Summary
В этой статье обсуждается подробный протокол для количественной оценки длины теломер с использованием модифицированного терминального рестрикционного фрагмента, который обеспечивает быстрое и эффективное прямое измерение длины теломер. Этот метод может быть применен к различным клеточным источникам ДНК для количественной оценки длины теломер.
Abstract
Существует несколько различных методов измерения длины теломер, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В традиционном подходе, анализах фрагментации теломер (TRF) используется технология гибридизации ДНК, в которой образцы геномной ДНК расщепляются рестрикционными ферментами, оставляя повторные повторы ДНК теломер и некоторые суб-теломерные ДНК. Их разделяют электрофорезом в агарозном геле, переносят на фильтровальную мембрану и гибридизовывают с олигонуклеотидными зондами, меченными либо хемилюминесценцией, либо радиоактивностью, чтобы визуализировать фрагменты рестрикции теломер. Такой подход, требующий большего количества ДНК, чем другие методы, такие как ПЦР, может измерять распределение длины теломер популяции клеток и позволяет измерять, выраженные в абсолютных килобазах. Эта рукопись демонстрирует модифицированную процедуру гибридизации ДНК для определения длины теломер. Геномную ДНК сначала расщепляют рестрикционными ферментами (которые не режутТеломеры) и разделяют электрофорезом в агарозном геле. Затем гель сушат и ДНК денатурируют и гибридизуют in situ с радиоактивно меченным олигонуклеотидным зондом. Эта гибридизация in situ позволяет избежать потери ДНК теломер и улучшает интенсивность сигнала. После гибридизации гели визуализируются с использованием экранов люминофора, а длина теломера определяется количественно с помощью графической программы. Эта процедура была разработана лабораториями Drs. Вудринг Райт и Джерри Шей в Университете Техаса Юго-Западный 1 , 2 . Здесь мы приводим подробное описание этой процедуры с некоторыми изменениями.
Introduction
Теломеры, расположенные на концах хромосом, представляют собой нуклеотидные повторы последовательности TTAGGG (на человеческих хромосомах), которые играют критическую роль в защите клеточной генетической информации 3 , 4 , 5 . Теломеры составляют несколько тысяч пар оснований в длину и служат для защиты целостности остальной части хромосомы во время репликации ДНК. Репликация хромосом не идеальна, в результате чего концы хромосомы не полностью копируются. Эта неэффективность в репликации называется «проблемой конечной репликации» и приводит к потере некоторых повторов теломер в течение каждого раунда репликации 6 , 7 . Длина теломера может быть восстановлена после деления клеток теломеразой, ферментом, который заменяет потерянные последовательности теломер 8 , 9 . Теломераза, однако, неАктивируется в большинстве соматических клеток человека, и в результате со временем теломеры сокращаются, что в конечном итоге приводит к клеточному старению 10 . Из-за сокращения теломер теломеры рассматриваются как биомаркер старения и риск развития возрастных заболеваний 11 , 12 . Кроме того, на длину теломер могут влиять генетические, экологические и факторы образа жизни и другие стимулы, такие как окислительный стресс, что указывает на то, что длина теломер может играть роль биомаркера в токсикологических, эпидемиологических и поведенческих исследованиях 13 , 14 , 15 .
В этой статье демонстрируется методика измерения длины теломер с использованием модифицированного анализа терминального рестрикционного фрагмента (TRF), адаптированного из Mender и Shay 2 и Kimura et al. 16 , и аналогично Герберту, Шей и РигуHt 1 и Haussmann and Mauck 17 . Традиционно анализ TRF включает процедуру Саузерн-блоттинга. Саузерн-блоты считаются «золотым стандартом» для изучения длины теломер и активно используются для изучения длины теломер лейкоцитов в эпидемиологических исследованиях 18 . Этот анализ TRF использует переваренную геномную ДНК, остающуюся после повторов теломер. Затем фрагменты ДНК отделяют гель-электрофорезом, денатурируют и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Последовательности теломер гибридизуются с олигонуклеотидным зондом теломер. Вместо переноса отделенных теломер на мембрану другие методы TRF используют методы гибридизации в геле с денатурацией ДНК и без нее. Включение денатурации важно при рассмотрении обнаружения междоузельных теломер, о чем сообщалось у некоторых видов 19 . Процедуры, в которых отсутствуют денатурирующие шаги,Одноцепочечные выемки ДНК в концевых теломерах и не будут связываться с интерстициальными последовательностями теломер 18 .
