Summary
ウイロイド足場や植物に興味の RNA を含むキメラ RNA の共発現による大腸菌の組換え RNA の大量に生産するためのプロトコルを提案するここでは、tRNA のリガーゼ。主な製品は、同質性に浄化を促進する円形分子です。
Abstract
RNA 生物学とバイオ テクノロジーの高度なアプリケーションで RNA 分子の使用の関心の高まり、大量の組換え Rna を生成する方法が制限されます。ここでは、多量のウイロイド足場や植物に興味の RNA を含むキメラ分子の共発現による大腸菌の組換え RNA を生成するプロトコルについて述べる tRNA のリガーゼ。ウイロイドは、高等植物の感染性は比較的小さく、非コーディング、高いベース対の円形 Rna です。ホスト植物 tRNA リガーゼ ウイロイド レプリケーション中に RNA 環状を仲介するAvsunviroidae、ナスの潜在ウイロイド(ELVd) などの家族に属しているウイロイドによって募集される酵素であります。ELVd が大腸菌では複製されませんが、ELVd 前駆体が効率的にエシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼによる転写し細菌のセルに埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理し、結果モノマーによって円形が、共発現 tRNA のリガーゼ顕著な濃度に達する。ELVd 足場に関心の RNA の挿入組換え RNA 標準実験室の条件で細菌培養のリットル当たりのミリグラムの数十のことができます。RNA 製品の主要な割合は円形で、仮想の同質性に組換え RNA の精製を容易にする機能。このプロトコルでは関心の RNA に対応する相補的 DNA (cDNA) が、共同ナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドに沿って変換するためE. 大腸菌発現プラスミドの ELVd cDNA の特定の位置に挿入されます。強い構成プロモーターの制御の下で両方の分子の共発現は、多量の組換え RNA の生産に します。組換え RNA を細菌の細胞から抽出した、その循環を利用して細菌の Rna の大部分から分離することができます。
Introduction
DNA やタンパク質と対照をなして、簡単、効率的でコスト効果の高い生産多量の RNA のためのプロトコルは豊富ではないです。ただし、彼らのユニークな生物学的特性の1を調査するまたはで使用されるこれらの生体分子の量を増やす研究と産業の需要が特異性の高いアプタマーとして彼らの使用を含むバイオ テクノロジー アプリケーションを洗練された2、治療薬3、または選択的な殺虫剤4。生体外のトランスクリプションと化学合成の研究では、RNA を生成するが使用されます。ただし、これらのメソッドは、大量の製品が必要な場合の重要な制限を伴います。論理の代替は、細胞の仲間から関心の Rna を分離する精製プロセスに続いて、生きた細胞の内因性転写機械を使用することです。この戦略は、次の研究室向けなど、細菌の細胞における組換え Rna を生成する手法が開発されたエシェリヒア属大腸菌5または、海洋紫光合成アルファ-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum6。 細菌における遺伝子組換え RNA を生成するほとんどのメソッドはネイティブの非常に安定した RNA の足場の式に依存、tRNA または、rRNA、関心の RNA が、挿入7のようです。余分な RNA の存在が下位アプリケーション8の問題の場合、これはキメラ分子から関心の RNA の要否を課しています。組換え RNA バイオ テクノロジーのもう一つの概念は、製品自体がありますまたは関心9、RNA の安定性を高める保護戦略として使用する組換えリボ核蛋白質複合体の生産 10。同様に、円形の Rna の生産より安定した製品11を生成するための戦略として提案されています。
我々 は最近多量の上記の概念の 3 つに参加するエシェリヒア属大腸菌の組換え RNA を生成する新しい方法を開発した: 非常に安定した円形 RNA 足場への関心の RNA との共発現の挿入、遺伝子組換えの RNA 相互作用の蛋白質を持つ可能性が高い安定したリボ核蛋白質の複雑なを生成する細菌の顕著な量の蓄積は細胞12です。以前の開発と対照をなして完全にエシェリヒア属大腸菌、すなわちウイロイドに外国人、RNA 足場を使用しました。ウイロイドは非常に特定のタイプのみによって構成され、比較的小さい (246 401 nt) 高等植物の病原菌の円形の RNA の高いベース対13。興味深いことに、ウイロイドが非コード Rna と、独自のタンパク質からヘルプはありません、彼らが感染したホスト14で複雑な感染サイクルを完了することができます。これらのサイクルは、核や葉緑体、ウイロイド家族によって RNA を複製-PospiviroidaeまたはAvsunviroidae、それぞれ、感染した植物と宿主の防御的な応答の回避運動。