Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

Le sindromi mielodisplastiche (MDS) rappresentano un gruppo eterogeneo di disordini clonali sangue caratterizzati da ematopoiesi inefficace, prova morfologica della displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia mieloide acuta (AML)^{1,2 ,3,4}. Ematopoiesi inefficace è riconosciuto come un arresto di maturazione nel midollo osseo e risultati nel sangue periferico citopenie nonostante un^1,di midollo osseo ipercellulare³. L'incidenza di MDS è stato variamente stimato di 2-12 casi ogni 100.000 persone ogni anno negli Stati Uniti, e l'incidenza di MDS aumenta con l'età, rendendo questo una condizione importante per capire dato l'invecchiamento US popolazione^{3, 5}. Anche se la maggior parte dei casi di MDS non hanno nessuna eziologia libera, alcuni casi di MDS sono probabilmente dovuto l'esposizione agli agenti genotossici noti, inclusi i solventi come benzene e cancro chemioterapia⁶.

Pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno in genere acquisito mutazioni in cellule MDS⁷. Anche se relativamente raro, un numero di pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno acquisito le traslocazioni cromosomiche bilanciate che coinvolgono geni quali NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Il nostro laboratorio ha un interesse profondo traslocazioni cromosomiche, che coinvolgono il gene NUP98⁸. Topi transgenici che esprimono un transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) regolato dal promotore Vav1 e gli elementi enhancer di visualizzare tutte le caratteristiche chiave di MDS, compreso il sangue periferico citopenie, prova morfologica della displasia e la trasformazione di AML⁹ .

Sebbene MDS sono stati riconosciuti per oltre 60 anni¹⁰e sono considerati come un disordine clonale della cellula formativa, gli sforzi per attecchire cellula umana di MDS in topi immunodeficienti sono stati in gran parte infruttuosi, perché le cellule MDS integrano scarsamente^{11, 12,13,14} e i topi non sviluppano la malattia clinica. Nel tentativo di identificare quali cellule ematopoietiche possono trasmettere MDS, abbiamo girato per il modello di NHD13 e ha mostrato che noi potremmo interdigitate MDS come un'entità di malattia che ha mostrato tutti i segni cardinali di MDS umana, tra cui sangue periferico citopenie, displasia, e trasformazione da AML¹⁵. In questo rapporto, presentiamo i dettagli tecnici di questi esperimenti, nonché approcci ulteriormente frazionare ematopoietiche staminali e cellule del precursore (HSPC), nel tentativo di identificare cellule d'inizio di MDS.

Le procedure animale descritte in questo articolo sono state approvate dal National Cancer Institute a Bethesda Animal Care e Comitato di uso e sono conformi alle politiche contenute all'interno, la politica di servizio di sanità pubblica su cura umanitaria e uso di animali da laboratorio, il Animal Welfare Act e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. cella preparazione

