Summary
我们描述了利用造血干细胞移植 (HSCT) 来评估基因工程造血细胞的恶性潜能。HSCT 可用于评估体内各种恶性造血细胞, 并产生大量小鼠骨髓增生异常综合征 (MDS) 或白血病, 以评估新的治疗方法。
Abstract
骨髓增生异常综合征 (MDS) 是由无效造血、外周血血细胞减少、发育不良以及转化为急性白血病的倾向所定义的多种造血干细胞紊乱群。NUP98-HOXD13 (NHD13) 转基因小鼠在外周血血细胞减少、发育不良和急性白血病的转化方面概述了人类 MDS。我们以前证明, mds 可以通过移植 mds 骨髓有核细胞 (BMNC) 从基因工程鼠与 mds 转移到野生型受体。为了更清楚地了解 MDS 原细胞, 我们开发了移植特定的、immunophenotypically 定义的造血亚群的方法。本文描述了造血干细胞和祖细胞特定种群的分离和移植过程。在移植后, 我们描述了评估移植的效率和捐献者 MDS 细胞持续性的方法。
Introduction
骨髓增生异常综合征 (MDS) 代表了一系列不同的无性系血症, 其特点是造血功能无效, 形态学证明发育不良, 并倾向于转化为急性髓系白血病 (AML)1,2 ,3,4。无效造血被认为是在骨髓中的成熟逮捕, 并导致外周血血细胞减少, 尽管 hypercellular 骨髓1,3。mds 的发病率在美国每年有不同程度地估计为每10万人2-12 例, mds 的发病率随着年龄的增长而增加, 这是一个重要的条件来理解, 因为美国人口老龄化3, 5。虽然大多数 mds 病例没有明确的病因, 但有些 mds 的病例被认为是由于接触已知的毒性剂, 包括苯等溶剂和癌症化疗6。
mds 患者通常在 mds 细胞7中获得突变。虽然相对少见, 一些 MDS 患者获得了平衡染色体易位涉及基因, 如 NUP98, EVI1, RUNX1, MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman)。我们的实验室对染色体易位有长期的兴趣, 其中涉及 NUP98 基因8。通过 Vav1 启动子和增强因子调控的 NUP98-HOXD13 (NHD13) 转基因的转基因小鼠显示了 MDS 的所有关键特征, 包括外周血血细胞减少、发育不良的形态学证据以及转化为 AML9.
虽然 mds 已被确认超过60年10, 并被认为是克隆干细胞紊乱, 但在 immunodeficient 小鼠嫁接人 MDS 细胞的努力基本上不成功, 因为 mds 细胞嫁接差11, 12、13、14 、小鼠不发育临床疾病。为了确定哪些造血细胞能够传输 MDS, 我们转向了 NHD13 模型, 并表明我们可以嫁接 mds 作为一个疾病实体, 它显示了人类 mds 的所有基本特征, 包括外周血血细胞减少、发育不良和转换到 AML15。在本报告中, 我们介绍了这些实验的技术细节, 以及进一步分级造血干细胞和前体细胞 (HSPC) 的方法, 旨在确定 MDS 启动细胞。
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Protocol
本条所描述的动物程序是由美国国家癌症研究所在贝塞斯达动物护理和使用委员会批准的, 并符合公共卫生服务政策中有关人道护理和使用实验动物的政策,动物福利法, 以及对实验室动物的护理和使用指南。
1. 细胞制剂
- 收集骨髓有核细胞 (BMNC)
- 只使用无菌材料。使用蒸汽蒸气釜灭菌可再用的仪器。在单用无菌容器中购买针头、注射器和塑料制品。在第二类中执行所有动物和细胞操作, 类型 A2 生物安全柜。
- 在14毫升的圆底管中准备 BMNCs, HF2 3 毫升 (汉克的平衡盐溶液补充2% 胎牛血清)。
- 弄死 C57Bl6 捐献小鼠 (阳性 CD45 等位基因 CD45.2), 年龄通常为2-6 月, 使用 CO2室。
- 用喷雾瓶在整个身体上喷洒70% 乙醇, 对老鼠胴体进行消毒。从腿部剥离皮肤, 从骨盆向下到脚踝。
- 使用无菌剪刀 (直, 锐/锐, 11.5 厘米) 和钳 (Graefe, 锯齿, 0.8 毫米尖端宽度) 从胴体中取出股骨和胫骨。清晰地修剪附着的肌肉。
- 用剪刀切开胫骨的近端和远端。用钳夹住胫骨, 在胫骨远端 (踝部) 的胫骨骨髓腔内插入一个含有2.5 毫升 HF2 的27口径3毫升注射器。用温和的压力将胫骨的骨髓细胞冲洗成14毫升圆底管。
- 对其他胫骨重复。
- 用剪刀切开股骨的近端和远端。在股骨骨髓腔的远端插入一根20口径的针, 并将其连接到3毫升的注射器上, 并对注射器施加温和的压力, 以冲洗大腿骨髓腔。
- 重复为其他股骨, 收集所有的骨髓从胫骨和股骨在同一14毫升圆底管。