ウイロイドは裸円形 RNA、感染植物細胞の敵対的な環境で生き残るために持っていることの結果として、本質的に最も安定した Rna にランクする必要があります。このプロパティは、バイオ テクノロジーの手法で組換え RNA を安定させるために足場として特に適してウイロイドをすることができます。さらに、新しいメソッドは、相互作用の植物蛋白質を持つウイロイド足場の共発現に基づいています。ウイロイドは、ホスト プロセスの別のステップを触媒する酵素を募集してローリング サークル メカニズムを介して複製されます。特にいくつかウイロイド、具体的に家族のAvsunviroidae15に属するものには、リボザイムもレプリケーションに関与しているが含まれています。ウイロイド種に応じてウイロイド Rna の転写は RNA ポリメラーゼ II のホストまたはクロロプ ラストのエンコードされた核 RNA ポリメラーゼ (NEP) によって媒介されます。ウイロイド処理ホストにより触媒されると思われる III 型 RNase オリゴマーの RNA をリボザイムとウイロイドの中間体は自己複製中に切断が。最後に、結果のウイロイド モノマーが円形、ウイロイド家族によってホスト DNA リガーゼ 1 または tRNA のリガーゼ16,17のクロロプ ラストのアイソ フォームで。この最後の酵素は、ナスの潜在ウイロイド(ELVd)18などの家族Avsunviroidaeウイロイドの単量体の形態の結紮に関与しています。
ナス (ナスl.) によって認識を決定する ELVd のシーケンスと構造的要件を分析する作業の過程で tRNA のリガーゼ、エシェリヒア属大腸菌の両方の分子の共発現に基づく実験システムを設定19. 単位よりも長い ELVd 成績証明書は、自己効率的に埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによるエシェリヒア属大腸菌のセルでクリーブ、結果ウイロイドの単量体 5'-水酸基と 2'、3'-リン酸ジエステル テルミニいた私たちは気づいた共発現ナス tRNA のリガーゼによって効率的に円形。さらに、生じる円形ウイロイド RNA は、内因性 Rrna12を越えるエシェリヒア属大腸菌、予期しない高濃度に達した。複製中間体の不在では、これらの細菌細胞の ELVd RNA を増幅の欠如が示されます。興味深いことに、ウイロイド分子の特定の位置における異種 Rna の挿入は、円形のウイロイド由来 Rna12の蓄積でそれなりの効果を持っていた。これらの観測では、大量の組換え細菌における Rna を生成する方法を想像できた。この方法で ELVd cDNA に関心の Rna に対応する Cdna が挿入されます、結果の想像上の RNA は強力な構成のプロモーターを介して, 大腸菌で発現します。動作するようにシステムの大腸菌はナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドの共同変換しなければなりません。ELVd 派生ユニットよりも長くトラン スクリプトが埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理され、適切なテルミニを結果として得られるモノマーを認識し、共発現の tRNA のリガーゼによって円形します。このように、関心の RNA はウイロイド円形分子から成る非常に安定した円形の足場に挿入されます。この組換え想像上の RNA はおそらく更にエシェリヒア属大腸菌の細胞内のリボ核蛋白質 tRNA のリガーゼとの相互作用を介して複雑な形成による安定化します。このメソッドを使用して (以下のプロトコルを見なさい)、RNA アプタマー、ヘアピン Rna とその他の構造化された Rna 簡単に万人通常の実験室の条件で大腸菌文化の 1 リットルあたりミリグラムの量で生産され撮影の同質性に浄化されました。真円度12の利点。
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Protocol
1. プラスミド構築
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逆転写 PCR RNA テンプレートから始める場合 (または) pcr 法による増幅 cDNA 発現プラスミドにアセンブリを許可する 5' 拡張子のプライマーを使用して興味の RNA に対応します。望ましくない突然変異を避けるため、ハイファイ DNA ポリメラーゼを使用します。
- ギブソン アセンブリ20によって、発現プラスミドの cDNA を挿入する次の 5' 拡張子を PCR のプライマーに追加: 前方、5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3';逆、5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3';X は、関心の RNA のターミナルの両端に核酸の相同性を表します。
- 30 間インキュベート 98 ° c、s に続いて 10 の 30 サイクル 98 ° c、30 秒 55 ° C と 30 s 72 ° C、72 ° c. で 10 分の最終的な拡張で s
