High Fat Diet utfodring och hög genomströmning Triacylglyceride test på Drosophila Melanogaster
Summary
Detta är en hög fett diet utfodring protokoll för att inducera fetma i Drosophila, en modell för förståelse grundläggande molekylära mekanismer involverade i lipotoxicitet. Det ger också en hög genomströmning triacylglyceride test för att mäta fettansamling i Drosophila och eventuellt andra (insekt) modeller under olika kostvanor, miljö, genetiska eller fysiologiska förhållanden.
Abstract
Hjärtsjukdom är den främsta dödsorsaken i mänskliga världen. Många studier har visat starka kopplingar mellan fetma och hjärt fel hos människa, men fler verktyg och forskningsansträngningar behövs för att bättre belysa mekanismerna som är involverade. För över ett århundrade har har Drosophila genetiskt mycket lätthanterlig modell varit avgörande för upptäckten av viktiga gener och molekylära vägar som visat sig vara starkt konservativa mellan arter. Många biologiska processer och sjukdomsmekanismerna är funktionellt bevarad i flugan, som utveckling (t.ex., kroppen planen, hjärta), cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Nyligen, studier av fetma och sekundära sjukdomar, såsom hjärtsjukdom i modellorganismer, spelat en mycket viktig roll i identifiering av viktiga regulatorer inblandade i metabola syndromet hos människor.
Här föreslår vi att använda denna modellorganism som ett effektivt verktyg att inducera fetma, dvs, överdriven ansamling av fett, och utveckla ett effektivt protokoll för att övervaka fetthalten i form av Taggar ackumulering. Förutom den mycket bevarat, men mindre komplexa genomet har flugan också en kort livslängd för snabba experiment, med kostnadseffektivitet. Detta dokument innehåller ett detaljerat protokoll för hög fett Diet (HFD) utfodring i Drosophila att inducera fetma och en hög genomströmning triacylglyceride (TAG) test för att mäta den tillhörande ökningen av fetthalten, med målet att vara mycket reproducerbara och effektivt för storskalig genetisk eller kemisk undersökning. Dessa protokoll ger nya möjligheter att effektivt utreda reglerande mekanismer som är involverade i fetma, samt ger en standardiserad plattform för läkemedelsforskning upptäckten för snabb testning av effekten av läkemedelskandidater på utveckling eller förebyggande av fetma, diabetes och metabola sjukdomar.
Introduction
Vi är i en tid där fetma och dess associerade ekonomiska bördor, är ett världsomspännande problem1. Två av varje tre amerikaner är överviktiga eller feta med relaterade hjärtat patologier, den primära dödsorsaken inom den vuxna befolkning2. Nya effektiva metoder behövs för att på lämpligt sätt undersöka de genetiska och molekylära komponenter inblandade i regleringen av metabola syndromet med modellorganismer. Därför väljer vi bananflugan Drosophila modellen eftersom den delar de mest grundläggande biologiska processerna med däggdjur, inklusive möss och människor3,4,5,6. Drosophilagenomet är mycket bevarade under evolutionen men totalt sett mycket mindre med mindre genen dubbelarbete och metabola komplexitet, vilket gör den idealisk för att förstå de grundläggande mekanismerna inblandad i många mänskliga sjukdomar4 , 7 , 8. Dessutom karakteristiska processer som utförs av fettvävnad, tarmen och bukspottkörteln är representerade i flugan och medla tillsynsuppdrag på glukos och lipid metabolism, exempelvis som liknar människor9, 10,11. Dessutom är de grundläggande molekylära vägarna som är involverad i kontrollen av övervikt, insulinresistens och diabetes hos människa funktionellt bevarad i Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. som högre organismer, Drosophila har ett hjärta som bildas under utvecklingen av liknande processer som av däggdjur hjärtat3,17. Således utvecklingen av en tillförlitlig HFD utfodring protokoll och hög genomströmning TAG assay, anpassad för effektiv screening ändamål använda den genetiska verktygslådan av Drosophila, ge ett viktigt sätt att studera och förstå den grundläggande genetiska grunden underliggande komplexa metabola sjukdomar.
Själva HFD maten görs från en standard laboratorium flyga mat kompletteras med kokosolja, som består främst av mättade fettsyror som förknippas med metabola syndromet18. Även inducera fetma hos däggdjur modeller, såsom gnagare, kan ta månader19,20, ökar vår optimerade HFD utfodring protokoll i Drosophila effektivt och reproducibly organismers fetthalten i en fråga om dagar12,14. Detta protokoll, tillåter i samband med en hög genomströmning TAG assay, effektiv massa screening för effekterna av genetiska faktorer, påverkan och läkemedelskandidater att upptäcka nya modulatorer av fettförbränningen. Följaktligen, protokollen sannolikt relevanta att förstå eller bekämpa fetma och övervikt-associerade mänskliga sjukdomar.
Protokollet utfodring är mångsidig och kan användas för att studera de metabola och funktionella effekterna av enda mättade eller omättade fettsyror. Användning av denna hög genomströmning TAG analys är inte begränsat till D. melanogaster, men får anpassas till en mängd små modellorganismer med nagelband eller tuffa extracellulära matriser (t.ex., andra Drosophila -arter, C. elegans och andra framväxande ryggradslösa modellorganismer) att mäta fetthalt under olika miljömässiga, genetiska eller fysiologiska förhållanden, i något skede av utveckling, vuxenlivet eller fas av metabola sjukdomar. TAG analysen baseras på en kolorimetrisk mätning av en serie enzymatiska reaktioner som försämrar taggarna till fria fettsyror, glycerol, Glycerol 3-fosfat och slutligen H2O2 som reagerar med 4-aminoantipyrin (4-AAP) och 3,5- diklor-2-hydroxibensen sulfonat (3,5 DHBS) att producera en röd färgad produkt som mäts med 96 brunnar spektrofotometer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fetma induktion hos möss kan ta månader19,20. I flugor tillåter denna HFD utfodring protokoll för induktion av överskjutande fettansamling i några dagar eller mindre, vilket medför ökade ansamling av fett endast efter 18 h (se figur 2). HFD utfodring med protokollet beskrivs ökar glukos content 12 och minskar Bmm lipas och PGC-1 uttryck24. Detta är i motsats till fast…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Erika Taylor för redigering Detta manuskript. Detta arbete har finansierats genom anslag från National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 och R01 HL054732) att R.B., postdoktorala forskning tillägg (R01 HL085481) och en gemenskap (AAUW) till S.B.D. och bidrag från American Heart Association till S.B.D. och R.T.B.
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
Riferimenti
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetica. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
