微量肉汤稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法

摘要

一种简便且可适应的肉汤微量稀释法，用于筛选抗真菌化合物和提取物。

摘要

近几十年来，真菌感染已成为重要的医学问题，但可用的抗真菌药物种类有限。在此背景下，寻找新的抗真菌药物十分必要。本文报道的实验方案详细描述了一种用于筛选具有抗真菌特性的肽类分子的方法。该方法基于美国临床与实验室标准协会（CLSI）M27-A3指南中的肉汤微量稀释敏感性试验，并进行了修改，以适用于将抗菌肽作为潜在新型抗真菌药物的研究。本方案描述了一种功能检测方法，用于评估抗真菌化合物的活性，且可根据所研究的任何特定类别分子进行简便调整。由于实验在96孔板中以小体积进行，因此可在短时间内完成大规模筛选，尤其适用于自动化操作环境。该操作流程展示了标准化且可调节的临床检测方案如何助力实验室研发新分子，从而改善真菌病的治疗手段。

引言

近几十年来，真菌感染已成为重要的医学问题，其发病率显著上升，主要原因是免疫功能低下人群的数量增加，例如接受癌症治疗的患者、艾滋病病毒/艾滋病（HIV/AIDS）感染者以及器官移植受者^1,2。然而，可用的抗真菌药物种类极为有限，且关于真菌对这些药物产生耐药性的报道日益增多，这给系统性真菌病的治疗带来了重大挑战³。

新型抗真菌化合物的潜在来源之一是抗菌肽（AMPs），这是一类由多种生物体产生的阳离子小分子肽，作为其对感染的先天免疫反应的一部分⁴。然而，目前尚无标准化的方法用于检测这些化合物对真菌病原体的活性。已有多种不同实验流程被用于评估AMPs的抗真菌活性，有时甚至在同一模式微生物中也采用不同方法^5,6,7。这些方法间的差异以及部分实验方案中细节描述的缺失，使得不同化合物之间的比较变得复杂，并阻碍了实验的可重复性。

标准化新药候选物测试的一种方法是遵循临床环境中定义抗真菌药物敏感性的指南，例如美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27-A3 指南。然而，这些抗真菌敏感性试验限制性过强，且未考虑不同物种间代谢的差异，因为这些指南仅针对少数特定药物建立。例如，它们未考虑非发酵性酵母的代谢需求。

本方案可用于评估潜在抗真菌化合物的活性，本文中将其应用于抗真菌肽的筛选。该方法基于CLSI M27-A3指南中的液体微量稀释敏感性试验，并进行了若干改进以优化新化合物的筛选^8,9。这些改进使得化合物用量更少，可调节温度或初始接种量，以及使用不同的培养基进行最佳的试验前培养，同时通过使用标准抗真菌药物作为对照，实现结果的标准化。该方法结合多孔培养板的使用，能够快速、可靠地对大量化合物进行筛选。

由于其固有的灵活性，该方案只需少量调整，即可适用于不同化学类别的化合物以及其他微生物。

方案

1. 溶液与培养基

1. 根据表1配制2倍浓度的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、沙氏葡萄糖肉汤和沙氏葡萄糖琼脂。