1. Raccolta del midollo osseo cellule nucleate (BMNC)
   1. Utilizzare solo materiali sterili. Sterilizzare gli strumenti riutilizzabili usando un autoclave a vapore. Acquisto di aghi, siringhe e oggetti in plastica in contenitori sterili monouso. Effettuare tutte le manipolazioni di cellulare e dell'animale in una classe II, tipo A2 sicurezza microbiologica.
   2. Preparare la BMNCs in un 14 mL contenente 3 mL di HF2 provetta a fondo sferico (Hank equilibrata soluzione salina completati con 2% di siero fetale bovino).
   3. Eutanasia C57Bl6 topi donatore (positivi per CD45 allele CD45.2), di età in genere 2-6 mesi, utilizzando una camera di CO₂ .
   4. Sterilizzare la carcassa del mouse spruzzando etanolo al 70% su tutto il corpo con un flacone spray. La buccia dalle gambe, dal bacino fino alla caviglia.
   5. Rimuovere i femori e le tibie dalla carcassa utilizzando forbici sterili (dritto, punte acute, 11,5 cm) e forcipe (Graefe, seghettata, Larghezza punta 0,8 mm). Tagliare la relativa muscolatura chiaramente.
   6. Tagliare le estremità prossimale e distale della tibia con le forbici. Tenendo la tibia con il forcipe, inserire una siringa da 3 mL calibro 27 contenente 2,5 mL di HF2 nella cavità del midollo tibial all'estremità distale della tibia (caviglia). Lavare le cellule del midollo osseo dalla tibia con una leggera pressione in 14 mL provetta a fondo sferico.
      1. Ripetere per l'altra tibia.
   7. Tagliare le estremità prossimale e distale del femore con le forbici. Svuotamento della cavità del midollo di femore inserendo un ago di calibro 20 collegato ad una siringa da 3 mL contenente 2,5 mL di HF2 nell'estremità distale della cavità del midollo di femore e applicando la pressione delicata alla siringa.
      1. Ripetere per altre femore, raccogliendo tutti i del midollo osseo da entrambe le tibie e femori nella stessa 14 mL fondo tubo tondo.
   8. Disperdere la massa di midollo aspirando su e giù più volte con lo stesso calibro 20 ago collegato alla siringa da 3 mL.
2. Macchiatura dell'anticorpo di BMNC
   1. Conteggio BMNC. Aggiungere 20 µ l di una soluzione di acido acetico 3% a 20 µ l della sospensione BMNC generata nel passaggio 1.1.8. Poi, di contare con un emocitometro e un microscopio invertito.
   2. A pellet il BMNC mediante centrifugazione delicata a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con HF2 utilizzando 90 µ l per 10⁷ celle e aggiungere 10 µ l di anticorpo anti-lignaggio biotinilato cocktail alla sospensione di cellule.
   3. Dopo incubazione per 20 min a 4 ° C, lavare le cellule marcate con 3 mL di tampone fosfato salino (PBS).
   4. Risospendere il BMNC con 100 µ l di HF2 per 10⁷ cellule. Aggiungere 2 µ l di allophycocyanin (APC) coniugato anti-biotina anticorpo per la sospensione di eritrociti, seguita da incubazione a 4 ° C per 20 min.
   5. Sciacquare il BMNC macchiato con 3 mL di PBS e risospendere il BMNC con HF2 completati con 0,2 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) per l'ordinamento delle cellule di flusso cytometry.
3. Flusso cytometry ordinamento delle cellule di BMNC
   1. Calibrare il classificatore celle di flusso cytometry. Ottimizzare tutti i tubi di fotomoltiplicatore (PMT), scatter e parametri di fluorescenza usando le cellule non macchiate e impostare all'interno della gamma lineare di ogni rivelatore.
   2. Preparare non macchiate, PI-macchiato, e APC etichettato lignaggio cocktail celle in parallelo dal punto 1.2. Analizzare per compensazione spettrale.
   3. Discriminare le cellule doppietto di gating sequenziale di FSC-H vs SSC-H, 640-SSC-A vs 640-SSC-H e 640-SSC-S vs 640-SSC-W.
   4. Escludere le cellule non vitali utilizzando PI eccitato a 561 nm ed emissione raccolti con un filtro passa-banda 614/20. Eccitare il lignaggio APC etichettati cellule a 640 nm e raccogliere emissione con un filtro passa-banda 671/30.
   5. Registrare valori di fluorescenza come altezza di tensione e raccogliere almeno 100.000 eventi nei file di dati di modalità elenco per visualizzare le popolazioni di essere ordinati.
   6. Calcolare la compensazione spettrale dopo l'acquisizione di tre campioni di 10.000 cellule per i seguenti: senza etichetta celle, PI etichettati cellule e cocktail di anti-lignaggio anticorpo coniugato con etichettati cellule APC.
   7. Impostare tre regioni per ordinare lignaggio negativo (LN), lignaggio positiva (LP) con l'intensità di fluorescenza dim (LP1) e la popolazione di LP con fluorescenza brillante (LP2) in provette da 5 mL contenente 0,5 mL di media di 10% FBS.
   8. Celle di ordinamento utilizzando un'una goccia avvolgono e purificano la modalità di interruzione.
   9. Eseguire analisi di tipo post con 1.000 cellule totali su ogni campione ordinato per confermare la purezza e la vitalità delle cellule ordinate.
   10. Raccogliere le cellule ordinate mediante centrifugazione a 450 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare con 0,5 mL di HF2.
   11. Confermare ordinato cella numero con emocitometro e tripan blu. Regolare il numero di cellulare con HF2 per trapianto.
       Nota: Un ampio spettro di popolazioni BMNC può essere isolato per trapianto utilizzando ulteriori combinazioni degli anticorpi coniugati fluorocromo passo 1.2.2 sopra.