- 用与3毫升注射器相同的20口径针, 通过多次吸上和下吸来分散骨髓质量。
- BMNC 抗体染色
- BMNC 伯爵添加20µL 3% 醋酸溶液到20µL 的 BMNC 悬浮在步骤1.1.8 产生。然后, 用 hemocytometer 和倒置显微镜计数。
- 以 450 x g 为5分钟, 在4摄氏度以温和离心的方法将 BMNC 颗粒。并用重悬颗粒与 HF2 使用90µL 每 107细胞和添加10µL 生物素化抗血统抗体鸡尾酒的细胞悬浮。
- 在4摄氏度孵化20分钟后, 用3毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗染色细胞。
- 并用重悬 BMNC 100 µL HF2 每 107细胞。添加2µL 复方阿司匹林 (APC) 共轭抗生物素抗体的细胞悬浮, 其次是孵化4摄氏度20分钟。
- 冲洗染色 BMNC 与3毫升 PBS 和并用重悬 BMNC 与 HF2 补充0.2 µg/毫升碘碘 (PI) 流式细胞术细胞排序。
- BMNC 流式细胞仪的分选
- 校准流式细胞仪。使用无瑕单元格优化所有光电倍增管 (并联机床)、散射和荧光参数, 并在每个探测器的线性范围内设置。
- 准备无瑕, PI 染色, 和 APC 标记血统鸡尾酒细胞平行从步骤1.2。频谱补偿分析。
- 对双细胞进行连续门控, 即 640 -ssc 与 640-ssc-h、640- ssc 与 640-ssc-W.
- 使用 561 nm 激发的 PI 和614/20 波段通滤波器收集的发射排除无法成活细胞。激发谱系 APC 标记细胞在 640 nm 和收集发射与671/30 波段通滤波器。
- 将荧光值记录为电压高度, 并在列表模式数据文件中收集至少10万个事件以可视化要排序的人口。
- 计算光谱补偿后, 获得三样品1万细胞为以下: 未标记的细胞, PI 标记细胞, 和抗血统抗体鸡尾酒共轭与 APC 标记细胞。
- 设置三个区域对沿袭阴性 (LN), 血统阳性 (LP) 与暗淡荧光强度 (LP1), 和 LP 人口与明亮的荧光 (LP2) 成5毫升管含有0.5 毫升10% 的血清介质。
- 使用一个放置信封和净化中止模式对单元格进行排序。
- 在每个已排序的样本上执行1000个总单元格的开机自检排序分析, 以确认已排序的单元格的纯度和生存能力。
- 以 450 x g 为5分钟, 在4摄氏度和并用重悬细胞颗粒上, 用0.5 毫升的 HF2 来收集排列的细胞。
- 用 hemocytometer 和台盼蓝确认有序的细胞数。用 HF2 调整细胞数以移植。
注意: 在上述步骤1.2.2 中, 使用 fluorochrome 共轭抗体的附加组合, 可以分离出广泛的 BMNC 种群。
2. 受体小鼠的制备和造血干细胞移植 (HSCT)
- 准备移植接受者
- 在特定病原体免费 (SPF) 动物设施中, 维持同类系受体小鼠 (B6-LY5.1/Cr、CD45.1) 的兽医和畜牧业护理。
- 对胃肠道进行预防性去污, 在致死剂量 (9) 照射前7天内, 向接受者提供含环丙沙星100毫克/升的无菌水, 并在照射后维持14天。
- 从 Cs 源提供致命剂量 (9) 照射, 如下所示。使用训练有素的、经认证的 Cs 操作员。设置 Cs 源仪器提供 70 cGy/分钟全身伽玛照射。将10只老鼠放在一个定制设计的支架上, 将持有者插入照射器室。在13分钟内提供9的全身照射, 并将老鼠送回笼子。
- 造血干细胞移植
- 混合野生类型 (BMNC) 从同类系接受鼠标 (B6 LY5.1/Cr, CD45.1) 的细胞剂量 2 x 105细胞每只老鼠与2到 5 x 104细胞纯化试验 BMNC 制备的流式细胞仪排序如上文1.3 所述。在同一注射器中混合细胞。
注意: 如果测试单元不支持造血, 则 BMNC 对接收鼠标提供辐射保留效果, 并允许接收鼠标存活。这类实验中使用的 BMNC 表达 CD45.1 等位基因, 从而可以区别于使用 CD45.1 和 CD45.2 的抗体的检测细胞。BM 细胞被称为 "辅助细胞", "辐射保留细胞", 或 "竞争者细胞"。 - 使用无菌 HF2, 以促进注射, 将细胞混合物体积调整为每位接受者的200µL。
- 通过静脉注射1毫升注射器和28口径针, 在24小时内照射, 将细胞混合物移植到致命照射的受体小鼠体内。把鼠标的尾巴放在一盏热灯下, 因为热会导致尾部静脉扩张。
注: 弄死所有受体小鼠在研究结束时, 通过尸检、组织学和流式细胞术对疾病进展进行评估。
- 混合野生类型 (BMNC) 从同类系接受鼠标 (B6 LY5.1/Cr, CD45.1) 的细胞剂量 2 x 105细胞每只老鼠与2到 5 x 104细胞纯化试验 BMNC 制备的流式细胞仪排序如上文1.3 所述。在同一注射器中混合细胞。