2. 真菌接种物培养条件

1. 将所有真菌菌株以含35%甘油的冻存液在-80 °C下保存，直至使用。
2. 每次实验前执行以下步骤。
   1. 对于Candida albicans菌株：
      1. 解冻一支冻存管，取200 µL转移至含有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL聚丙烯管中，于30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养过夜。注意将试管倾斜并略微打开管盖，以利于培养物更好地通气。
   2. 对于Cryptococcus neoformans菌株：
      1. 刮取冻存管表面的冷冻菌体，将细胞接种至沙氏葡萄糖琼脂平板上，在30 °C下培养48小时。待出现单菌落可见生长后，用封口膜密封平板并置于冰箱（4 °C）中保存，最多可保存15天。
      2. 使用无菌牙签或无菌接种环从平板上挑取一个中等大小的单菌落，接种至装有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL锥形管中，在30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养约24小时。
      3. 培养时间不得超过24小时。注意将试管倾斜并略微打开管盖，以利于通气。每次测试前对细胞生长阶段进行标准化非常重要，因为这是影响抗微生物耐药性的关键因素。
         注：本实验中两种真菌均在30 °C下培养以实现快速增殖，但可根据研究目的调整温度，例如模拟临床治疗条件（37 °C）。最重要的是，应预先确定每种真菌分离株的初始培养时间，并在整个实验过程中保持一致，以确保结果的可重复性。
3. 真菌培养完成后，于室温下以1,200 × g离心5分钟收集细胞。弃去上清液，加入10 mL PBS。
4. 重悬细胞后，再次于室温下以1,200 × g离心5分钟。
5. 重复PBS洗涤和离心操作两次。第三次洗涤后，根据菌体沉淀的大小，将细胞重悬于5 mL的2× RPMI-1640培养基中。
6. 根据细胞悬液的浊度，在微量离心管中制备1 mL的1:100或1:1,000稀释液。
7. 取10 µL上述稀释液，加入血细胞计数板腔室中，在显微镜下计数四个角区的总细胞数。按以下公式计算细胞浓度：(总细胞数/4) × 稀释倍数 × 10⁴（计数板稀释常数）。
   1. 若所研究菌株的活力计数与生长条件已建立系统性关联，则可视为细胞活力为100%。
      注：可通过反向平板法对活力计数进行标准化和质量控制，具体方法参照欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）针对酵母菌的抗真菌最小抑菌浓度（MIC）测定方法¹⁰。
   2. 若尚未建立所研究菌株的生长/活力相关性，需借助可选择性染色死细胞的染料（如曙红B¹¹、台盼蓝¹²或詹纳斯绿¹³），在血细胞计数板中计数活细胞以测定真菌活力。仅当此时细胞群体的活力达到90%或以上时，方可用于本实验方案。
      注：某些染料可能不适用于特定真菌。请在使用前进行测试。例如，台盼蓝对C. neoformans的染色效果不佳。
8. 随后，在2× RPMI-1640培养基中制备细胞悬液（即2×调整后的接种量）。对于96孔板，每块板建议准备5 mL细胞悬液。
   1. 对于所有C. albicans菌株，制备浓度为4 × 10³ 个细胞/mL的储备细胞悬液。该浓度为每孔最终细胞浓度（2 × 10³ 个细胞/mL）的2倍。
   2. 对于C. neoformans菌株，制备浓度为2 × 10⁴ 个细胞/mL的储备细胞培养液。该浓度为每孔最终细胞浓度（1 × 10⁴ 个细胞/mL）的2倍。
   3. 对于其他真菌，应通过已知抗真菌药物测试，结合培养时间确定适合特定研究的理想浓度，并考虑真菌的代谢速率和倍增时间。

3. 肽（未知试剂）

1. 将冻干的多肽在 -20 °C 下保存，并在每次实验前用去离子水溶解。溶解后的最长保存时间取决于每种多肽的性质。
2. 制备检测中所用最高终浓度两倍的多肽溶液（2X）。理想情况下，制备少量分装样品，每份含有足够一次使用的多肽量，以避免反复冻融。
   注意：浓度的选择应基于文献报道及多肽的特性。建议起始系列稀释浓度约为 100 µM，然后根据实验结果调整该浓度范围。

