una concentración de ADN de 100 - 600 mu g / ml).

2. Evaluación de la integridad del ADN

NOTA: Esta parte del protocolo describe una evaluación de la integridad del ADN utilizando un sistema de electroforesis en gel con un gel de 11 cm x 14 cm. También se pueden usar otros sistemas y tamaños de gel, pero el voltaje y el tiempo de migración del ADN pueden variar.

1. Preparar un gel de agarosa al 1% mediante la combinación de 1 g de agarosa de grado de electroforesis en 100 ml de tampón TAE 1x (40 mM TrEs-base; Ácido acético 20 mM; EDTA 2 mM; PH 8,5) y el microondas hasta que la agarosa se disuelve y la solución es clara. Enfriar la solución a temperatura ambiente hasta que alcance los 50 ° C (aproximadamente 15 - 20 min).
2. Mientras la solución de agarosa está enfriando, prepare la bandeja de colada de gel añadiendo puertas de extremo de colada a la bandeja de colada. Para evitar fugas de agarosa, enfríe las compuertas finales a 4 ° C antes de fijarlas a la bandeja de colada.
3. Una vez que la solución de agarosa se ha enfriado a 50 ° C, agregue 10 μl de bromuro de etidio (10 mg / ml en dH $ _₂ $ O) y vierta la solución de agarosa en la bandeja de colada de gel. Agregue el peine a la bandeja de colada.
4. Dejar que la solución de agarosa se endurezca durante 45 minutos a temperatura ambiente.
5. Preparar muestras de ADN para electroforesis diluyendo 25 ng de ADN genómico utilizando 1x TE buffer hasta un volumen final de 9 μL y añadir 1 μl de 10x Colorante de carga (0,25% (p / v) de azul de bromofenol, 0,25% (p / v) de xileno Cianol FF, 30% (v / v) de glicerol). Mezclar bien.
6. Ejecutar la migración del ADN a 100 V durante aproximadamente 2 h o hasta que el colorante azul de bromofenol esté aproximadamente a medio camino a través del gel.
7. Imagen del gel utilizando un transiluminador de luz ultravioleta o equivalente.
   NOTA: Las muestras de ADN con buena integridad tienen bandas de alto peso molecular sin manchas (que se deben al ADN cortado o roto). Si las bandas de ADN se manchan, tienen baja integridad y no son adecuadas para el análisis de transferencia de Southern, y el ADN debe volver a aislarse con células nuevas.

3. Digestión genómica del ADN

1. Realizar la digestión del ADN genómico en un volumen final de 20-40 μL.
   NOTA: Volúmenes mayoresDe 40 μl desbordarán los pocillos del gel de agarosa.
   1. Se combinan 3 μg de ADN genómico y la cantidad apropiada de tampón de digestión de ADN 10x (suministrado con las enzimas de restricción) de modo que la concentración final sea 1x, en un microtubo. Añadir 1 μl de enzima de restricción RsaI (10.000 U / mL) y 1 μl de enzima de restricción HinfI (10.000 U / mL) a cada tubo. Ajustar el volumen final usando H2O desionizada y estéril. Mezclar bien. Centrifugar brevemente (10-15 s a 16.000 xg) para asegurarse de que todos los componentes están en la parte inferior del tubo.
2. Incubar las digestiones a 37 ° C durante ≥16 h. Después de la digestión, almacenar el ADN digerido a 4 ° C o -20 ° C durante no más de 2 días si es necesario ¹⁷ .

4. Electroforesis en gel de ADN genómico

NOTA: Esta parte del protocolo describe un procedimiento para usar un sistema de electroforesis en gel de 20 cm x 25 cm. Diferentes gel electroSe pueden usar sistemas de foresis, pero puede ser necesario modificar varias variables, incluyendo el voltaje, el tiempo de migración y la cantidad de tampón de electroforesis añadido al sistema para obtener resultados óptimos.

