Name: Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Impara il metodo per ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando del chemocettore Tlp3 di Campylobacter jejuni dai corpi di inclusione. Questo protocollo permette di ottenere quantità di proteina funzionale per studi strutturali e screening.

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Ringraziamo Yu C. Liu per i suoi primi lavori sulla produzione Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca è in debito con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS per una borsa di dottorato.

1. espressione dei suoi6-Tlp3-LBD in e. coli
<ol><li>Inoculare 150 mL di brodo di Luria-Bertani (LB) sterile contenente 50 µ g ampicillina di-1 mL con Plus-codone-BL21 (DE3) - cellule RIPL trasformate con il vettore di pET151/D-TOPO per l'espressione della sua6- Tlp3-LBD (residui dell'amminoacido 42-291), e Incubare a 37 ° C in un agitatore (diametro orbita, 25 mm) con 200 giri/min durante la notte.</li>
	<li>Preparare sei matracci di Erlenmeyer 2L contenente 800 mL di brodo LB sterile e 50 µ g mL-1 ampicillina. Inoculare ciascuna beuta con 20 mL della coltura durante la notte ottenuta dal punto 1.1. Li Incubare a 37 ° C con agitazione continua a 200 giri/min fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge 0,6.</li>
	<li>Prendere un 1 mL aliquota da uno dei palloni (campione di controllo uninduced), pellet utilizzando una centrifuga da banco (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) e scartare il surnatante. Conservare il pellet batterico a-20 ° C per la successiva analisi di SDS-PAGE.</li>
	<li>Indurre l'espressione della proteina aggiungendo 1 mM di isopropile β-D-thiogalactoside (IPTG) per ciascuna beuta con la cultura. Continuano le beute a 37 ° C in un agitatore a 200 giri/min per ulteriori 4 h di incubazione.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Nota: A questo punto, la procedura può essere sospesa inserendo il pellet cellulare in un congelatore-80 ° C per la conservazione.</li>
</ol>2. isolamento e denaturazione dei corpi di inclusione
<ol><li>Trasferire tutti i pellet cellulare ottenuti al passaggio 1.5 in un becher da 250 mL e aggiungere 100 mL di tampone A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Permettono alle cellule di scongelare completamente (se congelati) e risospendere il pellet. Mantenere il campione sul ghiaccio a meno che non diversamente indicato.</li>
	<li>Passare tre volte le cellule sedimento attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione per lisare le cellule e garantire la tosatura completa del DNA genomic.</li>
	<li>Centrifugare il lisato a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C. Raccogliere un campione di 1 mL del surnatante (frazione solubile) e conservare a-20 ° C per la successiva analisi di SDS-PAGE. Scartare il resto del surnatante e mettere la pallina sul ghiaccio. Nota: Questa pallina è di colore bianco (facilmente distinguibili dalle cellule ininterrotte che sono colore marrone a colori) e contiene i corpi di inclusione.</li>
	<li>Risospendere il pellet di corpi di inclusione accuratamente in 20 mL di tampone ghiacciata B (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 0,2 mM fenilmetanosolfonil fluoruro (PMSF), 1% Triton X-100). Questo facilita la solubilizzazione della membrana e proteine di membrana. Vortexare per 1-2 min aiutare la risospensione.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere accuratamente in 20 mL di tampone ghiacciata B nel Vortex il tubo per 1-2 min. Accertarsi che il pellet è suddiviso in piccoli pezzi. Dispensare il campione su e giù per aiutare la risospensione del pellet. Nota: È importante Risospendere accuratamente per ottenere corpi di inclusione esenti da impurità.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.5. Se il supernatante è torbida o colorata, ripetere i passaggi da 2.6 e 2.5 (in questo ordine) fino a quando il surnatante è limpida e incolore.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 20 mL di tampone ghiacciata C (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 0,2 mM PMSF) nel Vortex il tubo per 1-2 min.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.5.</li>