4. 参照抗真菌药物（阳性对照）

1. 对于用水稀释的药物：配制分析所需最高浓度的2倍浓度溶液（稀释步骤参见第5节：抗真菌实验）。
   1. 对于 C. albicans 菌株，配制128 µg/mL的氟康唑溶液或128 µg/mL的卡泊芬净溶液。平板中的终浓度均为64 µg/mL。
   2. 对于 C. neoformans 菌株，配制32 µg/mL的两性霉素B（水溶性溶液）。平板中的终浓度为16 µg/mL。
      注意：通常两性霉素B使用二甲基亚砜（DMSO）进行稀释，因为该抗真菌药物在水中溶解度较低。然而，目前已有 commercially available 的水溶性两性霉素B制剂。
2. 对于使用有机溶剂稀释的抗真菌药物：先用DMSO配制100倍浓度的储备液，然后用水稀释至10倍浓度使用。
   注意：因此，孔板中的DMSO终浓度不会超过1%。由于某些真菌对该溶剂浓度耐受性较差，需设置一孔真菌在含1% DMSO的培养基中生长作为对照。请注意DMSO具有光敏性，因此在培养期间应使用铝箔包裹孔板或将其置于避光环境中。

5. 抗真菌活性测定

注意： 体外 根据临床与实验室标准协会（CLSI）M27-A3指南中的肉汤微量稀释法敏感性试验，结合部分修改，进行抗真菌活性检测。

1. 在96孔聚苯乙烯微量培养板中，将每种肽和对照抗真菌药物进行两倍系列稀释，最终体积为50 µL。
   1. 使用移液器在 A 行第 1–3 列中加入 100 µL 抗真菌剂/肽溶液，其浓度为所需最终浓度的 2 倍。
   2. 使用多通道移液器，向B至H行的其他孔中每孔加入50 µL无菌水。
   3. 移除浓度最高孔（A行）中的50 µL，转移至下一浓度孔（B行），并混匀。
   4. 重复上述步骤，直至最低浓度孔（H行），并弃去该孔50 µL液体。第11和12列（A、B、C行）仅加入水，作为空白对照或阴性/生长对照。
   5. 向每孔（第1-3列以及第11列（阴性/生长对照））中加入50 µL用RPMI-1640培养基配制的2倍浓度调整后的接种物；最终浓度为 白色念珠菌 将是 2 × 10³ 细胞/毫升，最终浓度为 C. neoformans 菌株将为10⁴ cells/mL
   6. 制备空白对照（50 µL 水 + 50 µL 不含细胞的 2× RPMI-1640 培养基）和阴性/生长对照（50 µL 水 + 50 µL 不含抗真菌药物的调整后接种液 2× RPMI-1640 培养基），并按上述方法加入到微孔板中。
2. 对每种待测化合物及所选的抗真菌对照（第4-10列）重复上述步骤。
   注意：倍比稀释可在平板中垂直进行（如以下实验所示），或水平进行即， 如果需要测试的化合物/提取物的稀释度为八个或更多。
   1. 如果化合物、对照药物或其任何组分对光敏感，则在光照减少的条件下进行实验，在孵育期间用铝箔覆盖板或将其置于暗室中。
3. 请考虑以下可选建议。
   1. 用可透气的透明封板膜密封培养板，以减少蒸发。
   2. 将培养皿置于湿盒中，这也有助于减少蒸发。
4. 在37 °C下孵育平板24小时或48小时，适用于所有样品 C. albicans 菌株，并在200 rpm振荡条件下培养48小时 C. neoformans较低的终体积（100 µL）可确保不发生溢出。
   注意：在24 h和48 h的MIC读数之间未观察到显著差异 白色念珠菌 菌株。然而，48小时的读数更容易观察。
5. 在孵育前后，借助倒置光学显微镜观察所有培养孔，以验证细胞形态变化并检查是否存在污染迹象。
   注意：实验结束时可进行肉眼观察并拍照记录。每次读数前需轻微混匀培养板。若未观察到细胞聚团或丝状生长现象，也可通过测定600 nm处的光密度（OD600）进行读数。
6. 在不同日期至少重复实验三次。

