Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.

Abstract

Con il crescente interesse per la biologia del RNA e l'impiego di molecole di RNA in sofisticate applicazioni biotecnologiche, i metodi per produrre grandi quantità di RNA ricombinante sono limitati. Qui, descriviamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli basato su co-espressione di una molecola chimerica che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Viroidi sono relativamente piccole, non codificanti, altamente abbinati in base RNAs circolari che sono infettivi per piante superiori. L'host pianta tRNA ligasi è un enzima reclutato da viroidi che appartengono alla famiglia Avsunviroidae, quali melanzane viroid latente (ELVd), per mediare circularization di RNA durante la replica di viroide. Anche se ELVd non replica in Escherichia coli, un precursore di ELVd è efficientemente trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli ed elaborato dai ribozimi hammerhead incorporato nelle cellule batteriche e i monomeri risultanti sono circolarizzazione della co-espressi ligasi di tRNA raggiungendo una notevole concentrazione. L'inserimento di un RNA di interesse in patibolo ELVd consente la produzione di decine di milligrammi di RNA ricombinante per litro di coltura batterica in condizioni normali di laboratorio. Una frazione principale del prodotto RNA è circolare, una caratteristica che facilita la purificazione del RNA ricombinante ad omogeneità virtuale. In questo protocollo, un corrispondente di DNA (cDNA) complementare al RNA di interesse viene inserito in una particolare posizione del cDNA ELVd in un plasmide di espressione che viene utilizzata, lungo il plasmide per co-esprimere melanzana-ligasi tRNA per trasformare e. coli. Co-espressione di entrambe le molecole sotto il controllo di promotori costitutivi forti porta alla produzione di grandi quantità di RNA ricombinante. il RNA ricombinante può essere Estratto da cellule batteriche e separato dalla massa di RNA batterico, approfittando della sua circolarità.

Introduzione

A differenza del DNA e proteine, protocolli per la produzione di semplice, efficiente ed economica di grandi quantità di RNA non sono abbondanti. Tuttavia, ricerca e industria domanda quantità crescenti di queste biomolecole per studiare le loro proprietà biologiche uniche¹, o per essere impiegati in sofisticate applicazioni biotecnologiche, tra cui il loro uso come aptameri altamente specifico ², agenti terapeutici³o pesticidi selettiva⁴. Sintesi chimica e trascrizione in vitro sono comunemente usati nella ricerca per produrre RNA. Tuttavia, questi metodi comportano limita....

Protocollo

1. plasmide costruzione

1. Amplificare mediante PCR (o da trascrizione d'inversione PCR se partendo da un modello di RNA) il cDNA corrispondente al RNA di interesse utilizzando primer con 5' estensione che consente un assemblaggio nel plasmide di espressione. Per evitare indesiderate mutazioni, utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
   1. Per inserire il cDNA nel plasmide di espressione di Gibson Assemblea²⁰, aggiungere le seguenti estensioni di 5' per gli iniettori PCR: in avanti, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; inverso, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X rappre....

Risultati

Per produrre RNA di ricombinante in e. coli usando il sistema ELVd-derivato¹², il RNA di interesse si innesta in un'impalcatura di RNA ELVd. Questo RNA chimerico è co-espresso lungo la melanzana ligasi di tRNA in e. coli. Una volta elaborati, spaccati e circolarizzazione, il RNA chimerico circolare, dalla quale sporge il RNA di interesse, costituisce probabilmente una ribonucleoproteina complessa con l'enzima di melanzane co-espresso che raggiunge.......

Discussione

Mentre la ricerca i requisiti di struttura coinvolti nel riconoscimento della melanzana ligasi di tRNA ed ELVd sequenza, abbiamo notato che co-espressione di entrambe le molecole nel non host Escherichia coli ha condotto ad un grande accumulo imprevisto di viroide circolare forme in cellule batteriche¹⁹. Abbiamo capito che il grande accumulo di viroide RNA in e. coli era più probabilmente la conseguenza di cheesprimono una molecola di RNA altamente stabile, ad esempio il relativa.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarosio	Conda	8010	D1 basso EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acido acetico	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Bromuro di etidio	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel Recupero del DNA	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentratore	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Triptone	Introne Biotechnology	Ba2014
Estratto di lievito	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillina	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-dimetilformammide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmide	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Cloramfenicolo	Duchefa	C 0113.0025
Glicerolo	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Fenolo	Scharlau	FE04791000	90%
Cloroformio	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF colonna	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
Ä Sistema di cromatografia liquida KTAprime plus	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N' -metilenbisacrilammide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Acido borico	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xilene cianolo	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acriloil)cistamina	Sigma-Aldrich	A4929-5G