2. destinatario topi preparazione e trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)

1. Preparazione dei destinatari del trapianto
   1. Mantenere la veterinaria e allevamento cura dei topi Congenici destinatario (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in una struttura animale patogeni specifici (SPF) di libero.
   2. Per la decontaminazione profilattica della pista gastrointestinale, fornire acqua sterile contenente 100 mg/L di ciprofloxacina ai destinatari per 7 giorni prima dell'irradiazione della dose letale (9 Gy) e mantenere per 14 giorni dopo l'irradiazione.
   3. Fornire un'irradiazione di dose letale (9 Gy) da una fonte Cs come segue. Utilizzare un operatore addestrato, certificato di Cs. Impostare lo strumento di origine Cs a consegnare irradiazione gamma di 70 cGy/min totale del corpo. Posto 10 topi in un supporto personalizzati e inserire il supporto della camera di irradiatore. Consegnare l'irradiazione dal corpo intero di 9 Gy in 13 min e restituire i topi nelle loro gabbie.
2. Trapianto di cellule staminali ematopoietiche
   1. Mescolare wild type (WT) BMNC da un mouse di destinatario Congenici (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) ad una dose di cella di 2 x 10⁵ celle per mouse con 2-5 x 10⁴ cellule del test purificato che BMNC preparato con flusso cytometry ordinamento come descritto in 1.3 di cui sopra. Mescolare le cellule nella stessa siringa.
      Nota: Il BMNC WT forniscono un effetto con parsimonia di radiazione al destinatario mouse e consentono la sopravvivenza del mouse destinatario se le celle di prova non supportano l'ematopoiesi. Il WT BMNC utilizzato in questo tipo di esperimento espressa l'allele CD45.1 e così può essere distinto dalle cellule test usando gli anticorpi che discriminano tra CD45.1 e CD45.2. Le cellule WT BM si riferiscono a come "cellule helper", "cellule di radiazione-sparing" o "cellule concorrente".
   2. Regolare il volume di miscela delle cellule a 200 µ l per destinatario utilizzando HF2 sterile per facilitare l'iniezione.
   3. Le miscele di cella per i topi irradiati letalmente di destinatario via endovenosa vena iniezione coda utilizzando una siringa da 1 mL e un ago 28 calibri, entro 24 h di irradiazione del trapianto. Posizionare la coda di topo sotto una lampada di calore, come calore conduce alla dilatazione della vena della coda.
      Nota: Tutti i topi destinatari alla fine dello studio di eutanasia e valutare la progressione di malattia di autopsia, l'istologia e citometria a flusso.

3. engraftment analisi mediante citometria a flusso

1. Per valutare engraftment delle cellule dei donatori, raccogliere sangue periferico (PB) dai topi destinatari alla 6a settimana, settimana 12 e 16 ° settimana dopo il trapianto.
2. Scaldare i destinatari nella gabbia con lampada di calore per circa 1 min e posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta.
3. Tagliare la vena della coda con un bisturi (lama 10, manico per bisturi #3) e raccogliere 100 µ l di PB per ogni destinatario utilizzando un tubo di microcapillary contenenti EDTA come anticoagulante.
4. Dividere il PB raccolto in due aliquote uguali inserendo 50 µ l in una microcentrifuga sterile. Utilizzare un'aliquota per un conteggio di anima completa (CBC) automatizzato (eseguita presso il Core di istopatologia NCI) e utilizzare la seconda aliquota per la macchiatura dell'anticorpo e citometria a flusso.
5. Per rilevare il engraftment erogatore da citometria a flusso, lisare i globuli rossi (RBC) aggiungendo 1 mL di tampone di Lisi ipotonica RBC (8,29 g/L di NH₄Cl, 1 g/L di KHCO₃, 0,037 g/L di Na₂EDTA, pH 7,2) a 50 µ l del PB raccolti. Vortexare il campione di miscelare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
6. Centrifugare il lisato PB a 4.600 x g per 1,5 min attentamente aspirare il supernatante e scartare.
7. Parzialmente di disturbare il pellet cellulare delicatamente toccando o "sfogliando" il fondo della provetta. Aggiungere 1,3 mL di PBS nel pellet si trova in provetta e centrifugare a 4.600 x g per un minimo di 1,5 accuratamente aspirato e scartare il surnatante.
8. Disturbare il pellet cellulare toccando o sfogliando e aggiungere 200 µ l di HF2 completati con 5% di siero del ratto per il pellet cellulare.
9. Aggiungere anticorpo anti-CD45.2 (1 µ l) coniugato con allophycocyanin (APC) per la sospensione delle cellule. Incubare a 4 ° C per almeno 30 min e brevemente vortice la miscela.
10. Dopo la colorazione, lavare le cellule due volte come sopra descritto e risospendere con 400 µ l di HF2 completati con 1 µ g/mL di PI.
11. Rilevare l'attecchimento utilizzando un citometro a flusso di 4 colori. Ottenere ulteriori informazioni sui tipi di cellulari all'interno del sangue periferico mediante l'aggiunta di altri anticorpi per rilevare tipi cellulari specifici, quali linfociti B o T.
12. Registrare dati di attecchimento seriale utilizzando un foglio di calcolo per consentire un'ulteriore analisi dei dati.