结果

最小抑菌浓度（MIC）定义为在孵育结束时能够完全抑制真菌可见生长的最低抗菌化合物浓度。由于本实验方案的目的是建立一种快速筛选潜在抗真菌药物的方法，因此任何孔中培养基清澈程度与空白孔相似者均视为阳性结果，而任何孔中出现与阴性对照/生长对照孔相似的浑浊者则视为阴性结果。然而，若需进一步确定某种抗菌肽（AMP）是抑菌性还是杀菌性，可将阳性孔中的培养基接种至沙保葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud Dextrose Agar）上，或通过其他活性检测方法进行验证。

由于新化合物的作用机制尚不明确，因此在检测该化合物（本例中为一种抗菌肽；图1 和 图2）的最低抑菌浓度（MIC）之前，必须首先验证参照抗真菌药物对真菌分离株的MIC是否处于预期范围内（可参考官方指南、文献中的表格或数据），以确认实验条件适宜。若参照药物的MIC不在规定范围内，则必须重...

讨论

微量稀释试验可利用少量目标化合物分析其潜在的抗真菌活性，同时在一系列浓度下进行测试。因此，本方案推荐作为筛选潜在新型抗真菌化合物的第一步。此处提供的方案基于M27-A3方案，该方案最初设计用于协助临床选择抗真菌治疗药物，但可适用于多种新型抗真菌化合物。总体而言，本方案可重点关注提取物或化合物的理化特性。例如，由于培养基中的某些成分可能阻碍化合物与真菌细胞的相互作用，导致检测中潜在有效物质被误判为无效，如RPMI对组蛋白5（Histatin 5）的影响¹⁴。在此情况下，当RPMI产生干扰时，可选用酵母氮碱基（Yeast Nitrogen Base, YNB）缓冲液配以MOPS，pH 7作为替代培养基¹⁵。

该方案还允许在预培养条件、接种物浓度、培养温度以及对光敏感组分等方面进行修改，前提是参照抗真菌结果处于指南规定的范围内。参照抗真菌药物应基于所测试真菌物种的当前治疗方案。此外，若存在与潜在药物性质相似的参照化合物—— 例如一种已知的具有抗真菌活性的抗菌肽，可作为针对所测...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>培养基与试剂
含L-谷氨酰胺、不含碳酸氢钠的RPMI 1640培养基	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-吗啉代)丙烷磺酸 (MOPS)（我们使用的含有一个s）ódio，請補全他的名字	Sigma-Aldrich		用于配制2倍浓度RPMI培养基的缓冲液
氯化钠（NaCl）	丁â云母	1528-1	磷酸盐缓冲液（PBS）中的 137 mM
氯化钾（KCl）	J.T.Baker	3040-01	2.7 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）
磷酸氢二钠（Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	V000129	磷酸盐缓冲液（PBS）中10 mM
磷酸二氢钾（KH2PO4）	Sigma-Aldrich	60230	2 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）
BD Difco 沙氏葡萄糖肉汤	BD	238230
BD Difco 沙氏葡萄糖琼脂	BD	210950
甘油	Sigma-Aldrich	V000123	35%（溶液ção 储存？冷冻保存ção?)
无菌水			用于稀释çã药物稀释ção seriada
<强>抗真菌药物
两性霉素B	Sigma-Aldrich	A2942
氟康唑	Sigma-Aldrich	F8929
卡泊芬净	Sigma-Aldrich	PHR1160
<强>塑料
50 mL 一次性无菌离心管	Sarstedt	62.547.254
培养皿	J.Prolab	0304-5
96孔板	康宁	3595
无菌溶液储液罐	KASVI	K30-208	使用多通道移液器吸取溶液
<强>仪器与其他材料
光学显微镜	尼康	E200MV
离心	赛默飞世尔科技	MegaFuge 16R
培养箱	Ethik 技术	403-3D	设定为37° C
Shaker	新不伦瑞克科学公司	Excella E25	设定为37° C，200 转/分钟
细胞计数板，Neubauer	BOECO 德国	BOE 13
多通道移液器	HTL	5123