- プラスミド pLELVd-IIS 型制限酵素Bpiの 10 U BZB のダイジェスト 100 ng 0.5 mL に 20 μ L 反応で 37 ° C で 1 時間私は G (10 mM pH 7.5、10 mM MgCl2、50 mM NaCl トリス塩酸バッファー内チューブします。、0.1 mg/mL BSA)。
注:すべてのプラスミドの対応する著者にリクエストも承ります。Bpi私は、掲示板に相当私。 - TAE バッファー (40 mM 20 mM 酢酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.2 トリス) の 1% の agarose のゲルの電気泳動で PCR および消化製品を区切ります。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドの 200 mL の振動による 15 分のためのゲルを染色します。UV transilluminator を用いた DNA を視覚化し、 Bpi私消化プラスミド (2046 bp) メス刃を使用して増幅 cDNA に対応するバンドを切断します。
注:Bpi私 pLELVd BZB の消化も LacZ 青白記者に対応する 528 bp 製品をリリースします。 - (ゲルの材料表で DNA の回復キット) シリカゲル カラムを使用してゲル片から Dna を溶出して吸光光度分析法による DNA 濃度を定量化します。
- アセンブリのギブソン反応増幅 cDNA と消化のプラスミドを使用して設定します。ベクター20対挿入の 3 倍モル超過分を使用します。50 ° C で 1 時間インキュベートし、(DNA クリーン &テーブルの材料にコンセントレーター キット) シリカゲル カラムを用いた反応生成物を浄化します。
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Electroporate 主務にギブソン アセンブリ反応の精製品を使用大腸菌 DH5α 。次の設定を適用 1 mm エレクトロポレーション キュベットを使用して、: 1,500 V と 5 さん加温カタボライト抑制と超最適化されたスープで 37 ° C で 1 時間 (SOC; 20 g/L トリプトン 5 g/L 酵母エキス、0.5 g/L の NaCl、KCl、2.5 mM 10 mM MgCl2、20 mM グルコース、pH 7.0) 液体培地とルリア ベルターニカミラを広めにして (LB; 10 g/L トリプトン 5 g/L 酵母エキス、塩化ナトリウム 10 g/L) 寒天 (1.5%) を含む 50 μ G/ml アンピシリン プレートします。
- 変換されたエシェリヒア属大腸菌に対応するコロニーのための画面に挿入、electroporated 細胞をメッキする前に 15 分を組み込む可能性が高いクローンを広める 50 mg/mL の 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) 30 μ Lジメチルホルムアミド。37 ° C で一晩版を孵化させなさい
- いくつか白人の植民地をピックアップし、37 ° c 液体の LB 媒体で一晩成長します。浄化、miniprep を用いたプラスミド キット (材料の表を参照) とそのサイズを TAE バッファーに 1% の agarose のゲルの電気泳動によって分析します。
- PLELVd BZB コントロールと比較して電気泳動の移行に基づいて最も可能性の高い組換えプラスミドを選択します。3 を使用してプライマー 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC - シーケンスで選択したプラスミドのシーケンスを確認 ' と 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' pLELVd BZB カセット式全逃げ。
注:興味の cDNA に置き換えられます LacZ マーカーで 528 bp polylinker がこのプラスミドに含まれていることに注意してください。制限のマップ右のプラスミドを選択に役立ちます。
2. RNA 発現
- Co electroporate (1.6 の条件を参照してください) 選択した大腸菌ひずみ (大腸菌BL21 または BL21 派生物) 共同を表現する興味およびプラスミド p15LtRnlSm の RNA に対応する cDNA を含む pLELVd-BZB-微分と、ナスの tRNA のリガーゼ。領域の長い二重鎖 Rna を表現するのにエシェリヒア属大腸菌RNase III21が不足している、HT115(DE3) を使用します。
