Name: Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Impara il metodo per ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando del chemocettore Tlp3 di Campylobacter jejuni dai corpi di inclusione. Questo protocollo permette di ottenere quantità di proteina funzionale per studi strutturali e screening.

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Ringraziamo Yu C. Liu per i suoi primi lavori sulla produzione Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca è in debito con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS per una borsa di dottorato.

1. espressione dei suoi6-Tlp3-LBD in e. coli
<ol><li>Inoculare 150 mL di brodo di Luria-Bertani (LB) sterile contenente 50 µ g ampicillina di-1 mL con Plus-codone-BL21 (DE3) - cellule RIPL trasformate con il vettore di pET151/D-TOPO per l'espressione della sua6- Tlp3-LBD (residui dell'amminoacido 42-291), e Incubare a 37 ° C in un agitatore (diametro orbita, 25 mm) con 200 giri/min durante la notte.</li>
	<li>Preparare sei matracci di Erlenmeyer 2L contenente 800 mL di brodo LB sterile e 50 µ g mL-1 ampicillina. Inoculare ciascuna beuta con 20 mL della coltura durante la notte ottenuta dal punto 1.1. Li Incubare a 37 ° C con agitazione continua a 200 giri/min fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge 0,6.</li>
	<li>Prendere un 1 mL aliquota da uno dei palloni (campione di controllo uninduced), pellet utilizzando una centrifuga da banco (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) e scartare il surnatante. Conservare il pellet batterico a-20 ° C per la successiva analisi di SDS-PAGE.</li>
	<li>Indurre l'espressione della proteina aggiungendo 1 mM di isopropile β-D-thiogalactoside (IPTG) per ciascuna beuta con la cultura. Continuano le beute a 37 ° C in un agitatore a 200 giri/min per ulteriori 4 h di incubazione.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Nota: A questo punto, la procedura può essere sospesa inserendo il pellet cellulare in un congelatore-80 ° C per la conservazione.</li>
</ol>2. isolamento e denaturazione dei corpi di inclusione
<ol><li>Trasferire tutti i pellet cellulare ottenuti al passaggio 1.5 in un becher da 250 mL e aggiungere 100 mL di tampone A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Permettono alle cellule di scongelare completamente (se congelati) e risospendere il pellet. Mantenere il campione sul ghiaccio a meno che non diversamente indicato.</li>
	<li>Passare tre volte le cellule sedimento attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione per lisare le cellule e garantire la tosatura completa del DNA genomic.</li>
	<li>Centrifugare il lisato a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C. Raccogliere un campione di 1 mL del surnatante (frazione solubile) e conservare a-20 ° C per la successiva analisi di SDS-PAGE. Scartare il resto del surnatante e mettere la pallina sul ghiaccio. Nota: Questa pallina è di colore bianco (facilmente distinguibili dalle cellule ininterrotte che sono colore marrone a colori) e contiene i corpi di inclusione.</li>
	<li>Risospendere il pellet di corpi di inclusione accuratamente in 20 mL di tampone ghiacciata B (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 0,2 mM fenilmetanosolfonil fluoruro (PMSF), 1% Triton X-100). Questo facilita la solubilizzazione della membrana e proteine di membrana. Vortexare per 1-2 min aiutare la risospensione.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere accuratamente in 20 mL di tampone ghiacciata B nel Vortex il tubo per 1-2 min. Accertarsi che il pellet è suddiviso in piccoli pezzi. Dispensare il campione su e giù per aiutare la risospensione del pellet. Nota: È importante Risospendere accuratamente per ottenere corpi di inclusione esenti da impurità.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.5. Se il supernatante è torbida o colorata, ripetere i passaggi da 2.6 e 2.5 (in questo ordine) fino a quando il surnatante è limpida e incolore.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 20 mL di tampone ghiacciata C (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 0,2 mM PMSF) nel Vortex il tubo per 1-2 min.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.5.</li>
	<li>Aggiungere 25 mL di tampone di denaturazione ghiacciata D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, urea 8 M, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) per sciogliere il precipitato di corpi di inclusione. Risospendere accuratamente nel Vortex per 1-2 minuti, o fino a quando la pallina è rotto in piccoli pezzi.</li>
	<li>Mescolare la sospensione di rotazione assiale con un tasso di rotazione di 30 rpm per 30-120 min a 4 ° C.</li>
	<li>Chiarire la soluzione di proteina denaturata mediante centrifugazione a 30.000 x g, 4 ° C per 30 minuti, mettere il sopranatante sul ghiaccio e scartare il pellet.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina usando l'analisi di Bradford. 24 prendere un'aliquota per l'analisi del gel di SDS e metterlo a-20 ° C. Nota: A questo punto, la procedura può essere messo in pausa il campione aliquotato snap-congelamento in azoto liquido e tenerlo a-80 ° C per la conservazione.</li>
</ol>3. proteine ripiegamento
<ol><li>Preparare 250 mL di tampone E (3M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, monocloridrato di L-arginina di 0,4 M, 20 mM ridotto L-glutatione, L-glutatione ossidato mM 2) in un becher da mL 500 e raffreddare il buffer fino a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 60 mg di miscela di proteine denaturate contenente il suo6-Tlp3-LBD ottenuta al passaggio 2.13 a 250 mL di tampone E, mescolando il buffer a 500 giri/min. Incubare il refolding mix a 4 ° C con agitazione continua a 500 giri/min per 24-48 h. La concentrazione finale di proteine in questo passaggio è di 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>Preparare 7 L di tampone A in un secchio di 8-10 L e raffreddarlo fino a 4 ° C in preparazione per il prossimo passo (punto 3.4) che avrà luogo in 24-48 h (Vedi il diagramma di flusso nella Figura 1).</li>