	<li>Aggiungere 25 mL di tampone di denaturazione ghiacciata D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, urea 8 M, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) per sciogliere il precipitato di corpi di inclusione. Risospendere accuratamente nel Vortex per 1-2 minuti, o fino a quando la pallina è rotto in piccoli pezzi.</li>
	<li>Mescolare la sospensione di rotazione assiale con un tasso di rotazione di 30 rpm per 30-120 min a 4 ° C.</li>
	<li>Chiarire la soluzione di proteina denaturata mediante centrifugazione a 30.000 x g, 4 ° C per 30 minuti, mettere il sopranatante sul ghiaccio e scartare il pellet.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina usando l'analisi di Bradford. 24 prendere un'aliquota per l'analisi del gel di SDS e metterlo a-20 ° C. Nota: A questo punto, la procedura può essere messo in pausa il campione aliquotato snap-congelamento in azoto liquido e tenerlo a-80 ° C per la conservazione.</li>
</ol>3. proteine ripiegamento
<ol><li>Preparare 250 mL di tampone E (3M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, monocloridrato di L-arginina di 0,4 M, 20 mM ridotto L-glutatione, L-glutatione ossidato mM 2) in un becher da mL 500 e raffreddare il buffer fino a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 60 mg di miscela di proteine denaturate contenente il suo6-Tlp3-LBD ottenuta al passaggio 2.13 a 250 mL di tampone E, mescolando il buffer a 500 giri/min. Incubare il refolding mix a 4 ° C con agitazione continua a 500 giri/min per 24-48 h. La concentrazione finale di proteine in questo passaggio è di 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>Preparare 7 L di tampone A in un secchio di 8-10 L e raffreddarlo fino a 4 ° C in preparazione per il prossimo passo (punto 3.4) che avrà luogo in 24-48 h (Vedi il diagramma di flusso nella Figura 1).</li>
	<li>Immergere un pezzo di tubatura di dialisi di 28 mm di diametro gonfiato, con peso molecolare di interruzione a 12-14 kDa in 200 mL di 10 mM etilendiamminotetracetico sale disodico dell'acido (EDTA-Na2) ~ 50 cm e calore sopra una fiamma di gas fino a ebollizione. Risciacquare la membrana di dialisi con 200 mL di ddH2O.</li>
	<li>Bloccare un'estremità della membrana di dialisi con una chiusura di tubatura di dialisi e trasferire i 250 mL ripiegamento miscela ottenuta al passaggio 3.2 nel tubo di dialisi. Chiudere l'estremità aperta con un altro morsetto. Verificare l'integrità della membrana affinché che non vi siano perdite.</li>
	<li>Posizionare il tubo di dialisi in un secchio di dialisi con il pre-raffreddata 7 L di tampone A preparata al punto 3.3. Posizionare un ancoretta magnetica, assicurando che non toccherà la tubatura di dialisi continuando a mescolare.</li>
	<li>Dialyse il campione a 4 ° C con continua agitazione a 500 giri/min e modificare il buffer almeno quattro volte in un periodo di 12 h. Dopo l'ultima modifica di buffer, lasciare il campione per dialyse durante la notte. Nota: Durante la dialisi, l'eccesso di urea (~ 3 M) viene gradualmente rimosso dalla soluzione proteina denaturata, che la proteina permette di ripiegare. Precipitazione della proteina pesante può essere osservato alla fine della dialisi.</li>
	<li>Rimuovere il tubo di dialisi dal secchio e trasferire il contenuto in un becher da mL 500. Tenere la soluzione della proteina sul ghiaccio, a meno che non diversamente indicato.</li>
	<li>Filtrare la soluzione della proteina attraverso una membrana di dimensione del poro 0,43 µm in una bottiglia di vetro da 500 mL per rimuovere qualsiasi proteina precipitata.</li>
</ol>4. la purificazione della sua6-etichetta della proteina mediante cromatografia di affinità immobilizzata dello ione del metallo
<ol><li>
Carica ed equilibrare una colonna chelante preconfezionato da 5 mL.