注: RNA 両方エシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼによる転写、mRNA の関心と tRNA のリガーゼ。この lysogen の存在は有害な影響を与えませんが、大腸菌の菌株で特急の T7 RNA ポリメラーゼ DE3 lysogen する必要はありません。 - SOC 液体培地で 37 ° C で 1 時間培養後 electroporated 50 μ G/ml アンピシリンと 34 μ G/ml クロラムフェニ コールを含む LB 固体培地で細菌をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。
- コロニーをピックアップし、1 L を接種する液体の素晴らしいスープ (TB) 媒体の 250 mL で三角フラスコを困惑 (12 g/L トリプトン 24 g/L 酵母エキス、0.4% のグリセロール、0.17 M KH2PO4、および 0.72 M K2HPO4)、50 μ g/mL アンピシリンを含む34 μ G/ml クロラムフェニ コール。180 回転/分 (rpm) で活発な動揺と 37 ° C で孵化させなさい。文化接種後 12 と 16 h の間の細菌を収穫します。
3. RNA の抽出・精製
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分析の目的のため必要な時点で文化の 2 mL 因数を取る 14,000 x gで 2 分間破棄上清の遠心分離機し、ボルテックスで TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、および 1 mM EDTA) の 50 μ L で細胞を再懸濁します。
- フェノール (水で飽和し、トリス-HCl、pH 8.0、8.0 ph 平衡) の 1:1 (v/v) ミックスの 1 つのボリューム (50 μ L) を追加およびクロロホルム。積極的なボルテックスしてセルを解除し、14,000 x gで 5 分間遠心分離して水溶液と有機相を分離します。
- 総細菌 RNA を含む水性相 (上側) を注意深く回復します。
注: 準備は、その後の分析のための-20 ° C で保存できます。
- 分取用 250 mL 遠心ボトルと 14,000 × g 10 分破棄上清のために細胞をスピンに文化を注ぐ。30 mL の水で再によってセルを洗浄します。遠心管に移し、再び同じ条件下で細胞をスピンします。
- 上澄みを廃棄し、ボルテックスで 10 mL のクロマトグラフィー バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 6.5, 150 mM の NaCl、0.2 mM EDTA) の細胞を再懸濁します。
注:この時、他の瞬間に浄化を続行する-20 ° C で細胞を固定できます。 - 新鮮なまたは解凍細菌の準備を使用して、1 ボリューム (10 mL) を追加することによりフェノール: クロロホルムの細胞を破る (3.2 を参照) とボルテックス精力的に。
- 12,000 × gで 10 分間遠心、水性相を回復し、再 1 ボリューム (10 mL) の同じ条件の下でクロロホルムで抽出します。
注:RNA の準備は、-20 ° C でこの時点で保存できます。 -
さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによる総細菌 RNA を浄化します。45 μ m シリンジ フィルターと 1 mL ジエチルエタノールアミン (DEAE) 列の負荷によって RNA の準備をフィルター処理します。
- クロマトグラフィーの浄化のためには、1 mL/min の流速で液体クロマトグラフィー システムを使用します。サンプルの読み込みの前に 10 mL のクロマトグラフィー バッファーとコラムを平衡させ (手順 3.3 構成を参照してください)。
- サンプルをロードし、10 mL のクロマトグラフィー バッファーを洗い流します。20 ml の溶出バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 6.5 では、1 M の NaCl、0.2 mM EDTA) の RNA を溶出し、1 ml を収集します。
注: RNA はすぐに初期の分数でた。列はさらに精製再利用することができます。このため、10 mL の水を洗い流すし、20% エタノールで 4 ° C で保存します。
- 組換え RNA 蓄積大腸菌で円形のフォームの大部分は、以降このプロパティは均質性12に浄化のため利益することができます。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (2 D ページ) 非変性と変性 (8 M 尿素) 条件12,22の組み合わせによるリニア電源から円形の Rna を分離します。
4. RNA 解析
- 5% のポリアクリルアミドゲルを準備 (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide、質量比) TBE バッファー (89 mM トリス、89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA) 含む 8 M 尿素で。