Помимо анализа TRF, существует несколько других методов измерения длины теломер, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Метод Flow-FISH может измерять среднюю длину теломер отдельных клеток отдельного типа клеток с использованием проточной цитометрии 16 , 20 . Хотя он может точно маркировать теломеры с помощью высокоспецифических зондов и уменьшать человеческую ошибку с помощью автоматизации, Flow-FISH является дорогостоящим, менее эффективным и требует свежих образцов и высококвалифицированного техника, ограничивая его возможности для эпидемиологических исследований 16 . Кроме того, этот метод не учитывает потенциальные изменения количества хромосом в популяции клеток. Другая методика, qPCR, широко используется в качестве средства измерения длины теломер для эпидемиологических исследований 21 .
Процедура TRF имеет свои недостатки, которые ограничивают ее использование для некоторых исследований. Методы TRF требуют большого количества ДНК по сравнению с другими методами (от 2 до 3 мкг на образец). Это ограничивает применение техники для изучения длины теломер клинических образцов, для которых может быть собрана достаточная геномная ДНК и не может быть использована на деградированных образцах ДНК. Кроме того, анализ TRF является дорогостоящим и трудоемким, что требует 4-5 дней для получения результатов. Однако TRF дает низкий коэффициент дисперсииПредоставляя его воспроизводимость. Хотя этот протокол отличается от традиционного Саузерн-блоттинга (с использованием гибридизации на месте in situ), эти два метода принципиально одинаковы.
Представленная здесь методика представляет собой комбинацию Саузерн-блоттинга и in-gel-гибридизации; Связывая стадию денатурации ДНК с Саузерн-блоттингом с гибридизацией in-gel. Эта комбинация обладает дополнительным преимуществом улучшенной мощности зондирующего сигнала по сравнению с Саузерн-блоттингом и последовательно дает количественные результаты в нашей лаборатории. Кроме того, использование радиоактивных зондов, а не хемилюминесцентных зондов, дает более высокую интенсивность сигнала и позволяет визуализировать и количественно с помощью фосфоримагера, делая анализ TRF удобным для пользователя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Извлечение геномной ДНК
- Выполните экстракцию геномной ДНК из клеток (здесь, клеточная линия BJ-hTERT) для анализа с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
- Измерьте концентрацию ДНК спектрофотометром. Если концентрация ДНК составляет менее 100 мкг / мл, осадить ДНК этанолом и повторно суспендировать в объеме ТЕ-буфера (10 мМ Трис-Cl, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8,0), чтобы обеспечить концентрацию ДНК 100-600 мкг / мл).
2. Оценка целостности ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ. В этой части протокола описывается оценка целостности ДНК с использованием системы гель-электрофореза с гелем размером 11 см x 14 см. Могут также использоваться другие системы и размеры гелей, но время миграции и время миграции ДНК могут меняться.
- Подготовьте 1% агарозный гель, объединив 1 г агарозы сорта электрофореза в 100 мл 1х буфера TAE (40 мМ Trэто база; 20 мМ уксусной кислоты; 2 мМ ЭДТА; PH 8,5) и микроволновой печи до растворения агарозы и прозрачного раствора. Охлаждают раствор при комнатной температуре до достижения 50 ° C (приблизительно 15-20 минут).
- В то время как раствор агарозы охлаждается, подготовьте поддон для литья под давлением, добавив литейные концевые ворота в литейный лоток. Чтобы предотвратить утечку агарозы, охладите концевые ворота до 4 ° C перед прикреплением к литейному лотку.
- После охлаждения агарозного раствора до 50 ° С добавьте 10 мкл бромида этидия (10 мг / мл в dH 2 O) и вылейте раствор агарозы в лоток для литья геля. Добавьте гребенку в лоток для литья.
- Дайте раствору агарозы затвердеть в течение 45 мин при комнатной температуре.
