Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ripiegare un dominio di legame del ligando chemocettore dai corpi di inclusione e purificarlo per l'uso in studi strutturali e funzionali. Per stabilire quali segnali invia un chemocettore batterico e come, è possibile utilizzare i domini di legame del ligando isolati per lo screening di piccole librerie di molecole o per determinare la struttura con e senza ligando. L'espressione del dominio di legame del ligando extracellulare in E.coli spesso provoca la deposizione nei corpi di inclusione.

Qui, mostriamo come quantità di milligrammi di proteina funzionale può essere recuperata dai corpi di inclusione. Per iniziare, inoculare 150 mL di brodo LB sterile contenente 50 microgrammi per mL di ampicillina con cellule RIPL BL21-CodonPlus trasformate con il vettore D-TOPO pET151 per l'espressione dell'esaistidina TIp3-LBD. Incubare la coltura a 200 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte.

Preparare sei fiasche di Erlenmeyer da 2 litri contenenti 800 ml di brodo sterile per libbra e 50 microgrammi per ml di ampicillina. Inoculare in ogni pallone 20 ml di coltura notturna. Incubare i palloni a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 200 giri/min fino a quando l'OD600 raggiunge 0,6.

A questo punto, indurre l'espressione proteica aggiungendo 1 millimolare di IPTG a ciascun pallone. Continuare a incubare i palloni a 37 gradi Celsius in un agitatore a 200 giri/min per altre quattro ore. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5000 xg e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi, scartare il surnatante. Trasferire tutti i pellet cellulari in un becher da 250 mL e aggiungere 100 mL di Buffer A.Se congelato, lasciare scongelare completamente le cellule e quindi risospendere il pellet. Conservare il campione sul ghiaccio se non diversamente indicato.

Successivamente, passare tre volte le cellule risospese attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione per lisare le cellule e garantire il taglio completo del DNA genomico. Quindi, centrifugare il lisato a 10.000 xg e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Raccogliere un campione da un ml del surnatante e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per la successiva analisi SDS-PAGE.

Quindi, scartare il resto del surnatante e mettere il pellet sul ghiaccio. Successivamente, risospendere accuratamente il pellet dei corpi di inclusione in 20 mL di tampone B ghiacciato. Agitare il campione per uno o due minuti per facilitare la risospensione.

Dopo aver centrifugato il campione, risospendere accuratamente il pellet in 20 mL di tampone B ghiacciato agitando prima la provetta per uno o due minuti. Assicurarsi che il pellet sia rotto in piccoli pezzi. Quindi, pipettare il campione su e giù per risospenderlo.

Centrifugare il campione come prima ed eliminare il surnatante. Se il surnatante è torbido o colorato, centrifugare nuovamente il campione e utilizzare un ulteriore tampone B ghiacciato per risospenderlo. Ripetere la centrifugazione e la risospensione fino a quando il surnatante è limpido e incolore prima di pellettare nuovamente.

Aggiungere 20 ml di tampone C ghiacciato al pellet e risospenderlo facendo vorticare la provetta per uno o due minuti. Quindi, dopo aver centrifugato il campione, aggiungere 25 mL di tampone Denaturante ghiacciato D.Risospendere accuratamente il pellet dei corpi di inclusione facendo roteare la provetta per uno o due minuti o fino a quando il pellet non si rompe in piccoli pezzi. Miscelare le sospensioni mediante rotazione assiale a 30 giri/min e 4 gradi Celsius per 30-120 minuti.

Chiarificare la soluzione proteica denaturata mediante centrifugazione a 30.000 xg e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, posizionare il surnatante sul ghiaccio e scartare il pellet. Mentre si mescolano 250 mL di Buffer E a 500 giri/min, aggiungere 60 milligrammi di miscela proteica denaturata contenente esaistadina TIp3-LBD.

Incubare la miscela di ripiegamento a quattro gradi Celsius mescolando continuamente a 500 giri/min per 24-48 ore. La concentrazione proteica finale è di 0,2 mg per ml. Dopo aver preparato sette litri di tampone A pre-raffreddato e tubo per dialisi secondo il protocollo di testo, utilizzare la chiusura del tubo per dialisi per bloccare un'estremità della membrana per dialisi e trasferire la miscela per dialisi nel tubo.

Quindi, bloccare l'estremità aperta e assicurarsi che non vi siano perdite. Posizionare il tubo per dialisi in un secchio per dialisi con il tampone A.Quindi, aggiungere un'ancoretta magnetica, assicurandosi che non tocchi il tubo per dialisi durante l'agitazione. Dializzare il campione a quattro gradi Celsius agitando continuamente a 500 giri/min e sostituire il tampone almeno quattro volte nell'arco di 12 ore.

Dopo l'ultima sostituzione del tampone, lasciare il campione a dializzare per una notte. La mattina seguente, rimuovere la provetta per dialisi dal secchio e trasferirne il contenuto in un becher da 500 ml. Conservare la soluzione proteica in ghiaccio se non diversamente indicato.