	<li>Immergere un pezzo di tubatura di dialisi di 28 mm di diametro gonfiato, con peso molecolare di interruzione a 12-14 kDa in 200 mL di 10 mM etilendiamminotetracetico sale disodico dell'acido (EDTA-Na2) ~ 50 cm e calore sopra una fiamma di gas fino a ebollizione. Risciacquare la membrana di dialisi con 200 mL di ddH2O.</li>
	<li>Bloccare un'estremità della membrana di dialisi con una chiusura di tubatura di dialisi e trasferire i 250 mL ripiegamento miscela ottenuta al passaggio 3.2 nel tubo di dialisi. Chiudere l'estremità aperta con un altro morsetto. Verificare l'integrità della membrana affinché che non vi siano perdite.</li>
	<li>Posizionare il tubo di dialisi in un secchio di dialisi con il pre-raffreddata 7 L di tampone A preparata al punto 3.3. Posizionare un ancoretta magnetica, assicurando che non toccherà la tubatura di dialisi continuando a mescolare.</li>
	<li>Dialyse il campione a 4 ° C con continua agitazione a 500 giri/min e modificare il buffer almeno quattro volte in un periodo di 12 h. Dopo l'ultima modifica di buffer, lasciare il campione per dialyse durante la notte. Nota: Durante la dialisi, l'eccesso di urea (~ 3 M) viene gradualmente rimosso dalla soluzione proteina denaturata, che la proteina permette di ripiegare. Precipitazione della proteina pesante può essere osservato alla fine della dialisi.</li>
	<li>Rimuovere il tubo di dialisi dal secchio e trasferire il contenuto in un becher da mL 500. Tenere la soluzione della proteina sul ghiaccio, a meno che non diversamente indicato.</li>
	<li>Filtrare la soluzione della proteina attraverso una membrana di dimensione del poro 0,43 µm in una bottiglia di vetro da 500 mL per rimuovere qualsiasi proteina precipitata.</li>
</ol>4. la purificazione della sua6-etichetta della proteina mediante cromatografia di affinità immobilizzata dello ione del metallo
<ol><li>
Carica ed equilibrare una colonna chelante preconfezionato da 5 mL.
	<ol>
<li>Collegare la colonna ad una pompa peristaltica, assicurando che non c'è nessuna aria intrappolata nel tubo di collegamento.</li>
		<li>Lavare la colonna facendo passare attraverso 25-50 mL di ddH2O.</li>
		<li>Caricare la colonna caricando 3 mL di 0.1 M Burundi2 e poi passando per 25 mL di ddH2O.</li>
		<li>Equilibrare la colonna con 25 mL di tampone F (buffer di caricamento, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo 20 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare il campione di proteina ripiegata ottenuto al passaggio 3.9 alla composizione del buffer F con l'aggiunta di 2,5 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL di NaCl di M 5 e 2,5 mL delle soluzioni madre di imidazolo di 2 M.</li>
	<li>Caricare il campione sulla colonna a un tasso di 5 mL/min o meno e scartare il flusso continuo (proteine non associati).</li>
	<li>Lavare la colonna con 50-100 mL di tampone F per rimuovere le proteine non specifico associati e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Eluire il suo6-Tlp3-LBD con 25 mL di tampone G (tampone di eluizione, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazolo 500 mM 500 mM) e le frazioni di scorrimento contenenti la proteina (come determinato usando il reagente di Bradford) della piscina.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteine nel campione usando l'analisi di Bradford. Prendere una piccola aliquota di analisi SDS-PAGE e posto a-20 ° C.</li>
</ol>5. il suo6-tag Removal utilizzando TEV proteasi (opzionale)
<ol><li>Preparare e raffreddare fino a 4 ° C, 4 L di tampone H (buffer di clivaggio TEV, 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glicerolo, 2 mM DTT).</li>
	<li>Tagliare circa 5-7 cm di tubatura di dialisi (diametro 2-3 cm) e immergerla in 200 mL di ddH2O.</li>
	<li>Aggiungere il suo6-etichetta della proteasi TEV alla sua6-proteina tag preparata al punto 4.5 per un finale rapporto molare 1 TEV: proteine 8.</li>
	<li>Fissare un'estremità del tubo con una chiusura di tubatura di dialisi e riempirlo con la miscela di proteasi della proteina/TEV. Chiudere l'altra estremità e garantire che non vi siano perdite.</li>
	<li>Posto la dialisi tubicino nel pre-raffreddata 4 L di tampone H (dal punto 5.1) e viene quindi incubato a 4 ° C con continuo mescolando per 2 h. cambiamento il buffer e continuare la dialisi durante la notte per permettere la reazione di clivaggio mediata di TEV completare.</li>
	<li>Nel frattempo, preparare e cool (4 ° C) 4 L di tampone ho (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glicerolo) in preparazione per il giorno successivo.</li>
	<li>Dopo la dialisi durante la notte, scambiare il buffer buffer che ho preparato nel passaggio 5.6 e dialyse per un'ulteriore 1-2 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Togliere il tubo dal secchio dialisi, sganciare un'estremità del tubo e la soluzione della proteina di trasferimento a un 50 mL tubo Falcon. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di siringa 0,43 µm dimensione dei pori e tenerlo sul ghiaccio, se non diversamente specificato.</li>
	<li>Misurare il volume del campione e regolare la concentrazione di Tris, NaCl e imidazolo alla composizione del buffer F (ad es. per 25 mL della soluzione di proteina nel buffer J aggiungere 0,25 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL di 5 M di NaCl e 0,25 mL di imidazolo 2 M).</li>
	<li>Preparare una colonna HiTrap chelanti HP 5ml come descritto al punto 4.1.</li>