- RNA 調剤のバッファー (98% ホルムアミド、10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.0025% ブロモフェノール ブルーと 0.0025% キシレンシアノール) 1 巻 (20 μ L) とのミックス 20 μ L 95 ° c 加熱ブロックで 1.5 分間インキュベートし、クールな氷の上。
- ポリアクリルアミドゲルのサンプルをロードし、(例えば200 V で 2.5 h 2 mm ジェル x 130 x 140 を実行) のゲル寸法に応じて適切な条件で電気泳動を実行します。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドで 15 分間ゲルを染色、水で洗浄し、紫外線の下で RNA を視覚化します。
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Representative Results
ELVd 派生システム12を使用してE. 大腸菌の組換え RNA を生産するには、目的の RNA は ELVd RNA 足場に移植しました。この想像上の RNA が共発現大腸菌でナスの tRNA のリガーゼに沿って。そこから関心の RNA が突出している、想像上の円形の RNA が可能性が高いリボ核タンパク質 (の細菌の細胞の顕著な濃度に達すると共発現ナス酵素との複合体を形成する処理、切断、円形、図 1)。したがって、このシステムを用いて組換え RNA を生成する最初のステップ ELVd cDNA、ELVd シーケンス バリアント AJ536613 で T245 T246 の特定の位置に関心の RNA に対応する cDNA を挿入することで構成されます。2 Bpiとプラスミド pLELVd-BZB この polylinker を含む位置 I 認識サイトや LacZ の青/白のマーカー遺伝子の非常に効率的なギブソン アセンブリ メソッド20この挿入が容易になります。変換されたエシェリヒア属大腸菌の選択は、目的の組換えのプラスミッドは LacZ マーカーの青/白のスクリーニングによって促進されるを含むクローンを作成します。プラスミドをダブルBpi私消化完了しませんでしたし、X gal の存在下で挿入可能性が高い食材青いコロニーを組み込むことができません。図 2は、異なる Cdna が挿入されたいくつかのプラスミドの電気泳動分析を示しています。これらのプラスミッドは、異なる移行 pLELVd BZB と比較した場合を示しています。その pLELVd BZB には LacZ マーカーが含まれてメモ (528 bp) 興味の RNA に対応する cDNA が置き換えられます。挿入された cDNA のサイズにもよりますが通常、組換えのプラスミッドは制御プラスミド (図 2) よりも高速を移行します。
Co electroporateエシェリヒア属大腸菌に p15LtRnlSm に沿って興味の Rna に対応する Cdna を含む pLELVd-BZB-デリバティブを使用します。共同変換された細菌は、アンピシリン、クロラムフェニ コールを含むプレートで選択されます。その後、大腸菌を選択クローンを激しく攪拌しながら豊富な TB 培地で 37 ° C で栽培されて。この培養条件下では、RNA が遺伝子組換えの生産は、12を最大化します。フェノールおよびクロロホルム バッファーの存在下での組み合わせでセルを分割し、ページの変化によって RNA、緩衝水溶液であるパーティションを分析細菌に遺伝子組換え RNA の存在を簡単に監視できます。図 3ショー エチジウム ブロマイド染色ポリアクリルアミドゲル異なるエシェリヒア属大腸菌からの総 Rna のクローンが分離されました。写真は、空 ELVd に対応する強力なバンドや関心の異なる Rna が挿入されたキメラの ELVd フォームを表示.興味深いことに、我々 は円形のフォームとして組換え RNA の主要な部分を見つけます。高低イオン強度に変化の条件の下で 2 つのページの組み合わせを使用して、主な組換え RNA 量の真円度簡単に観察できる (図 4)。
下流のアプリケーションでは、合計のエシェリヒア属大腸菌の RNA によって興味のキメラ ELVd RNA を含む準備現在のプロトコルの目標があります。ただし、必要に応じて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる、RNA の準備を更に精製することができます。図 5のクロマト グラムは、高いイオン強度 (1 M NaCl) で、低イオン強度 (150 mM NaCl) 列とその後の溶出にエシェリヒア属大腸菌の RNA の効率的な保存を示しています。RNA のほとんどは、2 と 3 の分数に収集されます。同質性に組換え RNA を浄化するには、循環の利点を取ることができます。円形の Rna は、変性条件22の線形対応に関して遅延されます。これらの Rna は、エチジウム ブロマイド染色後ゲルから溶出することができます。Solubilizable ポリアクリルアミド ゲルの架橋などの使用N, N'-ビス (アクリル) シスタミン23、組換え Rna (図 6) の大量の精製が容易になります。