Vi mostriamo le figure rappresentative per risultati di molti esperimenti. La figura 1 Mostra un rappresentante flusso cytometry ordinamento esperimento. Durante il differenziamento ematopoietico normale, come le cellule diventano impegna un specifico lineage ematopoietico, acquisiscono lignaggio-definizione di indicatori di superficie delle cellule e perdere il potenziale di auto-rinnovamento. Pertanto, in topi wild-type, autorinnovamento delle cellule staminali è confinata a BMNC lignaggio-negativo. In questo esperimento, abbiamo risolto BMNC dal midollo osseo NHD13 in cellule di lignaggio-positive positivo e alto lignaggio-negativo, basso lignaggio. Questi ordinati cellule poi sono state trapiantate nei destinatari WT per determinare la capacità di auto-rinnovamento.

La figura 2 Mostra i risultati di un esperimento separato, in cui lignaggio cellule negative o indifferenziate cellule da donatori di NHD13 con MDS sono state trapiantate in irradiati letalmente destinatari WT. Le cellule del donatore di NHD13 espresso il marcatore di superficie delle cellule CD45.2, mentre le cellule di concorrente WT (cfr. sezione 2.2.1 sopra) espresso il marcatore di superficie delle cellule CD45.1. La figura 3 Mostra l'analisi di engraftment seriale indifferenziati NHD13 BMNC o lignaggio-negativo NHD13 BMNC. Dopo circa 16 settimane, le cellule NHD13 prevalere le cellule WT, come dimostra la crescente percentuale di cellule CD45.2 + nel sangue periferico. Figura 4 Mostra un esempio di trasformazione leucemica da un mouse trapiantato con cellule NHD13 MDS.

Figura 1: flusso cytometry ordinamento strategia di BMNC macchiato con l'anticorpo di lignaggio cocktail. Ogni scatola rettangolare sulla trama del puntino rappresenta la popolazione delle cellule ordinata per il trapianto valutare la funzione delle cellule. R4, lignaggio negativo; R5, basso lignaggio positivo; R6, positivo di alto lignaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: profili di FACS rappresentativi per l'analisi di engraftment usando donatore specifico anticorpo anti-CD45.2. Destinatario BMNC è stato trapiantato con 1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) e cellule del destinatario LNBM con 5 X 104 NHD13 lignaggio negativo BM (CD45.2 +). In ogni caso, 2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) sono stati utilizzati come celle di concorrente. Numeri per il positivo CD45.2 rappresentano caselle superiore e inferiore (derivato da NHD13 donatore) e CD45.2 negativo (derivato da cellule WT concorrente), rispettivamente, in post-trapianto 6 settimane e 24 settimane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: cinetica di Engraftment di singoli destinatari dopo trapianto. Ogni linea nel grafico viene illustrato saggi di attecchimento seriale di un mouse a singolo destinatario. I destinatari BMNC sono stati trapiantati con 1 X 106 cellule di NHD13 tutta BMNC e destinatari LNBM sono stati trapiantati con 5 X 104 di NHD13 lignaggio BM negativo dopo l'ordinamento. NHD indica NHD13 donatore. BM, BMNC destinatari topi; LNBM, destinatario di BM negativo lignaggio; PBMC, cellule mononucleate di sangue periferico. In tutti i casi, le cellule del donatore NHD13 gradualmente prevalere le cellule WT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: colorazione di May-Grünwald Giemsa (MGG) del midollo osseo (BM) dal destinatario MDS che ha progredetto per AML. Si noti la presenza di numerose esplosioni e forme immature. Le frecce indicano gli scoppi e punte di freccia indicano forme immature. Originale 400 X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Non abbiamo nulla di divulgare.