1. Preparar una solución de agarosa al 0,6% mediante la combinación de 2,25 g de agarosa de electroforesis en gel con 375 ml de tampón de electroforesis, bien 1x TAE o 0,5x TBE (110 mM de base de Tris, 90 mM de ácido bórico, 2,5 mM de EDTA, pH 8,3).
   NOTA: Para telómeros inferiores a 8.000 kB, se recomienda 0,5 X TBE mientras que se recomienda 1x TAE para telómeros entre 8.000 kB y 20.000 kB ¹ .
2. Microondas de la solución hasta que la agarosa se ha disuelto y la solución es clara. Deje que la solución se enfríe durante 15 - 20 min a temperatura ambiente o hasta que la agarosa alcance 50ºC.
3. Mientras la solución de agarosa se está enfriando, preparar el sistema de electroforesis en gel para moldeo en gel como se describe en el paso 2.2. Verter la solución de gel de agarosa en una bandeja de colada de gel. Coloque un peine enEl gel. Dejar que el gel se endurezca durante 45 minutos sin cubrir a temperatura ambiente.
4. Preparar las muestras de ADN digerido para la electroforesis. Para una reacción de 40 mu l, añadir 0,4 mu l de colorante de carga 10x en cada muestra de ADN digerido. Centrifugar brevemente (10-15 s, 16.000 xg) para asegurar que toda la solución esté en la parte inferior del tubo.
5. Preparar el sistema de electroforesis en gel para la migración del ADN. Retire las compuertas y el peine del gel. Llenar el sistema de electroforesis en gel con 1x TAE o 0.5x TBE a la línea de llenado, asegurando que el gel esté completamente sumergido en el tampón.
6. Cargar los pocillos del gel con las muestras de ADN de manera que haya un pocillo en blanco entre las muestras. Evite causar burbujas o pinchar el gel. Añadir 10 μL de una escalera de ADN en pozos en los extremos opuestos del gel.
   NOTA: El tipo de escalera de ADN dependerá de la longitud de los telómeros, que variará de persona a persona y entre las fuentes celulares.
7. Ejecutar la electroforesis en gel a 150 V durante 30 minutos para mover rápidamente el ADN dentro del gel; Luego ajuste el voltaje a 57 V y corra durante 18-24 h.

5. Imágenes y hibridación fluorescentes en gel

1. Después de 18-24 h, apagar la fuente de energía de electroforesis en gel. Se retira la bandeja de colada de gel con el gel del tampón de electroforesis. Cortar la esquina superior derecha del gel para servir como referencia para la orientación del gel.
2. Prepare un pedazo de papel de filtro cortando el papel para que sea un tamaño ligeramente mayor que el gel. Coloque el papel de filtro encima del gel en la bandeja de colada y deje que el papel absorba el exceso de solución en el gel. Retire cuidadosamente las burbujas de aire entre el papel de filtro y el gel usando una pipeta como un rodillo para exprimir las burbujas a través de los lados.
3. Retire el gel de la bandeja de colada tirando el gel y el papel de filtro de modo que el papel esté por debajo del gel. Transferir el gel con el papel de filtro a un secador de gel y cubrir elGel con envoltura de plástico. Retire todas las burbujas de aire entre la envoltura de plástico y el gel usando una pipeta como rodillo.
4. Se seca el gel durante 2 ha 50 ° C.
5. Una vez secado, retire la envoltura de plástico y transfiera el gel y el papel de filtro a una placa de vidrio que contiene 250 ml de agua desionizada (suficiente para cubrir el gel). Retire cuidadosamente el papel de filtro e incube el gel a temperatura ambiente durante 15 min. El gel será delgado, firme y fácil de manipular sin rasgar.
6. Preparar solución SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM) en agua desionizada.
7. Coloque el gel encima de una malla de nylon (12 pulgadas x 12 pulgadas). Enrollar la malla de nylon y gel juntos asegurándose de que el gel no está en contacto con sí mismo. Coloque la malla y el gel en un tubo de hibridación ( por ejemplo , tubo de 12 pulgadas con 1,5 pulgadas de diámetro).
   NOTA: Cuando se enrolla correctamente, el gel estará en contacto con la malla de nylon en ambos lados.
8. Se combinan 100 mL de SSC 5x y 12 mu l de nucleótido fluorescente verde aCid, y colocar en el tubo de hibridación. Proteger la solución de la luz e incubar durante 30 minutos a 42 ° C en un horno de hibridación con rotación.
9. Retire la malla de nylon / gel del tubo de hibridación, ruede y póngala plana en un plato de vidrio que contenga 250 mL de agua desionizada, y retire suavemente la malla de nylon. Image el gel usando un phosphorimager. Utilice los ajustes fluorescentes: 520 BP, 40 Blue y 488 nm. Ajuste el tubo fotomultiplicador (PMT) a 375, el plano focal a +3 mm y la sensibilidad a la normal. Guarde la imagen en un archivo.