図 1:エシェリヒア属大腸菌の組換え RNA を生成するウイロイド ベース システムの模式図。プラスミド pLELVd BZB に関心の RNA に対応する cDNA (、98 nt 長い RNA アプタマーほうれん草方式) が挿入されます。E. 大腸菌それにある共同共同ナスの tRNA のリガーゼを表現する pLELVd BZB 微分およびプラスミド p15LtRnlSm と変換されました。大腸菌で、キメラ ELVd ほうれん草 RNA 転写産物がウイロイド ハンマー ヘッド型リボザイムが自己切断 (赤の矢印)。結果として得られるモノマーが共発現の tRNA のリガーゼによって認識され、円形します。組換え RNA は (緑) で関心の RNA が突出しているから円形ウイロイド足場から成っています。リボ核タンパク質の tRNA のリガーゼ複合体の安定化から大腸菌が大量に組換え RNA の蓄積の結果します。分割に加えて ELVd cDNA、プラスミド pLELVd BZB 含む pUC 複製の起源 (pUC 織)、アンピシリン選択遺伝子 (AmpR)、エシェリヒア属大腸菌マウス リポタンパク質 (lpp) プロモーターと rRNA (rrnC) ターミネータ、および、LacZマーカー。プラスミド p15LtRnlSm には p15A 複製の起源 (p15A 織)、クロラムフェニ コール耐性遺伝子 (CmR)、エシェリヒア属大腸菌 lppプロモーター、ナスの tRNA のリガーゼの cDNA のほかのバクテリオファージ T7 転写ターミネーターが含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 興味の別の Cdna を含む pLELVd 由来 BZB 発現プラスミドの電気泳動分析します。プラスミドは、エチジウム ブロマイドで染色された 1% の agarose のゲルの電気泳動によって分離しました。レーン 1、左上のコンポーネントのいくつかの kbp のサイズで DNA マーカーレーン 2、pLELVd-BZB;レーン 3、空の ELVd; を表現する pLELVd BZB 派生車線 7 に 4 pLELVd BZB 誘導体、3' 帽子独立した翻訳エンハンサー (CITE) 植物の連続した 42 bp 二本鎖領域 (6 レーン)、RNA ヘアピン、ストレプトアビジン結合アプタマー (レーン 5) RNA アプタマーほうれん草 (4 車線) を表現するにはウイルス (レーン 7)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ウイロイド ベースのシステムを使用してE. 大腸菌組換え RNA が生成されます。総 Rna: クロロホルムとページの変化によって区切られた因数治療異なる大腸菌からクローンが抽出されました。臭化エチジウムで染色ゲルが表示されます。組換え Rna は、大腸菌(A) BL21(DE3) (B) HT115(DE3) で生産されました。(AとB) のレーン 1、左側に nt でのサイズの RNA マーカーレーン 2、空の ELVd を表現するエシェリヒア属大腸菌のクローンから Rna (333 nt)。(A) 車線 3 及び 4、キメラの ELVd を表現するエシェリヒア属大腸菌のクローンから Rna アプタマーほうれん草を含むを形成 (98 nt) とストレプトアビジン結合アプタマー (42 nt)、それぞれ。(B) レーン 3、42 bp 長い RNA を含むキメラ ELVd フォームを表現するエシェリヒア属大腸菌のクローンからの Rna。赤い矢印は、円形の組換え Rna をポイントします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 組換え RNA の真円度はウイロイド ベースのシステムを使用してE. 大腸菌で生産。アプタマーほうれん草を含むキメラ ELVd を表現するエシェリヒア属大腸菌のクローンからの総 Rna は 2 D の高、低イオン強度下で最初のページの変化によって分かれていた。ゲルは、エチジウム ブロマイドで染色された.青色の矢印は、電気泳動の移動の方向を示します。赤い矢印は、選択的に 2 つの版では同じサイズの線形の同等から遅れてが円形の ELVd ほうれん草を指します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 組換え RNA の精製はウイロイド ベースのシステムを使用してE. 大腸菌で生産。キメラの ELVd 3 を生成する大腸菌クローンからの総 Rna」シテ (55 nt) 150 mM の NaCl の存在下で洗浄した DEAE カラムに読み込まれました。RNA は、1 M の NaCl の存在下で溶出しました。クロマト グラムは、mS/cm (オレンジ ライン)とボリュームで、254 nm 帯 (青線) および伝導性吸光度を示しています。