	<li>Caricare il campione sulla colonna (portata: 5 mL/min) e raccogliere il flusso continuo, che contiene il tag Tlp3-LBD (residui 42-291). ApoAlert proteina, il fenduti sua6-tag e sua6- TEV vengono mantenute dalla colonna.</li>
	<li>Lavare la colonna con 5 mL di tampone F (buffer di caricamento) per consentire tutte le proteine senza tag fluire attraverso e raccogliere l'eluato.</li>
	<li>Piscina l'eluato ottenuto nei passaggi 5.11 e 5.12 e misura la concentrazione di proteina. Prendere una piccola aliquotare e conservare a-20 ° C per l'analisi SDS-PAGE.</li>
</ol>6. dimensione-exclusion Chromatography (Gel filtrazione) di Tlp3-LBD
<ol><li>Preparare 1 L di tampone A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) e filtrarli utilizzando una membrana 0,43 µm.</li>
	<li>Equilibrare una colonna di esclusione dimensionale 26/60 con tampone A una portata di 4 mL/min.</li>
	<li>Concentrare il campione proteico ottenuto nel passaggio 5.13 a un volume di 3-4 mL utilizzando concentratore centrifugo 15ml con un 10 kDa cut-off (4 ° C, 4.000 x g).</li>
	<li>Chiarire la soluzione della proteina mediante centrifugazione a 13.000 x g, 4 ° C per 30 min rimuovere qualsiasi proteina precipitata.</li>
	<li>Caricare il campione sulla colonna di filtrazione 26/60 gel pre-equilibrato. Eseguire cromatografia in tampone A una portata di 4 mL/min Monitor traccia UV. Tlp3-LBD eluisce ad un volume di ritenzione di 210-220 mL. Piscina le frazioni di picco.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina. Prendere una piccola aliquota per analisi SDS-PAGE.</li>
</ol>7. SDS-PAGE analisi dei campioni raccolti nelle varie fasi di purificazione della proteina
<ol><li>Preparare 1 L di buffer di esecuzione SDS-PAGE (buffer J), contenente 25 mM Tris, 250 mM glicina pH 8.3 e 0,1% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS).</li>
	<li>Preparare 10 mL di tampone di caricamento SDS-PAGE (buffer KB): 5x, contenente 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) glicerolo, 1 millimetro DTT e 0.05% bromofenolo Blu.</li>
	<li>Consentire le aliquote raccolte durante le varie fasi della purificazione (punti 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) a scongelare.</li>
	<li>Per ogni campione, mescolare il volume corrispondente a 15 µ g di proteine totali con 2 µ l di 5x SDS-PAGE di caricamento del buffer e regola il volume a 10 µ l con ddH2O.</li>
	<li>Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5-10 min, li spin a 10.000 x g per 30 s e trasferire i campioni in una provetta pulita.</li>
	<li>Preparare un gel di SDS-PAGE, utilizzando 15% poliacrilammide gel di separazione (per 5 mL: 2,5 mL 30% (p/v) bis-acrilammide, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µ l 10% (p/v) SDS, 50 µ l 20% (p/v) ammonio persolfato (APS), 3 µ l tetrametiletilendiammina (TEMED) e 5% poliacrilammide gel di impilamento (per mL: 340 2 µ l 30% (p/v) bis-acrilammide, 250 µ l di 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL ddH2O, 20 µ l 10% (p/v) SDS, 20 µ l 20% (p/v) APS, 2 µ l TEMED).</li>
	<li>Montare l'apparecchiatura di elettroforesi e riempirlo con 1x SDS page tampone secondo la raccomandazione del produttore di corsa.</li>
	<li>Caricare un marcatore di peso molecolare della proteina ed i campioni preparati al punto 7.5. Eseguire l'elettroforesi a una corrente costante di 25 mA.</li>
	<li>Trasferire il gel in un contenitore e risciacquare con ddH2O. aggiungere 150 mL di macchiatura soluzione contenente 25% (v/v) isopropanolo, acido acetico 10% (v/v) e 0,03% (p/v) Brilliant Blue R-250 il blu di Coomassie. Posizionare il contenitore su una piattaforma di rotazione orizzontale per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare il gel con ddH2O e posizionarli nella soluzione decolorante contenente 5% (v/v) metanolo e acido acetico 7% (v/v). Decolorare, mescolando utilizzando una piattaforma di rotazione orizzontale per 1 h.</li>
	<li>Il gel di immagine e analizzare.</li>
</ol>8. analisi spettroscopia dicroismo (CD) circolare del struttura secondaria della proteina pura ripiegata
<ol><li>Trasferire 0,5 - 1 mg di proteina ripiegata ottenuta nel passaggio 6.6 in un tubo di dialisi e metterlo in un secchio di dialisi contenenti 5 L di tampone L (50 mM sodio fosfato pH 7,4), preraffreddata a 4 ° C. Dialyse il campione a 4 ° C con agitazione continua ed eseguire modifiche di buffer di almeno 3-4 oltre 2-4 h prima di lasciare il campione per dialyse durante la notte.</li>
	<li>Concentrare la soluzione della proteina dializzati a 0,06 mg mL-1 utilizzando un concentratore centrifugo del cut-off di 10 kDa.</li>
	<li>Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 13.000 x g, 4 ° C per 30 min.</li>
	<li>Registrare lo spettro di CD lontano-UV del campione a 25 ° C in un intervallo di lunghezza d'onda di 200-260 nm utilizzando un spectropolarimeter con una velocità di scansione di 20 nm min-1. Utilizzare il buffer di dialisi come un controllo vuoto. Ripetere la registrazione in triplice copia e generare lo spettro di una media.</li>
	<li>Calcolare il contenuto di struttura secondaria di deconvoluting CD spettri utilizzando il programma di CDSSTR dalla DichroWeb sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Una procedura semplice per espressione e ripiegamento dai corpi di inclusione di LBD periplasmico della chemoreceptor batterica Tlp3 è presentata. Preparazione della proteina pura coinvolge sovra-espressione del gene codificato con animali-plasmide in Escherichia coli, la purificazione e la solubilizzazione dei corpi di inclusione, di ripiegamento della proteina denaturata e sua purificazione di affinità consecutivi e passaggi di cromatografia di esclusione dimensionale. La denaturazione dell'urea-facilitato e d...