6. Hibridación

1. Preparar la sonda de telómeros radiactivos.
   1. Se combinan 2 μl de sonda de telómeros (5- (CCC TAA) ₄ 3 '), 2,5 μl de tampón de reacción de polinucleótido quinasa 10x, 3 μL de γ ³² P-dATP (6.000 Ci / mmol), 4 μl de T4 Polinucleótido quinasa y DNasa libre, agua desionizada estéril hasta un volumen final de 20 μl en un micrómetroOcentrifuge tubo.
      Precaución: Siga la seguridad radiactiva de las instalaciones y las regulaciones al usar la radiactividad.
2. Centrifugar brevemente (10-30 s a 16.000 xg) e incubar en baño de agua a 37 ° C durante 1 h. Centrifugar durante 10-30 s a 16.000 xg e incubar a 65 ° C durante 20 minutos para detener la reacción.
3. Utilizando una columna de microspin de cromatografía G-25, mezclar el contenido de la columna mediante agitación en vórtex, después centrifugar durante 1 min a 700 xg a temperatura ambiente. Desechar el filtrado.
4. Cargar la solución de la sonda radiactiva en la columna de cromatografía G-25 y centrifugar durante 2 min a 700 x g. Guardar el filtrado.
   NOTA: Conserve el filtrado ya que contiene la sonda de telómeros radiactivos. La sonda radiactiva se puede almacenar a 4 ° C si es necesario.
5. Preparar 250 ml de solución desnaturalizante compuesta de NaCl 1,5 M y NaOH 0,5 M en agua estéril desionizada.
6. Colocar el gel en un plato de vidrio que contiene 250 ml de solución desnaturalizante e incubarSe comió durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retirar la solución desnaturalizante y sustituirla por 250 ml de agua desionizada estéril. Incubar durante 10 minutos en un agitador orbital (40 - 50 rpm) a temperatura ambiente.
7. Preparar 250 ml de solución de neutralización compuesta de 1,5 NaCl y 0,5 M de ácido tris-clorhídrico, pH 8,0 en agua estéril desionizada.
8. Eliminar el agua desionizada y reemplazar con 250 ml de solución de neutralización e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
9. Durante la incubación en la solución de neutralización, se preparan 50 ml de solución de hibridación compuesta de 5 x SSC, 5x solución de Denhardt (polímero sintético no iónico al 0,1%, polivinilpirrolidina al 0,1%, albúmina de suero bovino al 0,1%), fosfato disódico 10 mM ₄ ) y pirofosfato de sodio 1 mM decahidrato tetrabásico (Na ₄ P ₂ O _7. 10 H ₂ O) en agua desionizada estéril.
10. Enrollar el gel en malla de nylon y colocarlo en el tubo de hibridación (paso5.7). Añadir 20 ml de la solución de hibridación e incubar en un horno de hibridación a 42 ° C durante 10 min con rotación.
11. Se retira la solución de hibridación y se reemplaza con 20 ml de solución de hibridación fresca. Se añade la totalidad de la sonda telomérica y se incuba en un horno de hibridación a 42 ° C durante la noche con rotación.