	<ol>
<li>Collegare la colonna ad una pompa peristaltica, assicurando che non c'è nessuna aria intrappolata nel tubo di collegamento.</li>
		<li>Lavare la colonna facendo passare attraverso 25-50 mL di ddH2O.</li>
		<li>Caricare la colonna caricando 3 mL di 0.1 M Burundi2 e poi passando per 25 mL di ddH2O.</li>
		<li>Equilibrare la colonna con 25 mL di tampone F (buffer di caricamento, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo 20 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare il campione di proteina ripiegata ottenuto al passaggio 3.9 alla composizione del buffer F con l'aggiunta di 2,5 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL di NaCl di M 5 e 2,5 mL delle soluzioni madre di imidazolo di 2 M.</li>
	<li>Caricare il campione sulla colonna a un tasso di 5 mL/min o meno e scartare il flusso continuo (proteine non associati).</li>
	<li>Lavare la colonna con 50-100 mL di tampone F per rimuovere le proteine non specifico associati e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Eluire il suo6-Tlp3-LBD con 25 mL di tampone G (tampone di eluizione, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazolo 500 mM 500 mM) e le frazioni di scorrimento contenenti la proteina (come determinato usando il reagente di Bradford) della piscina.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteine nel campione usando l'analisi di Bradford. Prendere una piccola aliquota di analisi SDS-PAGE e posto a-20 ° C.</li>
</ol>5. il suo6-tag Removal utilizzando TEV proteasi (opzionale)
<ol><li>Preparare e raffreddare fino a 4 ° C, 4 L di tampone H (buffer di clivaggio TEV, 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glicerolo, 2 mM DTT).</li>
	<li>Tagliare circa 5-7 cm di tubatura di dialisi (diametro 2-3 cm) e immergerla in 200 mL di ddH2O.</li>
	<li>Aggiungere il suo6-etichetta della proteasi TEV alla sua6-proteina tag preparata al punto 4.5 per un finale rapporto molare 1 TEV: proteine 8.</li>
	<li>Fissare un'estremità del tubo con una chiusura di tubatura di dialisi e riempirlo con la miscela di proteasi della proteina/TEV. Chiudere l'altra estremità e garantire che non vi siano perdite.</li>
	<li>Posto la dialisi tubicino nel pre-raffreddata 4 L di tampone H (dal punto 5.1) e viene quindi incubato a 4 ° C con continuo mescolando per 2 h. cambiamento il buffer e continuare la dialisi durante la notte per permettere la reazione di clivaggio mediata di TEV completare.</li>
	<li>Nel frattempo, preparare e cool (4 ° C) 4 L di tampone ho (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glicerolo) in preparazione per il giorno successivo.</li>
	<li>Dopo la dialisi durante la notte, scambiare il buffer buffer che ho preparato nel passaggio 5.6 e dialyse per un'ulteriore 1-2 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Togliere il tubo dal secchio dialisi, sganciare un'estremità del tubo e la soluzione della proteina di trasferimento a un 50 mL tubo Falcon. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di siringa 0,43 µm dimensione dei pori e tenerlo sul ghiaccio, se non diversamente specificato.</li>
	<li>Misurare il volume del campione e regolare la concentrazione di Tris, NaCl e imidazolo alla composizione del buffer F (ad es. per 25 mL della soluzione di proteina nel buffer J aggiungere 0,25 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL di 5 M di NaCl e 0,25 mL di imidazolo 2 M).</li>
	<li>Preparare una colonna HiTrap chelanti HP 5ml come descritto al punto 4.1.</li>
	<li>Caricare il campione sulla colonna (portata: 5 mL/min) e raccogliere il flusso continuo, che contiene il tag Tlp3-LBD (residui 42-291). ApoAlert proteina, il fenduti sua6-tag e sua6- TEV vengono mantenute dalla colonna.</li>