- Подготовьте образцы ДНК для электрофореза путем разбавления 25 нг геномной ДНК с использованием 1х ТЕ-буфера до конечного объема 9 мкл и добавьте 1 мкл 10х Загрузочного красителя (0,25% (мас. / Об.) Бромфенолового синего, 0,25% (мас. / Об.) Ксилола Цианол FF, 30% (об. / Об.) Глицерина). Хорошо перемешать.
- Проведите миграцию ДНК при 100 В в течение приблизительно 2 ч или до тех пор, пока синий красок бромфенола не будет примерно на полпути через гель.
- Образуйте гель с помощью трансиллюминатора ультрафиолетового света или его эквивалента.
ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы ДНК с хорошей целостностью имеют полосы с высоким молекулярным весом без размытия (то есть из-за стриженной или сломанной ДНК). Если полоски ДНК размазаны, они имеют низкую целостность и не подходят для Саузерн-блот-анализа, и ДНК необходимо повторно изолировать со свежими клетками.
3. Выращивание геномной ДНК
- Выполните переваривание геномной ДНК в конечном объеме 20-40 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Объемы большеЧем 40 мкл будет переполнять лунки агарозного геля.- Объедините 3 мкг геномной ДНК и соответствующее количество 10х буфера для ДНК-анализа (поставляемого с рестрикционными ферментами), чтобы конечная концентрация составляла 1 х в микротрубке. Добавьте 1 мкл рестрикционного фермента RsaI (10000 Ед / мл) и 1 мкл рестрикционного фермента HinfI (10000 Ед / мл) в каждую пробирку. Отрегулируйте конечный объем, используя стерильный деионизированный H 2 O. Хорошо перемешайте. Центрифуга кратковременно (10 - 15 с при 16000 xg), чтобы все компоненты находились в нижней части трубки.
- Инкубируйте переваривания при 37 ° C в течение ≥16 ч. После переваривания храните переваренную ДНК при 4 ° C или -20 ° C не более чем на 2 дня при необходимости 17 .
4. Геномный ДНК-гель-электрофорез
ПРИМЕЧАНИЕ. В этой части протокола описывается процедура использования системы электрофореза в геле 20 см х 25 см. Различные гелевые электролитыМогут быть использованы несколько переменных, в том числе напряжение, время миграции и количество буфера электрофореза, добавляемого в систему, чтобы получить оптимальные результаты.
- Подготовьте 0,6% раствор агарозы, объединив 2,25 г агарозы сорта гель-электрофореза с 375 мл буфера для электрофореза либо 1x TAE, либо 0,5x TBE (110 мМ трис-основания, 90 мМ борной кислоты, 2,5 мМ ЭДТА, рН 8,3).
ПРИМЕЧАНИЕ. Для теломер менее 8000 кБ рекомендуется использовать 0,5x TBE, тогда как 1x TAE рекомендуется для теломеров от 8 000 до 20 000 кБ 1 . - Микроволновый раствор до растворения агарозы и раствор прозрачный. Дайте раствору остыть в течение 15-20 минут при комнатной температуре или до тех пор, пока агароза не достигнет 50 ° C.
- В то время как раствор агарозы охлаждают, подготовьте гель-электрофорезную систему для гелевого литья, как описано на этапе 2.2. Налейте раствор агарозного геля в лоток для литья геля. Поместите гребень вГель. Дайте гелю затвердеть в течение 45 минут при комнатной температуре.
- Подготовьте переваренные образцы ДНК для электрофореза. Для реакции 40 мкл добавьте 0,4 мкл 10-кратного загрузочного красителя в каждый образец переваренной ДНК. Кратко центрифугируйте (10-15 с, 16 000 xg), чтобы весь раствор находился на дне трубки.
- Подготовьте гель-электрофорезную систему для миграции ДНК. Удалите торцевые ворота и расческу от геля. Заполните систему электрофореза гелем 1x TAE или 0,5x TBE до линии заполнения, гарантируя, что гель полностью погружен в буфер.
- Загрузите лунки геля с образцами ДНК таким образом, чтобы между образцами была пустая лунка. Избегайте появления пузырьков или прокалывания геля. Добавьте 10 мкл ДНК-лестницы в лунки на противоположных концах геля.