Chemiotassi e motilità hanno dimostrati di svolgere i ruoli importanti nella patogenesi di jejuni del campilobatterio promuovendo la colonizzazione batterica e l'invasione dei host1,2,3. Chemiotassi permette ai batteri di muoversi verso un ambiente ottimale per la crescita, come guidati da segnali chimici. Questo processo prevede il riconoscimento dei segnali chimici intracellulari ed ambientale da un insieme di proteine chiamati chemocettori, o simil-trasduttore (TLP). Maggior parte dei chemocettori sono proteine di membrana incorporato con un extracitoplasmatico ligando (LBD), un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico segnalazione, il secondo dei quali interagisce con le proteine citosoliche di segnalamento che trasmettono il segnale di associazione per i motori flagellari4,5,6,7.
Undici diverse chemocettori sono state identificate nel genoma di c. jejuni 4,8. Ad oggi, solo alcuni di questi chemocettori sono stati caratterizzati e la specificità di ligandi di Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 è noto. Identificazione di ligandi naturali i chemocettori rimanenti in questa specie, e numerosi chemiorecettori in altri batteri, può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di piegato e altamente puro del chemocettore ricombinante LBDs14, 15 , 16. Tuttavia, tentativi di heterologously express periplasmico LBDs di chemocettori batteriche in Escherichia coli spesso causare mirati in corpi di inclusione17,18,19 . Tuttavia, questo fenomeno può facilitare facile isolamento e ripristino della proteina in mano. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando la LBD periplasmico del chemocettore c. jejuni Tlp3 come esempio. Questo esempio è stato scelto perché Tlp3-LBD appartiene alla famiglia dCACHE20 di telerilevamento domini che si trovano abbondantemente in due-componente istidina chinasi e chemocettori in procarioti20,21, 22 , 23.
In questo approccio, il costrutto di espressione, basato su un vettore di pET151/D-TOPO, è stato progettato per incorporare un N-terminale sua6-tag seguito da un tabacco etch sito di clivaggio della proteasi virus (TEV), per successivi tag rimozione19. Il protocollo descrive la sovraespressione della proteina in e. coli, isolamento e solubilizzazione urea-mediata di corpi di inclusione e di proteina ripiegamento da svuotamento di urea. Seguito di ripiegamento, il campione viene purificato mediante cromatografia di affinità, con cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale tag facoltativo. Il ripiegamento della proteina purificata è confermato usando la spettroscopia di dicroismo circolare. Si tratta di una versione modificata del metodo che è stato precedentemente sviluppato per recuperare e purificare la LBD di un diverso del chemocettore, Helicobacter pylori KMCO19. Questa procedura, riassunta nella Figura 1, produce 10-20 mg di puro, senza tag Tlp3-LBD per 1 L di coltura batterica, con una purezza di proteina di > 90% come valutato da SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Tris base</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-tiogalattoside (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Urea</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina monocloridrato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatione ridotto</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatione ossidato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico disidratato (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Cloruro di nichel (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Scala proteica non colorata, ampia Gamma (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore centrifugo Amicon Ultracel (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 mL Tubo</td><td></td><td></td> per dialisi FALCON BDAA352070 <td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>Dialisi</td> Tubo per dialisi <td></td></tr><tr>in<td>pelle di serpente</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HP chelante HiTrap preconfezionata</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore ad alta pressione EmulsiFlex-C5</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - Pompa</td> peristaltica C5 <td></td></tr><tr><td>P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superdex 200 HiLoad 26/60 ad esclusione dimensionale&nbsp;</td><td></td><td></td> Spettropolarimetro JASCO J-815 28989336 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore ligand binding domain