	<li>Lavare la colonna con 5 mL di tampone F (buffer di caricamento) per consentire tutte le proteine senza tag fluire attraverso e raccogliere l'eluato.</li>
	<li>Piscina l'eluato ottenuto nei passaggi 5.11 e 5.12 e misura la concentrazione di proteina. Prendere una piccola aliquotare e conservare a-20 ° C per l'analisi SDS-PAGE.</li>
</ol>6. dimensione-exclusion Chromatography (Gel filtrazione) di Tlp3-LBD
<ol><li>Preparare 1 L di tampone A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) e filtrarli utilizzando una membrana 0,43 µm.</li>
	<li>Equilibrare una colonna di esclusione dimensionale 26/60 con tampone A una portata di 4 mL/min.</li>
	<li>Concentrare il campione proteico ottenuto nel passaggio 5.13 a un volume di 3-4 mL utilizzando concentratore centrifugo 15ml con un 10 kDa cut-off (4 ° C, 4.000 x g).</li>
	<li>Chiarire la soluzione della proteina mediante centrifugazione a 13.000 x g, 4 ° C per 30 min rimuovere qualsiasi proteina precipitata.</li>
	<li>Caricare il campione sulla colonna di filtrazione 26/60 gel pre-equilibrato. Eseguire cromatografia in tampone A una portata di 4 mL/min Monitor traccia UV. Tlp3-LBD eluisce ad un volume di ritenzione di 210-220 mL. Piscina le frazioni di picco.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina. Prendere una piccola aliquota per analisi SDS-PAGE.</li>
</ol>7. SDS-PAGE analisi dei campioni raccolti nelle varie fasi di purificazione della proteina
<ol><li>Preparare 1 L di buffer di esecuzione SDS-PAGE (buffer J), contenente 25 mM Tris, 250 mM glicina pH 8.3 e 0,1% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS).</li>
	<li>Preparare 10 mL di tampone di caricamento SDS-PAGE (buffer KB): 5x, contenente 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) glicerolo, 1 millimetro DTT e 0.05% bromofenolo Blu.</li>
	<li>Consentire le aliquote raccolte durante le varie fasi della purificazione (punti 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) a scongelare.</li>
	<li>Per ogni campione, mescolare il volume corrispondente a 15 µ g di proteine totali con 2 µ l di 5x SDS-PAGE di caricamento del buffer e regola il volume a 10 µ l con ddH2O.</li>
	<li>Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5-10 min, li spin a 10.000 x g per 30 s e trasferire i campioni in una provetta pulita.</li>
	<li>Preparare un gel di SDS-PAGE, utilizzando 15% poliacrilammide gel di separazione (per 5 mL: 2,5 mL 30% (p/v) bis-acrilammide, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µ l 10% (p/v) SDS, 50 µ l 20% (p/v) ammonio persolfato (APS), 3 µ l tetrametiletilendiammina (TEMED) e 5% poliacrilammide gel di impilamento (per mL: 340 2 µ l 30% (p/v) bis-acrilammide, 250 µ l di 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL ddH2O, 20 µ l 10% (p/v) SDS, 20 µ l 20% (p/v) APS, 2 µ l TEMED).</li>
	<li>Montare l'apparecchiatura di elettroforesi e riempirlo con 1x SDS page tampone secondo la raccomandazione del produttore di corsa.</li>
	<li>Caricare un marcatore di peso molecolare della proteina ed i campioni preparati al punto 7.5. Eseguire l'elettroforesi a una corrente costante di 25 mA.</li>
	<li>Trasferire il gel in un contenitore e risciacquare con ddH2O. aggiungere 150 mL di macchiatura soluzione contenente 25% (v/v) isopropanolo, acido acetico 10% (v/v) e 0,03% (p/v) Brilliant Blue R-250 il blu di Coomassie. Posizionare il contenitore su una piattaforma di rotazione orizzontale per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare il gel con ddH2O e posizionarli nella soluzione decolorante contenente 5% (v/v) metanolo e acido acetico 7% (v/v). Decolorare, mescolando utilizzando una piattaforma di rotazione orizzontale per 1 h.</li>
	<li>Il gel di immagine e analizzare.</li>