3. 流式细胞术的植入测定方法
- 为了评估捐献者细胞植入, 在第六周、第十二周和第十六周的移植后, 收集受体小鼠的外周血 (PB)。
- 将笼中的接收器加热1分钟左右, 将鼠标放入抑制剂。
- 用手术刀 (刀片 10, #3 手术刀手柄) 切开尾部静脉, 并使用含有 EDTA 作为抗凝剂的 microcapillary 管收集每位接受者的铅的100µL。
- 将所收集的 PB 分成两个相等的整除数, 在无菌离心管中放置50µL。使用一个整除自动完整的血液计数 (CBC) (执行在病理学核心), 并使用第二整除抗体染色和流式细胞术。
- 用流式细胞仪检测供体植入, 溶解红细胞 (红细胞) 通过添加1毫升低渗红细胞裂解缓冲 (8.29 克/升的 NH4氯, 1 克/升的 KHCO3, 0.037 克/升的 Na2EDTA, pH 7.2) 到50µL 的收集 PB。在室温下将样品旋匀, 孵育10分钟。
- 离心的裂解 PB 在 4600 x g 1.5 分钟, 小心地吸入上清和丢弃。
- 通过轻轻敲击或 "弹" 管底部来部分破坏细胞颗粒。将1.3 毫升的 PBS 放入试管中的颗粒中, 离心机在 4600 x g 处进行1.5 分钟的抽吸并丢弃上清。
- 通过敲击或弹击来破坏细胞颗粒, 并添加200µL HF2, 并补充5% 大鼠血清对细胞颗粒。
- 添加抗 CD45.2 抗体 (1 µL) 共轭与复方阿司匹林 (APC) 的细胞悬浮。孵育在4摄氏度至少30分钟, 并简要地漩涡的混合物。
- 染色后, 洗两次以上所述的细胞, 并用重悬与400µL 的 HF2 补充1µg/毫升的 PI。
- 使用4色流式细胞仪检测植入。通过添加额外的抗体来检测特定细胞类型, 如 B 或 T 淋巴细胞, 获取外周血中细胞类型的附加信息。
- 使用扩展页记录串行植入数据, 以便进一步分析数据。
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Representative Results
我们展示了几个实验结果的代表性数字。图 1显示了一个典型的流式细胞分选实验。在正常的造血分化过程中, 当细胞致力于特定的造血谱系时, 他们获得了谱系定义的细胞表面标记物, 失去了自我更新的潜能。因此, 在野生型小鼠中, 干细胞自我更新仅限于血统阴性的 BMNC。在本实验中, 我们将 BMNC 从 NHD13 骨髓中分类为谱系阴性、低血统阳性和高谱系阳性细胞。然后将这些排序后的细胞移植到重量级受体中, 以确定自我更新能力。
图 2显示了一个单独的实验结果, 其中从 NHD13 捐献者的沿袭阴性细胞或未排序的细胞移植到致命照射的剂量受体。NHD13 捐献细胞表达 CD45.2 细胞表面标记物, 而小波竞争细胞 (见上文2.2.1 节) 表达 CD45.1 细胞表面标记。图 3显示了对未排序的 NHD13 BMNC 或沿袭阴性 NHD13 BMNC 的串行植入分析。大约16周后, NHD13 细胞击败的细胞, 如所示的百分比增加 CD45.2 + 细胞在外周血。图 4显示了一个 NHD13 MDS 细胞移植的小鼠白血病转化的例子。
图 1: BMNC 染色的流式细胞仪分选策略.点图上的每个矩形框表示为 HSCT 排序的单元格填充以计算单元函数。R4, 血统阴性;R5, 低血统阳性;R6, 高血统阳性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用捐赠者特异性抗 CD45.2 抗体的植入分析的代表性的流式分析.BMNC 接受者移植与 1 x 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) 和 LNBM 接收者与 5 X 104 NHD13 血统阴性 BM 细胞 (CD45.2 +)。在每种情况下, 2 x 105 BMNC (CD45.1 +) 被用作竞争对手细胞。上、下框中的数字表示 CD45.2 阳性 (来源于 NHD13 捐献者) 和 CD45.2 阴性 (来自体重竞争细胞), 分别在移植后6周和24周。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 移植后个体接受者的植入动力学.图中的每一行都显示单个收件人鼠标的串行植入检测。BMNC 受体移植与 1 x 106细胞 NHD13 全 BMNC, LNBM 接受者移植 5 X 104 NHD13 血统阴性 BM 后排序。NHD 表示 NHD13 捐献者。BMNC 受体小鼠;LNBM, 血统否定的 BM 接受者;PBMC, 外周血 mononucleated 细胞。在所有情况下, NHD13 捐献细胞逐渐击败。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 可 Grünwald 姬姆萨 (BM) 从 MDS 接受者身上染色, 进展为 AML.注意许多爆炸和未成熟的形式的存在。箭头表示爆炸, 箭头表示不成熟的形式。原始400X。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