ПРИМЕЧАНИЕ. Тип лестницы ДНК будет зависеть от длины теломер, которая будет варьироваться от человека к человеку и между источниками клеток. - Проведите гель-электрофорез при 150 В в течение 30 мин, чтобы быстро перемещать ДНК в гель; Затем отрегулируйте напряжение до 57 В и работайте в течение 18-24 часов.
5. Гель-флуоресцентная визуализация и гибридизация
- Через 18-24 ч выключите источник электрофореза в геле. Удалите гель для литья геля с помощью геля из буфера для электрофореза. Отрежьте верхний правый угол геля, чтобы служить в качестве ориентира для ориентации геля.
- Подготовьте кусок фильтровальной бумаги, разрезая бумагу немного больший размер, чем гель. Поместите фильтровальную бумагу поверх геля в литейный лоток и дайте бумаге впитать избыток раствора на геле. Осторожно удалите пузырьки воздуха между фильтровальной бумагой и гелем, используя пипетку в качестве ролика, чтобы выжать пузырьки по бокам.
- Удалите гель из литейного лотка, перевернув гель и фильтровальную бумагу, чтобы бумага была под гелем. Перенесите гель с фильтровальной бумагой в гелевую сушилку и накройтеГель с пластиковой пленкой. Удалите все пузырьки воздуха между пластиковой пленкой и гелем, используя пипетку в качестве ролика.
- Высушите гель в течение 2 ч при 50 ° С.
- После высыхания удалите пластиковую пленку и перенесите гель и фильтровальную бумагу в стеклянную посуду, содержащую 250 мл деионизированной воды (достаточной для покрытия гелем). Осторожно удалите фильтровальную бумагу и инкубируйте гель при комнатной температуре в течение 15 мин. Гель будет тонким, прочным и легким в обращении без разрыва.
- Приготовить 5x раствор SSC (750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия) в деионизированной воде.
- Положите гель поверх нейлоновой сетки (12 x x 12 дюймов). Сверните нейлоновую сетку и гель вместе, убедившись, что гель не контактирует с самим собой. Поместите сетку и гель в гибридизационную трубку ( например , 12 в трубке диаметром 1,5 дюйма).
ПРИМЕЧАНИЕ. При правильной прокатке гель будет контактировать с нейлоновой сеткой с обеих сторон. - Объединить 100 мл 5 × SSC и 12 мкл зеленого флуоресцентного нуклеинового ряда aЦид, и помещают в пробирку для гибридизации. Защитите раствор от света и инкубируйте в течение 30 минут при 42 ° C в гибридизационной печи с вращением.
- Удалите нейлоновую сетку / гель из трубки для гибридизации, разверните рулон и поместите в стеклянную тарелку, содержащую 250 мл деионизированной воды, и аккуратно удалите нейлоновую сетку. Образуйте гель, используя фосфоримагер. Используйте флуоресцентные настройки: 520 BP, 40 Blue и 488 нм. Установите фотоумножитель (PMT) на 375, фокусную плоскость - +3 мм, а чувствительность - на нормальную. Сохраните изображение в файл.
6. Гибридизация
- Подготовьте радиоактивный зонд теломера.
- Объединить 2 мкл (2 нг) зонда теломера (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 мкл 10х полинуклеотид-киназного реакционного буфера, 3 мкл γ- 32 P-dATP (6000 Ки / ммоль), 4 мкл T4 Полинуклеотид-киназу и без ДНКазы, стерильную деионизированную воду до конечного объема 20 мкл в микрометреПробирка с центрифугой.
Предостережение: При использовании радиоактивности следует соблюдать радиоактивные меры безопасности и правила техники безопасности.
- Объединить 2 мкл (2 нг) зонда теломера (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 мкл 10х полинуклеотид-киназного реакционного буфера, 3 мкл γ- 32 P-dATP (6000 Ки / ммоль), 4 мкл T4 Полинуклеотид-киназу и без ДНКазы, стерильную деионизированную воду до конечного объема 20 мкл в микрометреПробирка с центрифугой.
- Кратко центрифугируют (10-30 с при 16000 × g) и инкубируют в водяной бане при 37 ° C в течение 1 часа. Центрифугируют в течение 10-30 с при 16000 × g и инкубируют при 65 ° C в течение 20 минут, чтобы остановить реакцию.