</ol>8. analisi spettroscopia dicroismo (CD) circolare del struttura secondaria della proteina pura ripiegata
<ol><li>Trasferire 0,5 - 1 mg di proteina ripiegata ottenuta nel passaggio 6.6 in un tubo di dialisi e metterlo in un secchio di dialisi contenenti 5 L di tampone L (50 mM sodio fosfato pH 7,4), preraffreddata a 4 ° C. Dialyse il campione a 4 ° C con agitazione continua ed eseguire modifiche di buffer di almeno 3-4 oltre 2-4 h prima di lasciare il campione per dialyse durante la notte.</li>
	<li>Concentrare la soluzione della proteina dializzati a 0,06 mg mL-1 utilizzando un concentratore centrifugo del cut-off di 10 kDa.</li>
	<li>Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 13.000 x g, 4 ° C per 30 min.</li>
	<li>Registrare lo spettro di CD lontano-UV del campione a 25 ° C in un intervallo di lunghezza d'onda di 200-260 nm utilizzando un spectropolarimeter con una velocità di scansione di 20 nm min-1. Utilizzare il buffer di dialisi come un controllo vuoto. Ripetere la registrazione in triplice copia e generare lo spettro di una media.</li>
	<li>Calcolare il contenuto di struttura secondaria di deconvoluting CD spettri utilizzando il programma di CDSSTR dalla DichroWeb sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Una procedura semplice per espressione e ripiegamento dai corpi di inclusione di LBD periplasmico della chemoreceptor batterica Tlp3 è presentata. Preparazione della proteina pura coinvolge sovra-espressione del gene codificato con animali-plasmide in Escherichia coli, la purificazione e la solubilizzazione dei corpi di inclusione, di ripiegamento della proteina denaturata e sua purificazione di affinità consecutivi e passaggi di cromatografia di esclusione dimensionale. La denaturazione dell'urea-facilitato e d...

Chemiotassi e motilità hanno dimostrati di svolgere i ruoli importanti nella patogenesi di jejuni del campilobatterio promuovendo la colonizzazione batterica e l'invasione dei host1,2,3. Chemiotassi permette ai batteri di muoversi verso un ambiente ottimale per la crescita, come guidati da segnali chimici. Questo processo prevede il riconoscimento dei segnali chimici intracellulari ed ambientale da un insieme di proteine chiamati chemocettori, o simil-trasduttore (TLP). Maggior parte dei chemocettori sono proteine di membrana incorporato con un extracitoplasmatico ligando (LBD), un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico segnalazione, il secondo dei quali interagisce con le proteine citosoliche di segnalamento che trasmettono il segnale di associazione per i motori flagellari4,5,6,7.
Undici diverse chemocettori sono state identificate nel genoma di c. jejuni 4,8. Ad oggi, solo alcuni di questi chemocettori sono stati caratterizzati e la specificità di ligandi di Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 è noto. Identificazione di ligandi naturali i chemocettori rimanenti in questa specie, e numerosi chemiorecettori in altri batteri, può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di piegato e altamente puro del chemocettore ricombinante LBDs14, 15 , 16. Tuttavia, tentativi di heterologously express periplasmico LBDs di chemocettori batteriche in Escherichia coli spesso causare mirati in corpi di inclusione17,18,19 . Tuttavia, questo fenomeno può facilitare facile isolamento e ripristino della proteina in mano. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando la LBD periplasmico del chemocettore c. jejuni Tlp3 come esempio. Questo esempio è stato scelto perché Tlp3-LBD appartiene alla famiglia dCACHE20 di telerilevamento domini che si trovano abbondantemente in due-componente istidina chinasi e chemocettori in procarioti20,21, 22 , 23.