クロマトグラフィー分離 (平衡、注入、洗浄、溶出、列再生) の別の手順が示されます。収集した分数が示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 組換え RNA の同質性に浄化はウイロイド ベースのシステムを使用してE. 大腸菌で生産。キメラの ELVd 3 を生成する大腸菌クローンからの総 Rna ' シテいた最初 Deae-sepharose カラムを用いたクロマトグラフィーによる精製し、区切られた 2 D のページです。最初のゲルが (8 M 尿素、TBE バッファー) の条件の変化の下で実行されました。エチジウム ブロマイドで染色後組換え RNA の円形のフォームが含まれているゲルのバンドは非変化条件 (TAE バッファー) の下で実行された第 2 ゲルの上に移されました。第 2 ゲルのアクリルアミドは、架橋N, N'-ビス (アクリル) シスタミン純粋な組換え RNA に含まれているゲルのフラグメントの可溶化を許可します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ELVd シーケンスとナスの tRNA のリガーゼによって認識に関与する構造の要件を研究している間我々 は円形化ウイロイドの予期しない大規模な蓄積につながった非宿主大腸菌の両方の分子を共発現に気づいた細菌細胞19の形態。エシェリヒア属大腸菌の RNA ウイロイドの大きい蓄積最もおそらく比較的小さいなど、安定性の高い RNA 分子の共発現の結果であったことがわかった (333 nt)、高基・ ペア、円形化ウイロイドとこのタンパク質特定のウイロイド親和性の高さが表示されます。ELVd RNA は、感染した植物17のレプリケーション中に、環状を仲介するホスト tRNA のリガーゼを募集する必要があります。両方の分子形成リボ核蛋白質エシェリヒア属大腸菌細菌の 1 リットル当たり 150 mg の顕著な濃度に達することができますと、ウイロイドを安定にさらに複雑なことを期待して実験的確認を持っていない私たちが高度を上回る Rrna12などの内因性 Rna の文化。ELVd は、大腸菌ではレプリケートされません、ので私たちは異種の RNA の挿入はウイロイド由来 RNA の蓄積に劇的に影響を与えるつもりはないと、実際には、そうだと判断。この観察はここで述べるエシェリヒア属大腸菌の組換え RNA の大量を生成する方法の基礎です。メソッドは、目的の RNA が提示は足場として ELVd の円形の RNA 分子を使用します。エシェリヒア属大腸菌の円形 ELVd 足場を生成、ウイロイド ハンマー ヘッド型リボザイムの複製されたドメインと RNA 前駆体を表現する必要があります。ELVd リボザイムが自己エシェリヒア属大腸菌で非常に効率的に切断、結果ウイロイド モノマーを認識し、共発現の tRNA のリガーゼによって円形します。TRNA のリガーゼの共発現は、システムの重要な機能です。ELVd RNA は、この特定の酵素が共発現12でない限りほとんど大腸菌検出されます。
我々 のプロトコルでプラスミド pLELVd BZB は U245 と U246 の ELVd の位置の間のシンプルで効率的なギブソン アセンブリによって興味の RNA に対応する cDNA を挿入することができます。このサイトは、最も可能性の高い ELVd 構造24,25に長いヘアピンのターミナルのループに対応します。この特定の位置に挿入する必要があります興味の RNA が ELVd によって形成された非常に安定した足場から突き出ているし、関心の RNA と ELVd (図 1) の分子内相互作用を避ける必要がありますを促進します。我々 は ELVd 分子の代替位置への関心の RNA の挿入の結果を検討していません。プラスミド p15LtRnlSm では、ナスの tRNA のリガーゼの共発現をことができます。構成の強力な大腸菌の制御の下で両方のプラスミッドの Rna が転写プロモーター、すなわち murein リポタンパク質 (lpp)。これは、誘導の必要性無しで構成システムになります。ただし、イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) の誘導システムでバクテリオファージ T7 RNA ポリメラーゼの制御の下で tRNA のリガーゼを表現するようなプラスミド (p15tRnlSm) を構築します。このプラスミドを用いた組換え RNA の蓄積後に発生します tRNA のリガーゼ発現誘導 IPTG12を追加することによって。現在のシステムから適当なコピー数プラスミド p15A の複製の起源と tRNA のリガーゼを表現しながら、関心の RNA は高コピー数プラスミド pUC の複製の起源とから表されます。コピーの数を変更するかどうか、システムに関連する両方のプラスミド RNA はこれまで検討されていない遺伝子組換えの蓄積が向上します。システムで認められて興味の RNA のサイズの範囲は体系的にされていない小さな Rna が論理的に大きいものよりも高濃度に蓄積する予定が、いずれかを検討します。