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identificazione di ligandi naturali dei chemocettori e studi strutturali mirati a delucidazione delle basi molecolari della specificità ligando può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame del ligando puro, piegato. Tentativi di heterologously express domini di legame del ligando periplasmico di chemocettori batteriche in Escherichia coli (Escherichia coli) spesso provocare mirati nei corpi di inclusione. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando il dominio di legame del ligando dCACHE periplasmico di jejuni del campilobatterio (c. jejuni) del chemocettore Tlp3 come esempio. L'approccio implica espressione della proteina di interesse con un spaccabili sua6-tag, isolamento e urea-mediata solubilizzazione dei corpi di inclusione, proteina ripiegamento di esaurimento dell'urea e la purificazione mediante cromatografia di affinità seguita da cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale di tag. La spettroscopia di dicroismo circolare viene utilizzata per confermare il ripiegamento della proteina pura. È stato dimostrato che questo protocollo è in genere utile per la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame ligando periplasmico dCACHE di altri chemocettori batteriche in forma solubile e cristallizzabili.

L'espressione ricombinante di suo6-Tlp3-LBD dentro e. coli ha provocato la deposizione di proteine in corpi di inclusione. La resa di espressione da 1 L di coltura batterica calcolata al punto 2.13 era circa 100 mg di sua6-Tlp3-LBD depositato in corpi di inclusione. La procedura di isolamento di proteine, qui descritta e illustrata in Figura 1, è costituito dalla solubilizzazione dei corpi di inclusione, il ripiegamento proteico...