In questo approccio, il costrutto di espressione, basato su un vettore di pET151/D-TOPO, è stato progettato per incorporare un N-terminale sua6-tag seguito da un tabacco etch sito di clivaggio della proteasi virus (TEV), per successivi tag rimozione19. Il protocollo descrive la sovraespressione della proteina in e. coli, isolamento e solubilizzazione urea-mediata di corpi di inclusione e di proteina ripiegamento da svuotamento di urea. Seguito di ripiegamento, il campione viene purificato mediante cromatografia di affinità, con cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale tag facoltativo. Il ripiegamento della proteina purificata è confermato usando la spettroscopia di dicroismo circolare. Si tratta di una versione modificata del metodo che è stato precedentemente sviluppato per recuperare e purificare la LBD di un diverso del chemocettore, Helicobacter pylori KMCO19. Questa procedura, riassunta nella Figura 1, produce 10-20 mg di puro, senza tag Tlp3-LBD per 1 L di coltura batterica, con una purezza di proteina di > 90% come valutato da SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Tris base</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-tiogalattoside (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Urea</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina monocloridrato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatione ridotto</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatione ossidato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico disidratato (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Cloruro di nichel (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Scala proteica non colorata, ampia Gamma (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore centrifugo Amicon Ultracel (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 mL Tubo</td><td></td><td></td> per dialisi FALCON BDAA352070 <td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>Dialisi</td> Tubo per dialisi <td></td></tr><tr>in<td>pelle di serpente</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HP chelante HiTrap preconfezionata</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore ad alta pressione EmulsiFlex-C5</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - Pompa</td> peristaltica C5 <td></td></tr><tr><td>P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superdex 200 HiLoad 26/60 ad esclusione dimensionale&nbsp;</td><td></td><td></td> Spettropolarimetro JASCO J-815 28989336 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore ligand binding domain

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identificazione di ligandi naturali dei chemocettori e studi strutturali mirati a delucidazione delle basi molecolari della specificità ligando può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame del ligando puro, piegato. Tentativi di heterologously express domini di legame del ligando periplasmico di chemocettori batteriche in Escherichia coli (Escherichia coli) spesso provocare mirati nei corpi di inclusione. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando il dominio di legame del ligando dCACHE periplasmico di jejuni del campilobatterio (c. jejuni) del chemocettore Tlp3 come esempio. L'approccio implica espressione della proteina di interesse con un spaccabili sua6-tag, isolamento e urea-mediata solubilizzazione dei corpi di inclusione, proteina ripiegamento di esaurimento dell'urea e la purificazione mediante cromatografia di affinità seguita da cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale di tag. La spettroscopia di dicroismo circolare viene utilizzata per confermare il ripiegamento della proteina pura. È stato dimostrato che questo protocollo è in genere utile per la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame ligando periplasmico dCACHE di altri chemocettori batteriche in forma solubile e cristallizzabili.

L'espressione ricombinante di suo6-Tlp3-LBD dentro e. coli ha provocato la deposizione di proteine in corpi di inclusione. La resa di espressione da 1 L di coltura batterica calcolata al punto 2.13 era circa 100 mg di sua6-Tlp3-LBD depositato in corpi di inclusione. La procedura di isolamento di proteine, qui descritta e illustrata in Figura 1, è costituito dalla solubilizzazione dei corpi di inclusione, il ripiegamento proteico...