- Используя колонку микроспина хроматографии G-25, смешайте содержимое колонны путем встряхивания, затем центрифугируйте в течение 1 мин при 700 × g при комнатной температуре. Откажитесь от фильтрата.
- Загрузите раствор радиоактивного зонда в колонку для хроматографии G-25 и центрифугируйте в течение 2 минут при 700 × g. Сохраните фильтрат.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраните фильтрат, так как в нем содержится радиоактивный зонд-теломер. При необходимости радиоактивный зонд можно хранить при температуре 4 ° C. - Подготовьте 250 мл денатурирующего раствора, состоящего из 1,5 М NaCl и 0,5 М NaOH в стерильной деионизированной воде.
- Поместите гель в стеклянную чашку, содержащую 250 мл денатурирующего раствора и инкубатораВ течение 15 мин при комнатной температуре. Удалите денатурирующий раствор и замените 250 мл стерильной деионизированной воды. Инкубируйте в течение 10 мин на орбитальном шейкере (40-50 об / мин) при комнатной температуре.
- Подготовьте 250 мл нейтрализующего раствора, состоящего из 1,5 NaCl и 0,5 М Трис-хлористоводородной кислоты, рН 8,0 в стерильной деионизированной воде.
- Удалите деионизированную воду и замените 250 мл нейтрализационного раствора и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Во время инкубации в нейтрализующем растворе готовят 50 мл раствора для гибридизации, состоящего из 5 × SSC, 5 × раствора Денхардта (0,1% неионного синтетического полимера, 0,1% поливинилпирролидина, 0,1% бычьего сывороточного альбумина), 10 мМ динатрийфосфата (Na 2 HPO 4 ) и 1 мМ тетрафосфата натрия пирофосфата (Na 4 P 2 O 7 · 10 H 2 O) в стерильной деионизированной воде.
- Сверните гель в нейлоновой сетке и поместите в гибридизационную трубку (шаг5.7). Добавить 20 мл раствора для гибридизации и инкубировать в печи для гибридизации при 42 ° C в течение 10 минут с вращением.
- Удалите раствор гибридизации и замените 20 мл свежего раствора для гибридизации. Добавьте полностью зонд теломера и инкубируйте в печи для гибридизации при 42 ° C в течение ночи с вращением.
7. Гель-мытье, экспозиция с использованием фосфорного экрана и радиоизображение
- Подготовить 500 мл 2x SSC раствора (300 мМ NaCl, 30 мМ цитрата натрия) в стерильной деионизированной воде.
- Подготовьте 250 мл 0,1х SSC (15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрата натрия) и 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) в деионизированной воде.
- Удалите гель и сетку из трубки для гибридизации и поместите в стеклянную чашку, содержащую 250 мл 2x SSC. Разверните и удалите нейлоновую сетку с тарелки. Поместите стеклянную чашку на орбитальный шейкер и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Удалите 2x SSC и замените 250 мл 0.1x SSC и 0.1% SDS, и инкубировать в течение 15 мин на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
- Во время инкубации выведите экран Phosphor на ластик изображения в течение 15 минут.
- Удалите 0.1x SSC и 0,1% раствор SDS и замените 250 мл 2x SSC. Инкубируйте 15 минут на орбитальном шейкере.
- Удалите гель из раствора 2 SSC и либо заверните гель в пластиковую пленку, либо положите в термоусадочный чехол. Удалите все пузырьки и воздушные карманы между гелем и пластиковой пленкой или пластиковым пакетом. Поместите гель в кассету экспозиции с помощью экрана Phopshor. Разогреть экран Фосфора на геле в течение ночи.
- Изобразите выставленный экран Фосфора, используя фосфоример.
8. Количественная длина тела
- Откройте файл фосфоримагера, содержащий флуоресцентное изображение зеленого флуоресцентного геля, окрашенного нуклеиновой кислотой ( рисунок 1 ).
- Выберите «Инструменты», а затем «Расстояние по пикселям»9 ;. Используя мышь, нарисуйте линию от нижней части геля до середины первой полосы маркера и запишите расстояние. Повторите эту процедуру для каждого диапазона маркеров ( рисунок 2 ). Эти расстояния будут использоваться в графической программе, как описано ниже.
