Per consentire la rivelazione altamente sensibile del cancro colorettale umano diffondere cellule (CRC), colonizzando tessuti, mostriamo qui un protocollo per la trasduzione efficiente delle particelle lentivirali proteina fluorescente verde (GFP) in cellule di organoid PDX-derivato CRC prima del loro iniezione nel destinatari topi, con osservazione al microscopio stereo-fluorescenza.
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Articolo metodologico
Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malgrado gli avanzamenti correnti nel trattamento del cancro umano del colon-retto (CRC), poche terapie radicali sono efficaci per la fine delle fasi di CRC. Per superare questa sfida clinica, modelli murini dello xenotrapianto di tumore utilizzando consolidate linee cellulari umane di carcinoma e molti modelli di topi transgenici con i tumori sono stati sviluppati come modelli preclinici. Essi parzialmente imitare le caratteristiche di carcinoma umani, ma spesso non riescono a riassumere gli aspetti principali delle malignità umane, compreso l'invasione e metastasi. Così, modelli alternativi che meglio rappresentano la progressione maligna in CRC umana hanno lungamente attesa.
Per l'impianto sottocutaneo di piccoli frammenti CRC sezionato chirurgicamente da un paziente mostreremo qui generazione degli xenotrapianti del tumore di derivazione paziente (PDXs). Il colon PDXs sviluppare e histopathologically assomigliano il CRC nel paziente. Tuttavia, pochi i micrometastases spontanei sono rilevabili in sezioni convenzionali degli organi commoventi distanti nel modello PDX. Per facilitare l'individuazione di disseminazione metastatica in organi distanti, abbiamo estratto le cellule del tumore organoid dalla PDXs del colon nella cultura e li infettato da lentivirus GFP prima dell'iniezione in altamente immunodeficienti Shi-NOD/scid IL2Rγnull Topi (NOG). Orthotopically iniettato PDX-derivato CRC organoid cellule costantemente forma tumori primari positiva per GFP in topi destinatari. Inoltre, spontaneamente sviluppando micrometastatico colonie che esprimono GFP in particolare vengono rilevati nei polmoni di questi topi mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, intrasplenic iniezione di CRC organoids produce frequentemente colonizzazione epatica. Presi insieme, questi risultati indicano GFP-etichettato di cellule CRC PDX-derivato organoid essere visivamente rilevabili durante un processo a più stadi definito la cascata di invasione-metastasi. I protocolli descritti includono l'istituzione di PDXs di CRC umana e cultura 3D delle corrispondenti cellule CRC organoid microlavorata in particelle lentivirali GFP.
Introduzione
Il cancro colorettale (CRC) è la seconda causa principale di morti di cancro in tutto il mondo1. La risposta insufficiente a terapie convenzionali dei pazienti con malattia in stadio avanzato indica l'inefficacia dei tentativi di curare radicalmente CRCs. Per sviluppare approcci terapeutici più efficaci, sono stati istituiti vari modelli del mouse preclinici di cancro che imitano le caratteristiche del CRC. Varie linee cellulari CRC sono stati ampiamente usati per generare gli xenotrapianti del tumore a causa della loro convenienza e facilità di manipolazione. Coltura a lungo termine di linee cellulari del cancro, tuttavia, è spesso causa di se....
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Protocollo
Il paziente fornito il consenso informato scritto e il progetto è stato approvato dal comitato etico di ricerca della facoltà di medicina dell'Università di Juntendo. Gli esperimenti del mouse sono stati approvati dal comitato etico di ricerca animale della facoltà di medicina Juntendo.
1. istituzione del CRC PDXs in topi immunodeficienti
Procedure sperimentali per stabilire PDXs CRC (passaggio 1) sono descritti nella Figura 1A.
- Preparare il tessuto primario di CRC subito dopo resezione chirurgica del tumore dal paziente.
- Lavare il tessuto primario di CRC di movim....