Filtrare la soluzione proteica attraverso una membrana delle dimensioni di un poro di 0,43 micron in un flacone di vetro da 500 ml per rimuovere qualsiasi proteina precipitata. Dopo aver lavato, caricato ed equilibrato una colonna chelante secondo il protocollo di testo, regolare il campione proteico ripiegato ottenuto in base alla composizione del tampone F aggiungendo 25 mL di cloruro di sodio 5 M, 2,5 mL di tris-HCl 1 M, pH 8,0 e 2,5 mL di soluzioni madre di imidazolo 2 M. Caricare il campione sulla colonna a una velocità di 5 mL al minuto o meno ed eliminare il flusso che contiene le proteine non legate.

Quindi, lavare la colonna con 50-100 mL di tampone F per rimuovere le proteine non specificamente legate ed eliminare il flusso. Eluire l'esaistadina TIp3-LBD con 25 mL di tampone G.Quindi, raggruppare le frazioni a flusso continuo contenenti la proteina. Dopo aver preparato il tampone H e il tubo per dialisi secondo il protocollo di testo, aggiungere la proteasi TEV marcata con esaistadina alla proteina marcata con esaistadina nel tubo.

Aggiungere un rapporto molare finale di un TEV per otto di proteine. Posizionare la provetta per dialisi bloccata nei quattro L di tampone H pre-raffreddato e incubarla a quattro gradi Celsius mescolando continuamente per due ore. Quindi, cambiare il tampone e continuare la dialisi durante la notte per consentire il completamento della reazione di scissione mediata da TEV.

Dopo la sostituzione con il tampone I, il filtraggio della soluzione proteica e la regolazione del campione, caricare il campione su una colonna HP chelante HiTrap da cinque mL preparata. A una velocità di flusso di cinque mL al minuto, raccogliere il flusso che contiene il TIp3-LBD non etichettato. Sulla proteina scissata, il tag esaistadina scissa e l'esaistadina TEV vengono trattenuti dalla colonna.

Utilizzare cinque mL di tampone F per lavare la colonna in modo da consentire alla proteina non marcata di fluire e raccogliere l'eluato. Quindi, dopo aver bilanciato una colonna di esclusione dimensionale e aver concentrato e chiarificato il campione proteico secondo il protocollo di testo, caricare il campione sulla colonna di filtrazione su gel pre-bilanciata 26/60. Applicare il tampone A a una velocità di flusso di quattro ml al minuto e monitorare la traccia UV per l'eluizione delle proteine.

TIp3-LBD eluisce a un volume di ritenzione compreso tra 210 e 220 mL. Infine, dopo la cromatografia, raggruppare le frazioni, quindi misurare la concentrazione proteica ed eseguire SDS-PAGE. La procedura di isolamento delle proteine dimostrata in questo video ha prodotto da 10 a 20 mg di TIp3-LBD puro non marcato per un litro di coltura batterica.

Come si vede qui, la proteina eluita dalla colonna di filtrazione su gel ha un singolo picco simmetrico, corrispondente a un volume di ritenzione di 220 mL con un peso molecolare calcolato di 29 kDa. Come mostrato qui da SDS-PAGE, i corpi di inclusione contenevano prevalentemente esaistadina TIp3-LBD con un peso molecolare apparente di 28 kDa, che è vicino al valore calcolato dalla sequenza di amminoacidi di 31,8 kDa. Le fasi di rimozione delle etichette esaistadina, cromatografia di affinità e filtrazione su gel hanno prodotto proteine altamente pure.

La spettroscopia CD con CDSSTR ha rivelato che la struttura secondaria dell'esaistidina TIp3-LBD era costituita dal 31% di alfa-elica e dal 23% di beta-foglio. Questi erano anche vicini ai valori previsti del 37% e del 26% rispettivamente dall'analisi delle sequenze utilizzando il server JPred 3. Questo protocollo richiede un minimo di cinque giorni dall'inizio alla fine e può essere messo in pausa, se necessario, in tre diverse fasi.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la risospensione completa e completa dei corpi di inclusione nel tampone di denaturazione mediante vortice o pipettaggio su e giù è fondamentale per l'intera realizzazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando del chemocettore TIp3. La proteina purificata può essere utilizzata per legare gli acidi per studiare la specificità del ligando per questo recettore.

Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina ottenuta con questa procedura potrebbe essere utilizzata per produrre cristalli altamente ordinati, e questo ha aperto la strada agli studi delle basi strutturali per la sua specificità ligando. Questa procedura potrebbe essere generalmente utile per la produzione di quantità mg di chemocettori da altri batteri in forma cristallizzabile e solubile. Abbiamo utilizzato questo protocollo nella sua forma originale o leggermente modificata per ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando di altri chemocettori di questo tipo per studi cristallografici.

Si ricorda che in ogni singolo caso sarà probabilmente necessaria l'ottimizzazione del protocollo, ad esempio la composizione dei tamponi di denaturazione e ripiegamento e i tempi di incubazione.