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ripiegare un dominio di legame del ligando chemocettore dai corpi di inclusione e purificarlo per l'uso in studi strutturali e funzionali. Per stabilire quali segnali invia un chemocettore batterico e come, è possibile utilizzare i domini di legame del ligando isolati per lo screening di piccole librerie di molecole o per determinare la struttura con e senza ligando. L'espressione del dominio di legame del ligando extracellulare in E.coli spesso provoca la deposizione nei corpi di inclusione.Qui, mostriamo come quantità di milligrammi di proteina funzionale può essere recuperata dai corpi di inclusione. Per iniziare, inoculare 150 mL di brodo LB sterile contenente 50 microgrammi per mL di ampicillina con cellule RIPL BL21-CodonPlus trasformate con il vettore D-TOPO pET151 per l'espressione dell'esaistidina TIp3-LBD. Incubare la coltura a 200 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte.Preparare sei fiasche di Erlenmeyer da 2 litri contenenti 800 ml di brodo sterile per libbra e 50 microgrammi per ml di ampicillina. Inoculare in ogni pallone 20 ml di coltura notturna. Incubare i palloni a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 200 giri/min fino a quando l'OD600 raggiunge 0,6.A questo punto, indurre l'espressione proteica aggiungendo 1 millimolare di IPTG a ciascun pallone. Continuare a incubare i palloni a 37 gradi Celsius in un agitatore a 200 giri/min per altre quattro ore. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5000 xg e quattro gradi Celsius per 15 minuti.Quindi, scartare il surnatante. Trasferire tutti i pellet cellulari in un becher da 250 mL e aggiungere 100 mL di Buffer A.Se congelato, lasciare scongelare completamente le cellule e quindi risospendere il pellet. Conservare il campione sul ghiaccio se non diversamente indicato.Successivamente, passare tre volte le cellule risospese attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione per lisare le cellule e garantire il taglio completo del DNA genomico. Quindi, centrifugare il lisato a 10.000 xg e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Raccogliere un campione da un ml del surnatante e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per la successiva analisi SDS-PAGE.Quindi, scartare il resto del surnatante e mettere il pellet sul ghiaccio. Successivamente, risospendere accuratamente il pellet dei corpi di inclusione in 20 mL di tampone B ghiacciato. Agitare il campione per uno o due minuti per facilitare la risospensione.Dopo aver centrifugato il campione, risospendere accuratamente il pellet in 20 mL di tampone B ghiacciato agitando prima la provetta per uno o due minuti. Assicurarsi che il pellet sia rotto in piccoli pezzi. Quindi, pipettare il campione su e giù per risospenderlo.Centrifugare il campione come prima ed eliminare il surnatante. Se il surnatante è torbido o colorato, centrifugare nuovamente il campione e utilizzare un ulteriore tampone B ghiacciato per risospenderlo. Ripetere la centrifugazione e la risospensione fino a quando il surnatante è limpido e incolore prima di pellettare nuovamente.Aggiungere 20 ml di tampone C ghiacciato al pellet e risospenderlo facendo vorticare la provetta per uno o due minuti. Quindi, dopo aver centrifugato il campione, aggiungere 25 mL di tampone Denaturante ghiacciato D.Risospendere accuratamente il pellet dei corpi di inclusione facendo roteare la provetta per uno o due minuti o fino a quando il pellet non si rompe in piccoli pezzi. Miscelare le sospensioni mediante rotazione assiale a 30 giri/min e 4 gradi Celsius per 30-120 minuti.Chiarificare la soluzione proteica denaturata mediante centrifugazione a 30.000 xg e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, posizionare il surnatante sul ghiaccio e scartare il pellet. Mentre si mescolano 250 mL di Buffer E a 500 giri/min, aggiungere 60 milligrammi di miscela proteica denaturata contenente esaistadina TIp3-LBD.Incubare la miscela di ripiegamento a quattro gradi Celsius mescolando continuamente a 500 giri/min per 24-48 ore. La concentrazione proteica finale è di 0,2 mg per ml. Dopo aver preparato sette litri di tampone A pre-raffreddato e tubo per dialisi secondo il protocollo di testo, utilizzare la chiusura del tubo per dialisi per bloccare un'estremità della membrana per dialisi e trasferire la miscela per dialisi nel tubo.Quindi, bloccare l'estremità aperta e assicurarsi che non vi siano perdite. Posizionare il tubo per dialisi in un secchio per dialisi con il tampone A.Quindi, aggiungere un'ancoretta magnetica, assicurandosi che non tocchi il tubo per dialisi durante l'agitazione. Dializzare il campione a quattro gradi Celsius agitando continuamente a 500 giri/min e sostituire il tampone almeno quattro volte nell'arco di 12 ore.Dopo l'ultima sostituzione del tampone, lasciare il campione a dializzare per una notte. La mattina seguente, rimuovere la provetta per dialisi dal secchio e trasferirne il contenuto in un becher da 500 ml. Conservare la soluzione proteica in ghiaccio se non diversamente indicato.Filtrare la soluzione proteica attraverso una membrana delle dimensioni di un poro di 0,43 micron in un flacone di vetro da 500 ml per rimuovere qualsiasi proteina precipitata. Dopo