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Risultati
Un adenocarcinoma colorettale primario diagnosticato come moderatamente differenziato era stato resecato chirurgicamente da una femmina di 76 anni con classificazione di TNM, Stadio IIIa, seguita da chemioterapia post-operatoria. Il primario CRC cellule immunohistochemically macchiato il positivo per l'antigene carcinoembryonic, Ki-67, vaschetta-cytokeratin e caderina. Pezzi del tumore resecato anche per via sottocutanea sono stati impiantati nei topi NOG per generare il modello PDX del c.......
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Discussione
Anche se il modello di CRC PDX è stato ampiamente impiegato per studiare la crescita del tumore primario, se questo modello è applicabile anche ad indagare la metastasi del tumore non è ancora stato completamente delucidato. Le metastasi spontanee erano anche a mala pena rilevabile nel fegato e polmoni di vari segnalati del colon PDX modelli4,10. Per rilevare i micrometastases con alta sensibilità, abbiamo sviluppato un protocollo per trasdurre particelle lentivi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun potenziali conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 e 2015) per anni, il Joint Project Award (2013 e 2014) a K. M. e concede in aiuti per la ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e Tecnologia, Giappone (16K 15625 a K. Y. e 16K 15598 al Mahatma Gandhi). Siamo particolarmente grati a tutti i membri del dipartimento di chirurgia Coloproctological e patologia molecolare per utili discussioni e supporto tecnico. Ringraziamo anche Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) e Dr. Hideki Kitajima (Università internazionale di salute e benessere) per indicazioni tecniche g....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| topi NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) | L'Istituto Centrale per gli Animali da Esperimento, Kanagawa, Giappone | Alleva topi maschi di 6 settimane in condizioni prive di germi e di agenti patogeni specifici | |
| clip per ferite 2× Produzione di Natsume da 10 mm | , Giappone | #C-21-S | Autoclave prima dell'uso |
| Siringa Hamilton Dimensioni dell'ago: calibro 22 | Tokyo Science, Giappone | Disinfettare con alcool al 70% e PBS sterile. | |
| Piastra a 6 pozzetti | BMBio | #92006 | |
| Piastra a 12 pozzetti | BMBio | #92412 | |
| Tubo conico da 15 ml | Sumitono Bachelite | MS-57150 | |
| Tubo conico da 50 ml | Microtubo Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| Eppendorf | #0030120086 | Autoclave prima dell'uso | |
| Emocitometro | Erma | #03-202-1 | |
| 40μ filtro cellulare m | Corning | #352340 | |
| Matrice della membrana basale Matrigel | Corning | #354234 | Conservare le aliquepts a -20°C. Mettere su ghiaccio fino all'uso |
| Collagenasi tipo 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenasi tipo1 in 1&volte; PBS. Conservare gli aliqupt a -20 gradi C per un massimo di 1 anno |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | negozio a 4°C. |
| DMEM/F-12 con GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store a 4°C. Caldo a 37°C C prima dell'uso |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese |
| Penicillina | Gibco | #15140122 | Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Conservare a -20°C. Aggiungere al fluido lo stesso giorno dell'uso |
| Y27632, un inibitore ROCK | Wako | #253-00591 | Conservare a -20 gradi C. Aggiungere al terreno il stesso giorno dell'uso |
| Terreno di coltura | Gibco | DMEM/F-12 con integratore GlutaMAX™ integrato con il 5% di FBS, 100 U/ml di penicillina e 100 &; g/ml streptomicina. Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese. | |
| Terreno di coltura di organoidi CRC con FCS | DMEM/F-12 all'1% o al 5% con integratore GlutaMAX™ (Gibco #10565018) integrato con FCS all'1% o al 5%, 100 U/ml di penicillina, 100 &; g/ml di streptomicina, 2 ng/ml di hEGF e 10 µ M Y27632, un inibitore ROCK. Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese. | ||
| il FuGENE 6 trasfezione reggente | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0,45 µ m filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| Provette da centrifuga in polipropilene da 5 ml | Beckman Coulter | 326819 | |
| vettore PRRL-GFP | Regalo del Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Dono del Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Regalo del Dr. Robert A. Weinberg | ||
| il secchio oscillante SW55Ti rotore | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 microscopio a stereofluorescenza | Zeiss |
Riferimenti
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 9....
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Ristampe e permessi