- Откройте фосфоримацию радиоактивно меченного геля ( рис. 3 ). Выберите «Диспетчер объектов», а затем «Сетка». Установите сетку в 1 столбец и 150 строк. Отрегулируйте сетку так, чтобы она простиралась от верхней части геля до нижней части геля. Отрегулируйте ширину сетки равной ширине полосы, щелкнув по краю сетки и перетянув ширину сетки, чтобы она была равна ширине полосы.
- Скопируйте эту сетку (чтобы ширина и высота ящиков остались прежними) и переместите вторую сетку на пустую дорожку (для фоновых целей). Продолжайте копировать и перемещать дополнительные сетки для дополнительных выборочных дорожек.
ПРИМЕЧАНИЕ. Когда закончите, должно бытьСетки для каждой полосы выборки и одна сетка пустой полосы для фона ( рисунок 4 ). - Выберите «Анализ», а затем «Объемный отчет». Выберите все сетки для отчета. После отображения отчета по объему дважды щелкните отчет, чтобы активировать электронную таблицу. Сохраните файл электронной таблицы. Данные для этого файла будут Под полосой «Том».
- Откройте соответствующую графическую программу и создайте новые данные и таблицу. Выберите «Y: введите и постройте одно значение Y для каждой точки», затем выберите «Создать».
- Обозначьте первый столбец (Столбец X) как «Измеренное расстояние» и пометьте второй столбец (Столбец Y) как «Молекулярный вес». Введите молекулярные массы маркера каждой маркерной полосы в столбце Y. Введите расстояния миграции, полученные на шаге 8.2, соответствующие каждому маркеру молекулярной массы.
- Перейдите в «Анализ» и выберите «Анализ», а затем «Нелинейная регрессия»On (curve fit) "и выберите 'OK'. На следующем экране выберите «Экспоненциальный», а затем «Один фазовый распад». Выберите вкладку «Диапазон» и введите «150» в «количестве точек, определяющих кривую», и отметьте «Создать таблицу координат XY для экспорта или копирования кривой в другую программу».
ПРИМЕЧАНИЕ. Результат «нелинейное соответствие данных 1» содержит молекулярную массу для каждого расстояния в Y-строке. - Для анализа выборочных полос выберите область анализа, которая находится выше и ниже фактических полос теломера. Не используйте всю длину полосы ( рисунок 5 ). Определите места сетки для области анализа каждой полосы.
- Выберите «Файл», «Создать» «Создать новую таблицу и график». Выберите «Y: введите и постройте одно значение Y для каждой точки», затем выберите «Создать». Копирование и вставка значений громкости фоновой полосы (значений интенсивности) из файла электронной таблицыВ первый столбец (X) и значения объема (значения интенсивности) из полосы выборки в первый столбец Y. Если имеется несколько выборочных дорожек, скопируйте каждый набор значений объема из файла электронной таблицы в дополнительные столбцы Y в программе графического отображения файл.
- Удалите значения из столбца фона (X) и каждой выборки (Y), которые находятся за пределами областей анализа, определенных на шаге 8.8.
ПРИМЕЧАНИЕ. Таблица данных должна содержать только значения в тех местах сетки, которые соответствуют областям анализа. - Выберите «Анализ», затем «Анализ» и «Преобразование». Нажмите «ОК». Выберите «Преобразовать значения Y с помощью Y = YX». Это преобразует данные в Data 2 (преобразованное значение интенсивности (Y) = интенсивность образца (Y) - интенсивность фона (X)).
- Выберите «Анализ», затем «Анализ», «Анализ столбцов» и «Статистика столбцов». Выберите ОК. Вкладка «Col. Показаны данные Transform of Data 2 'В строке «Сумма», Σ (Int i ).
- Выберите «Файл», «Создать», «Создать новую таблицу и график». Выберите «Y: введите и постройте одно значение Y для каждой точки», затем выберите «Создать». Скопируйте и вставьте данные столбца Y с страницы результатов «Нейлин-подгонка данных 1, кривая» в новый столбец X. Скопируйте и вставьте данные столбца Y из страницы результатов «Преобразование данных 2» в новый столбец Y. Выберите «Анализ», затем «Анализ» и «Преобразование». Нажмите «ОК». Выберите «Преобразовать значения Y с помощью Y = Y / X».