なぜ体内組換え RNA の生産は容易ではない理由の一つは RNA 分子の本質的な低い半減期のためにおそらくです。当社のシステムは、この問題に外国人ではないです。実際には、成長の段階後半エシェリヒア属大腸菌で組換え RNA の蓄積は事実上消滅して12に減少し始めます。これは、力を 1 つのセルを収穫する右側のウィンドウを見つけます。見ました、しかし、このウィンドウはシステムが仲良くのに十分な大きさ。ただし、最適なウィンドウの多くに依存していることを観察しても特定の大腸菌を含む要因、歪み、培地、生育条件 (撹拌、ボリューム、フラスコの放映等.) と細菌の生理学的な段階液体培養を開始するために使用。新鮮なエシェリヒア属大腸菌を用いた遺伝子組換え RNA の生産を開始お勧めします前日に接種し、37 ° C で栽培プレートからコロニー冷蔵庫の中にプレートを格納するより多くの予測収穫ウィンドウになります。つまようじ板から拾った細菌で液体培養を開始することで最も一貫した結果を得た.液体の前培養の飽和状態、特に場合も生産プロトコルで変動するドライブします。
浄化について: クロロホルム細菌細胞の治療はセルを分割する非常に効果的な方法し、水相中に細菌の総 RNA の定量回復のため。組換え RNA の下流のアプリケーションに応じてこの水相またはアルコールを含むこの水相からの RNA を沈殿させるから結果準備十分でしょう。さらに浄化する必要は、陰イオン交換クロマトグラフィー DEAE 陰イオン交換カラム (図 5) を使用してお勧めします。この浄化のステップでは、DNA と水相で分割も細菌の代謝産物の効率的な除去ことができます。組換え RNA のダウン ストリーム アプリケーションでは、同質性に浄化を必要とする場合、ウイロイド派生システムは他の方法と比較して明確な利点を提供します。組換え RNA の主な一部は、円形のフォームとして製作しておりますので、細菌の Rna の大部分と区別するためこのプロパティの利点を取得できます。円形 Rna 同じサイズ22のリニア電源に関しての条件の変化の電気泳動の移行で遅延が発生します。この遅延は、低イオン強度下で RNA を electrophoresed される場合により顕著です。実際、円形 Rna 缶も高次元の変化ページで区切られた、低イオン強度 (図 4)。電気泳動分離後組換え RNA はゲルから溶出する必要があります。アクリルアミド、可逆架橋剤の使用などN, N'-ビス (アクリル) シスタミン23多量の RNA (図 6) を浄化するときに特に、回復が容易になります。最後に、作り出された RNA のダウン ストリーム アプリケーションでは、ウイロイド足場からの関心の RNA の分離を要求した場合、我々 のプロトコルは以前の方法にいかなる特定の優位を提供しません。興味の RNA をリボザイム、DNAzymes を使用するなど、前述の戦略の一部を使用してキメラ分子から摘出する必要があります。 または、おそらく最も効率的なリボヌクレアーゼ H の使用は 2 つの DNA のオリゴヌクレオチド7によって導かれています。この最後の面倒な精製ステップを回避しようとすると、部分的な成功とがウイロイド足場のサイズを減らすためにしようとしてきました。ウイロイド削除フォームを利用した組換え RNA の顕著な量を生産することができました (175、215、246 nt) 蓄積12の減少と相関ウイロイド足場の削除の増加が。
合計では、ここでのプロトコルは私たちの知る限りでは、以前に発行されたメソッドの収率が向上するエシェリヒア属大腸菌の組換え RNA の大量生産に記載されます。プロトコルは、ウイロイド (ELVd) 足場とナスの tRNA のリガーゼ、circularizes このウイロイドに感染した植物酵素に挿入される興味のエシェリヒア属大腸菌の RNA の共発現の基づいています。プロトコルの特徴は、RNA 主に円形のフォーム、ダウン ストリーム アプリケーションの同質性に浄化を促進するプロパティとして生成され、その組換えです。このプロトコル数十ミリグラム組換え RNA は簡単に通常の実験室の条件で大腸菌文化のリットル当たりを作り出すことができるを使用してください。
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Disclosures
著者はこのプロトコルで記述されている技術がされていることを宣言 (米国特許番号特許を取得PCT/EP2015/060912 EP14382177.5)。
Acknowledgments
この作品は、助成金 BIO2017-83184-R とスペイン Ministerio デ サイエンス、Innovación y Universidades (協調融資・ フェダー資金) から BIO2017 91865 経験によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
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