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ripiegare un dominio di legame del ligando chemocettore dai corpi di inclusione e purificarlo per l'uso in studi strutturali e funzionali. Per stabilire quali segnali invia un chemocettore batterico e come, è possibile utilizzare i domini di legame del ligando isolati per lo screening di piccole librerie di molecole o per determinare la struttura con e senza ligando. L'espressione del dominio di legame del ligando extracellulare in E.coli spesso provoca la deposizione nei corpi di inclusione.Qui, mostriamo come quantità di milligrammi di proteina funzionale può essere recuperata dai corpi di inclusione. Per iniziare, inoculare 150 mL di brodo LB sterile contenente 50 microgrammi per mL di ampicillina con cellule RIPL BL21-CodonPlus trasformate con il vettore D-TOPO pET151 per l'espressione dell'esaistidina TIp3-LBD. Incubare la coltura a 200 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte.Preparare sei fiasche di Erlenmeyer da 2 litri contenenti 800 ml di brodo sterile per libbra e 50 microgrammi per ml di ampicillina. Inoculare in ogni pallone 20 ml di coltura notturna. Incubare i palloni a 37 gradi Celsius con agitazione continua

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Descriviamo l'implementazione della strategia REPLACE per indirizzare le interazioni proteina-proteina. REPLACE è una strategia iterativa che coinvolge approcci sintetici e computazionali per la conversione di inibitori peptidici ottimizzati in molecole simili a farmaci.

Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo

Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra il recettore delle cellule T e gli antigeni tumorali, presentati dagli antigeni dei leucociti umani, governa la funzionalità delle cellule T; questi metodi includono la produzione di proteine, la cristallografia a raggi X, la biofisica e gli esperimenti funzionali sulle cellule T.

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l'affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l'ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l'analisi dei dati.

Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

Questo protocollo introduce gli strumenti disponibili per la modellazione di ligandi a piccole molecole nelle mappe cryoEM di macromolecole.

Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica

Descriviamo una metodologia basata sulla diversificazione delle sequenze per stimare le preferenze amminoacidiche dei siti di legame multispecifici nelle interazioni proteina-proteina (PPI). In questa strategia, migliaia di potenziali ligandi peptidici vengono generati e sottoposti a screening in silico, superando così alcune limitazioni dei metodi sperimentali disponibili.

Predizione computazionale delle preferenze amminoacidiche di domini di legame peptidico potenzialmente multispecifici coinvolti nelle interazioni proteina-proteina

Qui presentiamo un protocollo per la progettazione guidata dalla struttura dell'interazione di legame proteina-ligando tra Sanglifehrin A e Ciclofilina A/Ganoderiolo-F, essenziale per scoprire nuovi farmaci. La stabilità del complesso ligando-recettore è stata valutata tramite simulazione della dinamica molecolare.

Progettazione e sviluppo guidati dalla struttura di nuovi inibitori della ciclofilina A e derivati del ganoderiolo-F: un approccio in-silico

Viene presentato un protocollo per sintetizzare peptoidi con funzionalità cationica mista nella stessa sequenza (monomeri di tipo lisina e arginina). Viene anche descritto il successivo test di questi composti contro la Leishmania mexicana, i protozoi parassiti che causano la leishmaniosi cutanea.

Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

Siamo riusciti a stabilire un metodo per l'isolamento dell'RNA da semi di piante contenenti grandi quantità di oli, proteine e polifenoli, che hanno effetti inibitori sull'isolamento dell'RNA ad alta purezza. Il nostro metodo è adatto per monitorare l'espressione di geni con trascritti di basso livello nei semi.

Un metodo efficace per l&#39;isolamento di RNA altamente purificato da semi per l&#39;utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma

Impara il metodo per ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando del chemocettore Tlp3 di Campylobacter jejuni dai corpi di inclusione. Questo protocollo permette di ottenere quantità di proteina funzionale per studi strutturali e screening.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

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