- Выберите «Анализ», затем «Анализ», «Анализ столбцов» и «Статистика столбцов». Выберите ОК. Вкладка «Col. Статистика Transform of Data 3 'отображается в строке «Sum», Σ (Int i / MW i ). MW = молекулярная масса.
- Чтобы вычислить среднюю длину теломера (TL) для каждого образца, используйтеФормула TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были проанализированы три концентрации ДНК (1, 2 и 3 мкг), выделенные из клеточной линии BJ-hTERT (теломераза, иммортализованные фибробласты крайней плоти человека) 22 и мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) для длины теломер. В таблице 1 показаны назначения полосы для каждого образца ДНК. На фиг.1 показано флуоресцентное пятно нуклеиновой кислоты геля. Стандарты молекулярной массы хорошо видны. Определяли расстояние от вершины геля до каждого стандарта молекулярной массы ( рис. 2 ). На рисунке 3 показано фосфоримация геля после гибридизации с зондом теломера. Полосы теломер показаны как мазки в каждой полосе. Для каждой полосы и одной фоновой полосы рассчитаны сетки из 150 коробок ( рис. 4 ). Области анализа, соответствующие областямГель, содержащий полосы теломера для каждого набора образцов, показан на рисунке 5 . Отдельные фоновые полосы были выбраны для каждого набора выборок, чтобы гарантировать, что интенсивности фона были одинаковыми для каждого набора образцов (полосы, обозначенные буквой B на рисунке 5 ). В таблице 2 показаны длины фрагментов рестрикции теломера для каждого образца. Средняя длина теломер в увековеченной клеточной линии hTERT (BJ-hTERT) выше, чем в человеческих РВМС (сравните дорожки 2, 4 и 6 с дорожками 10, 12 и 14 на рисунке 3 ). Эти результаты также показывают, что количество анализируемой геномной ДНК в каждой полосе имеет решающее значение для получения детектируемого сигнала после гибридизации. Для образцов с теломерами, которые являются довольно однородными ( т. Е. Клеточная линия BJ-hTERT) всего лишь 1 мкг, можно было обнаружить с помощью этой процедуры (хотя сигнал был очень слабым). Однако для образцов с теломерами, которые имеютБолее высокая дисперсия ( т. Е. Человеческие РВМС), минимальное количество ДНК, обеспечивающее надежный сигнал, составляет 2 мкг.
Рисунок 1 : Зеленый флуоресцентный нуклеиновой кислоты, окрашенный гель. Фосфорирование высушенного агарозного геля, окрашенного зеленым флуоресцентным окрашиванием нуклеиновой кислотой, показывающее расположение ленточных лестниц ДНК (дорожки 1 и 8). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Определение расстояния миграции маркерной полосы . Синие стрелки указывают расстояние, измеренное от верхней части геля до eaCh DNA ladder band. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Фосфоримация образцов ДНК, пробитых зондом Telomere. Дорожки 2, 4 и 6 содержат ДНК BJ-hTERT (1, 2 и 3 мкг соответственно). Дорожки 10, 12 и 14 содержат ДНК PBMC человека (1, 2 и 3 мкг, соответственно). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Расположение сетки. Скриншот, показывающий местоположение150 подсчетов для каждой анализируемой полосы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5 : Области анализа. Фосфоримация полос теломер, показывающая выбранные области анализа для каждого набора образцов. Дорожки 2, 4 и 6 содержат ДНК BJ-hTERT; Дорожки 10, 12 и 14 содержат ДНК PBMC человека. B = фоновые полосы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| полоса дороги | Образец |
| 1 | Лендер ДНК |
| 2 | BJ-hTERT 1 &# 181; г |
| 3 | пустой |
| 4 | BJ-hTERT 2 мкг |
| 5 | пустой |
| 6 | BJ-hTERT 3 мкг |
| 7 | пустой |
| 8 | Лендер ДНК |
| 9 | пустой |
| 10 | РВМС 1 мкг |
| 11 | пустой |
| 12 | РВМС 2 мкг |
| 13 | пустой |
| 14 | РВМС 3 мкг |
| Образцы ДНК, разделенные на 0,6% агарозном геле |
Таблица 1: Назначение образцов ДНК-агарозы.