7. Lavado de gel, exposición a la pantalla de fósforo e imágenes por radio

1. Preparar 500 ml de solución SSC 2x (NaCl 300 mM, citrato sódico 30 mM) en agua estéril desionizada.
2. Preparar 250 ml de SSC 0,1x (NaCl 15 mM, citrato sódico 1,5 mM) y sulfato de sodio y sodio (SDS) al 0,1% en agua desionizada.
3. Se retira el gel y la malla del tubo de hibridación y se coloca en un recipiente de vidrio que contiene 250 ml de SSC 2x. Desenrollar y quitar la malla de nylon del plato. Colocar el plato de vidrio en un agitador orbital e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire el SSC 2x y reemplácelos con 250 mL de SSC 0,1x y 0.1% SDS, e incubar durante 15 min en un agitador orbital a temperatura ambiente.
5. Durante la incubación, exponga la pantalla Phosphor al borrador de imagen durante 15 min.
6. Eliminar la SSC 0,1x y la solución de SDS al 0,1% y reemplazarla con 250 mL de SSC 2x. Incubar durante 15 minutos en un agitador orbital.
7. Retire el gel de la solución 2x ​​SSC y envuelva el gel en una envoltura de plástico o colóquelo en una bolsa termosellable. Retire todas las burbujas y bolsas de aire entre el gel y la envoltura de plástico o bolsa de plástico. Coloque el gel en un casete de exposición con la pantalla Phopshor. Exponer la pantalla de Phosphor al gel durante la noche.
8. Imagen de la pantalla de Phosphor expuestos utilizando un phosphorimager.

8. Cuantificación de la longitud del telómero

1. Abra el archivo de fosfato de imagen que contiene la imagen fluorescente del gel fluorescente verde manchado de ácido nucleico ( Figura 1 ].
2. Seleccione 'Herramientas' y luego 'Pixel Distance9 ;. Usando el ratón, trace una línea desde la parte inferior del gel hasta el centro de la primera banda de marcadores y anote la distancia. Repita este procedimiento para cada banda de marcadores ( Figura 2 ). Estas distancias se utilizarán en el programa de representación gráfica como se describe a continuación.
3. Abre la fosforilación del gel radiomarcado ( Figura 3 ). Seleccione 'Object Manager' y luego 'Grid'. Establezca la cuadrícula en 1 columna y 150 filas. Ajuste la rejilla para que se estire desde la parte superior del gel hasta el fondo del gel. Ajuste el ancho de la cuadrícula para que coincida con el ancho del carril, haciendo clic en el borde de la cuadrícula y arrastrando el ancho de la cuadrícula para igualar el ancho del carril.
4. Copie esta cuadrícula (para que el ancho y la altura de los cuadros permanezcan iguales) y mueva la segunda cuadrícula a un carril vacío (para propósitos de fondo). Continúe copiando y moviendo grids adicionales para carriles de muestras adicionales.
   NOTA: Cuando haya terminado, debe haberCuadrículas para cada carril de muestra y una cuadrícula de un carril vacío para el fondo ( Figura 4 ).
5. Seleccione "Análisis" y luego "Informe de volumen" Seleccione todas las cuadrículas del informe Una vez que se muestre el informe de volumen, haga doble clic en el informe para activar el programa de hoja de cálculo Guardar el archivo de hoja de cálculo. Bajo el carril 'Volumen'.
6. Abra un programa gráfico adecuado y cree una nueva tabla y datos. Seleccione 'Y: Introduzca y trace un solo valor de Y para cada punto' y seleccione 'Crear'.
7. Etiquetar la primera columna (columna X) como "distancia medida" y etiquetar la segunda columna (columna Y) como "peso molecular". Introduzca los pesos moleculares del marcador de cada banda de marcador en la columna Y. Introduzca las distancias de migración obtenidas en el paso 8.2 correspondientes a cada marcador de peso molecular.
8. Vaya a 'Análisis' y seleccione 'Analizar' y luego 'no lineal regressi(Ajuste de curva) 'y seleccione' OK '. En la siguiente pantalla, seleccione 'Exponencial y luego' Degradación de una fase '. Seleccione la pestaña 'Rango' e introduzca '150' en 'número de puntos que definen la curva' y marque 'Crear una tabla de coordenadas XY para exportar o copiar la curva a otro programa'.
   NOTA: El resultado, 'ajuste no lineal de Datos 1', contiene el peso molecular para cada distancia en la fila Y.
9. Para el análisis de los carriles muestrales, seleccione un área de análisis que esté por encima y por debajo de las bandas reales de telómeros. No utilice toda la longitud del carril ( Figura 5 ). Determine las ubicaciones de la rejilla para el área de análisis de cada carril.
10. Seleccione 'Archivo', 'Nuevo' 'Crear nueva tabla y gráfico'. Seleccione 'Y: Introduzca y trace un solo valor de Y para cada punto' y seleccione 'Crear'. Copie y pegue los valores de volumen de fondo del carril (valores de intensidad) del archivo de hoja de cálculoEn la primera columna (X) y los valores de volumen (valores de intensidad) del carril de muestra en la primera columna Y. Si hay varios carriles de muestra, copie cada conjunto de valores de volumen del archivo de hoja de cálculo en columnas Y adicionales en el programa de representación gráfica archivo.
11. Elimine los valores de la columna de fondo (X) y de cada carril de muestra (Y) que están fuera de las áreas de análisis determinadas en el paso 8.8.
    NOTA: La tabla de datos sólo debe contener valores en las ubicaciones de la cuadrícula correspondientes a las áreas de análisis.
12. Seleccione Análisis, luego "Analizar" y "Transformar". Haga clic en Aceptar'. Seleccione 'Transformar valores Y usando Y = YX'. Esto transformará los datos en Datos 2 (valor de intensidad transformado (Y) = intensidad de muestra (Y) - intensidad de fondo (X)).
    1. Seleccione Análisis y luego "Analizar", "Análisis de columnas" y "Estadísticas de columnas". Seleccione Aceptar. La pestaña de resultados 'Col. Estadísticas de Transform of Data 2 'muestraBajo la fila 'Sum', Σ (Int _i ).
13. Seleccione 'Archivo', 'Nuevo', 'Crear nueva tabla y gráfico'. Seleccione 'Y: Introduzca y trace un solo valor de Y para cada punto' y seleccione 'Crear'. Copie y pegue los datos de la columna Y de la página de resultados 'Ajuste Nonlin de Datos 1, Curva' en la nueva columna X. Copie y pegue los datos de la columna Y de la página de resultados 'Transformar Datos 2' en la nueva columna Y. Seleccione Análisis luego "Analizar" y "Transformar". Haga clic en Aceptar'. Seleccione 'Transformar valores Y usando Y = Y / X'.
    1. Seleccione Análisis y luego "Analizar", "Análisis de columnas" y "Estadísticas de columnas". Seleccione Aceptar. La pestaña de resultados 'Col. Stats of Transform of Data 3 'muestra bajo la fila' Sum ', Σ (Int _i / MW _i ). PM = peso molecular.
14. Para calcular la longitud media de los telómeros (TL) para cada muestra,Fórmula TL = Σ (Int _i ) / Σ (Int _i / MW _i ).