aver lavato, caricato ed equilibrato una colonna chelante secondo il protocollo di testo, regolare il campione proteico ripiegato ottenuto in base alla composizione del tampone F aggiungendo 25 mL di cloruro di sodio 5 M, 2,5 mL di tris-HCl 1 M, pH 8,0 e 2,5 mL di soluzioni madre di imidazolo 2 M. Caricare il campione sulla colonna a una velocità di 5 mL al minuto o meno ed eliminare il flusso che contiene le proteine non legate.Quindi, lavare la colonna con 50-100 mL di tampone F per rimuovere le proteine non specificamente legate ed eliminare il flusso. Eluire l'esaistadina TIp3-LBD con 25 mL di tampone G.Quindi, raggruppare le frazioni a flusso continuo contenenti la proteina. Dopo aver preparato il tampone H e il tubo per dialisi secondo il protocollo di testo, aggiungere la proteasi TEV marcata con esaistadina alla proteina marcata con esaistadina nel tubo.Aggiungere un rapporto molare finale di un TEV per otto di proteine. Posizionare la provetta per dialisi bloccata nei quattro L di tampone H pre-raffreddato e incubarla a quattro gradi Celsius mescolando continuamente per due ore. Quindi, cambiare il tampone e continuare la dialisi durante la notte per consentire il completamento della reazione di scissione mediata da TEV.Dopo la sostituzione con il tampone I, il filtraggio della soluzione proteica e la regolazione del campione, caricare il campione su una colonna HP chelante HiTrap da cinque mL preparata. A una velocità di flusso di cinque mL al minuto, raccogliere il flusso che contiene il TIp3-LBD non etichettato. Sulla proteina scissata, il tag esaistadina scissa e l'esaistadina TEV vengono trattenuti dalla colonna.Utilizzare cinque mL di tampone F per lavare la colonna in modo da consentire alla proteina non marcata di fluire e raccogliere l'eluato. Quindi, dopo aver bilanciato una colonna di esclusione dimensionale e aver concentrato e chiarificato il campione proteico secondo il protocollo di testo, caricare il campione sulla colonna di filtrazione su gel pre-bilanciata 26/60. Applicare il tampone A a una velocità di flusso di quattro ml al minuto e monitorare la traccia UV per l'eluizione delle proteine.TIp3-LBD eluisce a un volume di ritenzione compreso tra 210 e 220 mL. Infine, dopo la cromatografia, raggruppare le frazioni, quindi misurare la concentrazione proteica ed eseguire SDS-PAGE. La procedura di isolamento delle proteine dimostrata in questo video ha prodotto da 10 a 20 mg di TIp3-LBD puro non marcato per un litro di coltura batterica.Come si vede qui, la proteina eluita dalla colonna di filtrazione su gel ha un singolo picco simmetrico, corrispondente a un volume di ritenzione di 220 mL con un peso molecolare calcolato di 29 kDa. Come mostrato qui da SDS-PAGE, i corpi di inclusione contenevano prevalentemente esaistadina TIp3-LBD con un peso molecolare apparente di 28 kDa, che è vicino al valore calcolato dalla sequenza di amminoacidi di 31,8 kDa. Le fasi di rimozione delle etichette esaistadina, cromatografia di affinità e filtrazione su gel hanno prodotto proteine altamente pure.La spettroscopia CD con CDSSTR ha rivelato che la struttura secondaria dell'esaistidina TIp3-LBD era costituita dal 31% di alfa-elica e dal 23% di beta-foglio. Questi erano anche vicini ai valori previsti del 37% e del 26% rispettivamente dall'analisi delle sequenze utilizzando il server JPred 3. Questo protocollo richiede un minimo di cinque giorni dall'inizio alla fine e può essere messo in pausa, se necessario, in tre diverse fasi.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la risospensione completa e completa dei corpi di inclusione nel tampone di denaturazione mediante vortice o pipettaggio su e giù è fondamentale per l'intera realizzazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando del chemocettore TIp3. La proteina purificata può essere utilizzata per legare gli acidi per studiare la specificità del ligando per questo recettore.Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina ottenuta con questa procedura potrebbe essere utilizzata per produrre cristalli altamente ordinati, e questo ha aperto la strada agli studi delle basi strutturali per la sua specificità ligando. Questa procedura potrebbe essere generalmente utile per la produzione di quantità mg di chemocettori da altri batteri in forma cristallizzabile e solubile. Abbiamo utilizzato questo protocollo nella sua forma originale o leggermente modificata per ripiegare e purificare il dominio di legame del ligando di altri chemocettori di questo tipo per studi cristallografici.Si ricorda che in ogni singolo caso sarà probabilmente necessaria l'ottimizzazione del protocollo, ad esempio la composizione dei tamponi di denaturazione e ripiegamento e i tempi di incubazione.

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