| Образец (дорожка) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Средняя длина теламера = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | 268691 | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416337 | -142585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286653 | 62845 | 4,561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524123 | 3,586944286 |
Таблица 2: Средние расчеты длины теломера,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После электрофореза геномный ДНК-мазок выше 800 пар оснований. Это может произойти, если рестрикционные ферменты являются дефектными или необходимы дополнительные ферменты (как описано выше). Второе возможное объяснение состоит в том, что белок все еще прикреплен к ДНК. При определении концентрации ДНК спектрофотометром отношение 260/280 должно составлять около 1,8. Если это соотношение <1,5, существует белковое загрязнение, которое может препятствовать перевариванию рестрикционного фермента. Либо образец ДНК должен быть повторно изолирован, либо белок нужно удалить с помощью переваривания протеиназы K и экстракции фенолом: хлороформом с последующим осаждением этанолом. Использование коммерческого набора для изоляции ДНК обычно приводит к ДНК с соотношением 260/280 1,8-1,85.
После воздействия геля на экран люминофора не обнаруживаются фрагменты теломер. Это может быть результатом плохого радиомаркированного зонда теломеры, неправильной гибридизацииИли недостаточное количество исходной геномной ДНК. При приготовлении зонда теломера, в конце центрифугирования колонки G-25, должна быть легко обнаруживаемая радиоактивность в проточном (представляющем собой радиомаркированный зонд теломера). Если радиоактивность не обнаружена, возникла проблема с приготовлением зонда. Также важно обеспечить, чтобы температура гибридизации не превышала 42 ° C (чтобы предотвратить плавление комплекса зонд: шаблон) и что гибридизационный буфер полностью погружает гель в камеру гибридизации. Минимальное количество геномной ДНК, которая обеспечивает обнаруживаемые теломеры, составляет 2,0-3,0 мкг. Меньшее количество исходного материала может привести к очень слабому отсутствию сигнала после гибридизации.
Этот протокол требует 2-3 мкг для каждого определения длины теломер. Если образцы должны быть запущены в двух или трех экземплярах, то требуется 6-12 мкг ДНК. Это предотвращает Процедура используется для образцов с ограниченным количеством ДНК. Процедура довольно трудоемкая, требующая 3-4 дней для завершения. Количество анализируемых образцов за один раз ограничивается количеством установок для электрофореза в геле и размером гребня агарозного геля. В результате он менее идеален для исследований с использованием большого количества образцов (таких как эпидемиологические исследования).
Методы гибридизации ДНК теломер, разделенных гель-электрофорезом, остаются золотым стандартом для определения длины теломер. Никакая другая процедура напрямую не измеряет длину теломер, что приводит к фактическим размерам теломер.
В этой процедуре есть несколько важных шагов. Во-первых, образец ДНК должен иметь хорошую целостность, т. Е. Не разрушать. Разрушенная ДНК может привести к ложным результатам длины теломер. Также важно, чтобы переваривание ДНК было полным. Переваривание геномной ДНК должно приводить к разложению ДНК размером 800 п.о. или менее"Xref"> 2. Для обеспечения правильного пищеварения некоторые процедуры описали в общей сложности 6 рестрикционных ферментов (а не только RsaI и Hinf1, как описано в этой процедуре). Дополнительные рестрикционные ферменты включают HhaI, MspI, HaeIII и AluI 2 . Второй критический шаг позволяет агарозному гелю работать достаточно долго, чтобы обеспечить надлежащее отделение переваренной ДНК. Если есть лучшее разделение, то в анализах есть более высокая точность. Время запуска геля должно быть достаточно большим, чтобы фрагменты ДНК, составляющие 1 Kbp, располагались на дне геля ( рис. 1 ). В зависимости от размера геля и напряжения электрофореза это может потребовать от 12 до 24 часов. Третий критический шаг - это гибридизация. В трубке камеры должен быть достаточный буфер для гибридизации, чтобы погружать весь гель, когда трубка горизонтальна. Недостаточные уровни буфера для гибридизации могут приводить к неравномерной гибридизации зонда теломера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку Университета Питтсбургского института рака по биобезопасной онкологии, которая частично поддерживается наградой P30CA047904.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