Representative Results

Se analizaron tres concentraciones de ADN (1, 2 y 3 μg) aisladas de la línea celular BJ-hTERT (fibroblastos de prepucio humano inmortalizado con telomerasa) ²² y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas para determinar la longitud de los telómeros. La Tabla 1 muestra las asignaciones de carriles para cada muestra de ADN. La Figura 1 muestra una tinción fluorescente de ácido nucleico del gel. Los patrones de peso molecular son claramente visibles. Se determinó la distancia desde la parte superior del gel a cada patrón de peso molecular ( Figura 2 ). La Figura 3 muestra la imagen fosforescente del gel después de la hibridación con la sonda telomérica. Las bandas de los telómeros se muestran como manchas en cada carril. Se calcularon cuadrículas de 150 cajas para cada carril más un carril de fondo ( Figura 4 ). Las áreas de análisis correspondientes a las áreas de laGel que contiene las bandas de telómeros para cada conjunto de muestras se muestra en la Figura 5 . Se seleccionaron carriles de fondo separados para cada conjunto de muestras para asegurar que las intensidades de fondo fueran similares para cada conjunto de muestras (carriles marcados B en la Figura 5 ). La Tabla 2 muestra las longitudes de los fragmentos de restricción de los telómeros para cada muestra. La longitud media de los telómeros en la línea celular inmortalizada con hTERT (BJ-hTERT) es mayor que la observada en las PBMC humanas (comparar los carriles 2, 4 y 6 con los carriles 10, 12 y 14 en la Figura 3 ). Estos resultados también demuestran que la cantidad de ADN genómico analizada en cada carril es crítica para obtener una señal detectable después de la hibridación. Para muestras con telómeros que son bastante uniformes ( es decir , la línea celular BJ-hTERT) tan poco como 1 μg fue detectable usando este procedimiento (aunque la señal era muy débil). Sin embargo, para muestras con telómeros queMayor varianza ( es decir , PBMCs humanos), la cantidad mínima de ADN que proporciona una señal fiable es de 2 μg.