虽然 mds 是一种克隆造血干细胞紊乱, 但 mds "茎" 或启动细胞尚未被描绘出来。我们以前证明, MDS 可以移植到小鼠使用骨髓从 NHD13 小鼠的 HSCT, 其特点是 macrocytic 贫血, 白细胞减少, 中性粒细胞, 和形态学证据的发育不良15。此外, 竞争性重写化验发现 NHD13 骨髓细胞的生长优势。综合起来, 这些发现意味着存在 MDS 干细胞或启动细胞。目前正在进行更多的实验, 目的是通过更明确的茎和祖细胞标记 (CD150、CD48、c 试剂盒和 Sca-1)16结合血统, 改进 MDS 启动细胞15的免疫表型特性。本协议中描述的标记染色方法。
使用 NHD13 小鼠识别 MDS 启动细胞涉及广泛的流式细胞术分类程序。原 BMNCs 的体内操作会使细胞受到压力, 可能导致细胞死亡或功能丧失。因此, 应努力减少前体操作时间, 包括流式细胞仪分选时间。流式细胞仪和流动动力学的制造者和模型是额外的变量, 可能会影响细胞在排序后的生存能力。HSCT 程序需要通过血管注入细胞。虽然尾静脉注射可能是一个更具挑战性的技术比复古轨道注射, 在我们的经验, 尾静脉注射可以执行比复古轨道注射更迅速, 因为接受小鼠没有麻醉的尾部静脉注射。注射容积的限制 (最大150µL) 是17号复古轨道注射的另一个问题, 因为较高的细胞浓度可能会导致细胞制备过程中细胞的进一步丧失, 如注射器壁上的细胞的剪切和针。
尽管这些实验集中在 MDS 的 NHD13 模型上, 但这里描述的 HSCT 分类和移植方法可以用于任何基因工程的老鼠。除了确定自我更新造血细胞的特性外, 这种移植方法还可用于其他目的。例如, 如果一个人想要获得一大群小鼠骨髓, 以评估小分子治疗的效果, 可以通过移植大鼠的 mds (HSCT) 来生成一个大型队列 (30 + 小鼠). 或者, 可以逆转该策略。为了治愈 mds 的小鼠, NHD13 小鼠可以移植到 BM, 通过评估表达 CD45.1 的造血细胞比例 (标记 bm) 而不是 CD45.2 (这标志着 mds), 可以对移植的成功进行监测。18。
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Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家癌症研究所、国立卫生研究院 (格兰特号010378和 BC 010983) 的校内研究计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
- Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
- Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
- Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
- Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
- Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
- Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
- Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
- Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
- Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
- Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
- Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
- Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).