Figura 1 : Gel manchado de ácido nucleico fluorescente verde. La fosforescencia del gel de agarosa secado teñido con coloración de ácido nucleico fluorescente verde que muestra la ubicación de las bandas de cadenas de ADN (carriles 1 y 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Determinación de la distancia de migración de la banda de marcadores . Las flechas azules indican la distancia medida desde la parte superior del gel a EACh Escala de la escala de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Imagen de fosforado de muestras de ADN ensayadas con la sonda Telomere. Las pistas 2, 4 y 6 contienen ADN de BJ-hTERT (1, 2 y 3 μg, respectivamente). Las pistas 10, 12 y 14 contienen ADN de PBMC humano (1, 2 y 3 μg, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Ubicación de la cuadrícula. Captura de pantalla que muestra la ubicación deRedes de 150 conteos por cada carril analizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Áreas de análisis. Phosphorimage de telomere bandas que muestran las áreas seleccionadas de análisis para cada conjunto de muestras. Las pistas 2, 4 y 6 contienen ADN de BJ-hTERT; Los carriles 10, 12 y 14 contienen ADN de PBMC humano. B = carriles de fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

carril	Muestra
1	Escalera de ADN
2	BJ-hTERT 1 &G
3	Blanco
4	BJ-hTERT 2 μg
5	Blanco
6	BJ-hTERT 3 mu g
7	Blanco
8	Escalera de ADN
9	Blanco
10	PBMCs 1 mu g
11	Blanco
12	PBMCs 2 mu g
13	Blanco
14	PBMCs 3 mu g
	Las muestras de ADN se separaron en gel de agarosa al 0,6%

Tabla 1: Asignaciones de muestra de la muestra de la DNA Agarose.

Muestra (Carril)	& #8721; (Int i )	Σ (Int i / MW i )	Promedio Telomere Longitud = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i )
BJTert 1ug (1)	268691	20596	13.04578559
BJTert 2ug (2)	1357000	103204	13.14871517
BJTert 3ug (3)	1962000	148411	13.22004434
PBMC 1ug (4)	-416337	-142585	2.91992145
PBMC 2ug (5)	286653	62845	4.561269791
PBMC 3ug (6)	1880000	524123	3.586944286

Tabla 2: Cálculos medios de la longitud del telómero.

Discussion

Después de la electroforesis, el frotis de ADN genómico es superior a 800 pb. Esto puede ocurrir si las enzimas de restricción son defectuosas o si se necesitan enzimas adicionales (como se ha descrito anteriormente). Una segunda explicación posible es que la proteína todavía está unida al ADN. Cuando se determina la concentración de ADN por espectrofotómetro, la relación 260/280 debe ser de alrededor de 1,8. Si esta proporción es <1,5, hay contaminación de proteínas que puede interferir con la digestión con enzimas de restricción. La muestra de ADN necesitarıa volver a aislarse, o la proteına deberıa eliminarse con una digestión con proteinasa K y una extracción con fenol: cloroformo seguida de precipitación con etanol. El uso de un kit comercial de aislamiento de ADN rutinariamente da como resultado ADN con una relación 260/280 de 1,8-1,85.

Después de la exposición del gel a una pantalla de fósforo, no se detectaron fragmentos de telómeros. Esto puede deberse a una mala sonda de telómeros radiomarcada, a una hibridación inadecuadaCondiciones o cantidad insuficiente de ADN genómico de partida. Cuando se prepara la sonda de telómeros, al final de la centrifugación de la columna G-25, debería haber una radiactividad fácilmente detectable en el flujo (que representa la sonda de telómeros radiomarcada). Si la radioactividad no se detecta, entonces hubo un problema con la preparación de la sonda. También es importante asegurarse de que la temperatura de hibridación no excede 42 ° C (para evitar la fusión del complejo sonda: plantilla) y que el tampón de hibridación sumerge completamente el gel en la cámara de hibridación. La cantidad mínima de ADN genómico que proporciona telómeros detectables es 2,0-3,0 μg. Las cantidades más pequeñas de material de partida pueden resultar en una señal muy débil o nula después de la hibridación.

Este protocolo requiere 2-3 μg para cada determinación de la longitud de los telómeros. Si las muestras se van a ejecutar por duplicado o por triplicado, entonces se requieren 6-12 μg de ADN. Esto impide que Es procedimiento de ser utilizado en muestras con una cantidad limitada de ADN. El procedimiento es bastante laborioso y requiere 3-4 días para completarse. El número de muestras analizadas al mismo tiempo está limitado al número de equipos de electroforesis en gel y al tamaño del peine de gel de agarosa. Como resultado, es menos que ideal para estudios que emplean un gran número de muestras (como estudios epidemiológicos).

Las técnicas de hibridación de ADN de los telómeros separados por electroforesis en gel siguen siendo el patrón oro para determinar la longitud de los telómeros. Ningún otro procedimiento mide directamente la longitud del telómero dando como resultado el tamaño real de los telómeros.

Hay varios pasos críticos en este procedimiento. En primer lugar, la muestra de ADN debe tener buena integridad, es decir , no cortada. El ADN que se corta puede dar como resultado resultados de longitud de telómeros falsos. También es importante que las digestiones de ADN sean completas. La digestión del ADN genómico debe resultar en un frotis de ADN de 800 pb o menos"Xref"> 2. Para asegurar una digestión adecuada, algunos procedimientos han descrito un total de 6 enzimas de restricción (en lugar de sólo RsaI y Hinf1 como se describe en este procedimiento). Las enzimas de restricción adicionales incluyen HhaI, MspI, HaeIII y AluI2. Un segundo paso crítico es permitir que el gel de agarosa funcione el tiempo suficiente para obtener una separación apropiada del ADN digerido. Si hay mejor separación, entonces hay una mejor precisión en los análisis. El tiempo de ejecución del gel debe ser lo suficientemente largo para que los fragmentos de ADN que representan 1 Kbp se encuentran en la parte inferior del gel ( Figura 1 ]. Dependiendo del tamaño del gel y el voltaje de la electroforesis, esto puede requerir de 12 a 24 h. Un tercer paso crítico es la hibridación. Debe haber suficiente tampón de hibridación en el tubo de cámara para sumergir el gel completo cuando el tubo está en posición horizontal. Un nivel insuficiente de tampón de hibridación puede resultar en una hibridación desigual de la sonda telomérica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologics
Rsa1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0167S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Hinf1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0155S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071	electrophoresis grade agarose
Optikinase	affymetrix	78334X 500 UN	T4 Polynucleotide Kinase
SYBR Green Nucleic Acid Stain I	ThermoFisher Scientific	S7567	Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kB	Fisher Scientific	BP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)	Integrated DNA Technologies		Custom ordered DNA oligonucleotide
Gamma-ATP-P32	Perkin Elmer	BLU502Z	Radioisotope
Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit	Qiagen	13323	DNA extraction kit
GE Illustra Microspin G-25 column	GE Healthcare Life Sciences	27-5325-01	For purification of readioactive oligo probe
Ficoll 400			non-ionic synthetic polymer
Equipment/Software
Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)	ThermoFisher Scientific	A5	Gel electrophoresis
Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)	Corel Life Sciences	11068020	Gel electrophoresis
Nylon mesh, 50, 12" x 12"	Ted Pellam, Inc	41-12105
GE Storage Phosphor Screens	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-75
Phosphor Screen Exposure Cassette	GE Healthcare Life Sciences	63-0035-44
Isotemp Hybridzation Incubator	Fisher Scientific	13-247-20Q
Cylindrical hybridization tubes	Fisher Scientific	13-247-300
The Belly Dancer orbital shaker	Sigma-aldrich	Z768499-1EA	Orbital shaker
Typhoon 9400	ABI		For imaging of gels and phosphor screens
GraphPad Prism 6	GraphPad	Version 6.05	Graphing Program
Microsoft Excel	Microsoft	Office 365	Spreadsheet program
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrp 2000	Spectrophotometer