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Biochemistry

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.

Abstract

Con il crescente interesse per la biologia del RNA e l'impiego di molecole di RNA in sofisticate applicazioni biotecnologiche, i metodi per produrre grandi quantità di RNA ricombinante sono limitati. Qui, descriviamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli basato su co-espressione di una molecola chimerica che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Viroidi sono relativamente piccole, non codificanti, altamente abbinati in base RNAs circolari che sono infettivi per piante superiori. L'host pianta tRNA ligasi è un enzima reclutato da viroidi che appartengono alla famiglia Avsunviroidae, quali melanzane viroid latente (ELVd), per mediare circularization di RNA durante la replica di viroide. Anche se ELVd non replica in Escherichia coli, un precursore di ELVd è efficientemente trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli ed elaborato dai ribozimi hammerhead incorporato nelle cellule batteriche e i monomeri risultanti sono circolarizzazione della co-espressi ligasi di tRNA raggiungendo una notevole concentrazione. L'inserimento di un RNA di interesse in patibolo ELVd consente la produzione di decine di milligrammi di RNA ricombinante per litro di coltura batterica in condizioni normali di laboratorio. Una frazione principale del prodotto RNA è circolare, una caratteristica che facilita la purificazione del RNA ricombinante ad omogeneità virtuale. In questo protocollo, un corrispondente di DNA (cDNA) complementare al RNA di interesse viene inserito in una particolare posizione del cDNA ELVd in un plasmide di espressione che viene utilizzata, lungo il plasmide per co-esprimere melanzana-ligasi tRNA per trasformare e. coli. Co-espressione di entrambe le molecole sotto il controllo di promotori costitutivi forti porta alla produzione di grandi quantità di RNA ricombinante. il RNA ricombinante può essere Estratto da cellule batteriche e separato dalla massa di RNA batterico, approfittando della sua circolarità.

Introduction

A differenza del DNA e proteine, protocolli per la produzione di semplice, efficiente ed economica di grandi quantità di RNA non sono abbondanti. Tuttavia, ricerca e industria domanda quantità crescenti di queste biomolecole per studiare le loro proprietà biologiche uniche1, o per essere impiegati in sofisticate applicazioni biotecnologiche, tra cui il loro uso come aptameri altamente specifico 2, agenti terapeutici3o pesticidi selettiva4. Sintesi chimica e trascrizione in vitro sono comunemente usati nella ricerca per produrre RNA. Tuttavia, questi metodi comportano limitazioni importanti quando grandi quantità di prodotti sono richiesti. La logica alternativa consiste nell'utilizzare i macchinari di trascrizione endogena delle cellule viventi, seguita da un processo di purificazione per separare il RNA di interesse dai compagni cellulari. Seguendo questa strategia, sono stati sviluppati metodi per produrre RNA ricombinante in cellule batteriche, quali il laboratorio-friendly Escherichia coli5 o la Marina viola phototrophic alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. maggior parte dei metodi per produrre RNA ricombinante nei batteri si basano sull'espressione di un'impalcatura nativa di RNA altamente stabile, come un tRNA o un rRNA, in cui il RNA di interesse è inserito7. Questo impone la necessità di liberare il RNA di interesse fuori la molecola chimerica, se la presenza di RNA supplementare è un problema per le applicazioni a valle8. Un altro concetto a ricombinante biotecnologie RNA è la produzione di complessi della ribonucleoproteina ricombinante che può essere il prodotto desiderato per sé o utilizzato come una strategia di protezione per aumentare la stabilità del RNA di interesse9, 10. Analogamente, la produzione di RNA circolare inoltre è stata suggerita come una strategia per generare più stabile prodotti11.

Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in e. coli che partecipa a tre dei concetti qui sopra: l'inserimento di RNA di interesse in un'impalcatura di RNA circolare altamente stabile e la co-espressione della RNA ricombinante con una proteina d'interazione probabile produrre una ribonucleoproteina stabile complessa che si accumula in quantità notevole in batterico cellule12. In contrasto con sviluppi precedenti, abbiamo usato un'impalcatura di RNA completamente estraneo ad e. coli, vale a dire un viroide. Viroidi sono un tipo molto particolare di agenti infettivi di più alte piante che sono costituite esclusivamente da un relativamente piccolo (246-401 nt) altamente abbinati in base circolare RNA13. Interessante, viroidi sono RNA non codificanti e, senza alcun aiuto di proprie proteine, sono in grado di completare cicli complessi infettive nel host infetti14. Questi cicli includono la replica di RNA-a-RNA nei nuclei o cloroplasti, a seconda della famiglia di viroide —Pospiviroidae o Avsunviroidae, rispettivamente — movimento attraverso la pianta infetta e l'evasione della risposta difensiva ospite. Viroidi devono essere allineati fra il RNAs più stabile in natura, come conseguenza di essere un RNA circolare nudo e dover sopravvivere in un ambiente ostile di cellule vegetali infetti. Questa proprietà può rendere particolarmente adatto come scaffold per stabilizzare ricombinante RNA in approcci biotecnologici viroidi. Inoltre, il nuovo metodo si basa sulla co-espressione dell'impalcatura viroide con un'interazione della pianta. Viroidi replicano attraverso un meccanismo di rotolamento-cerchio in quale host vengono reclutati gli enzimi per catalizzare le diverse fasi del processo. In particolare alcuni viroidi, in particolare quelli che appartengono alla famiglia Avsunviroidae15, contengono ribozimi che sono anche coinvolti nella replica. A seconda della specie di viroide, trascrizione di viroide RNAs è mediato dall'host RNA polimerasi II o dalla RNA polimerasi cloroplastica codificate (NEP). Elaborazione di viroide RNA sembra essere catalizzata da un host RNAsi di tipo III, anche se in viroidi con RNA oligomerici ribozimi intermedi self-fendono durante la replica. Infine, i monomeri viroide risultante sono circolarizzazione, a seconda della famiglia di viroide, la ligasi del DNA ospite 1 o l'isoforma cloroplastico di tRNA ligasi16,17. Questo ultimo enzima è coinvolto nella legatura delle forme monomeriche di viroidi nella famiglia Avsunviroidae, come melanzane viroid latente (ELVd)18.

Nel corso di un lavoro per analizzare i requisiti strutturali e sequenza di ELVd che determinano il riconoscimento di melanzana (Solanum melongena L.) ligasi tRNA, abbiamo istituito un sistema sperimentale basato sulla co-espressione di entrambe le molecole dentro e. coli 19. abbiamo notato che le trascrizioni di ELVd più lungo rispetto a unità self-fendono in modo efficiente in cellule di Escherichia coli attraverso i ribozimi hammerhead incorporato e che i monomeri viroide risultante con 5'-idrossile e 2', 3'-fosfodiestere termini erano in modo efficiente circolarizzazione dalla ligasi di tRNA melanzane co-espressi. Ancora di più, il RNA circolare viroide risultante ha raggiunto un'inattesa alta concentrazione in e. coli, superiori a quelle del endogeno rRNAs12. Assenza di replica intermedi indica la mancanza di amplificazione ELVd RNA-a-RNA in queste cellule batteriche. Interessante, inserimento di eterologa RNA in una particolare posizione della molecola viroide ha avuto un effetto moderato su accumulazione del RNAs circolare viroide-derivato12. Queste osservazioni ci ha fatto immaginare un metodo per produrre grandi quantità di ricombinante RNAs in batteri. In questo metodo, i cDNA corrispondente per il RNA di interesse vengono inseriti nel cDNA ELVd e il RNA chimerico risultante è espressa in e. coli attraverso un forte promotore costitutivo. Perché il sistema funzioni, e. coli devono essere co-trasformati con un plasmide per esprimere la melanzana ligasi di tRNA. La trascrizione di più-di-unità ELVd-derivato viene elaborata dai ribozimi hammerhead incorporato e i monomeri risultanti con termini appropriati sono riconosciuti e circolarizzazione dalla ligasi di tRNA co-espressi. In questo modo, il RNA di interesse viene inserito in un'impalcatura circolare molto stabile che consiste della molecola circolare viroide. Questo RNA chimerico recombinant molto probabilmente si è ulteriormente stabilizzata all'interno delle cellule di Escherichia coli mediante la formazione di una ribonucleoproteina complessa attraverso l'interazione con ligasi di tRNA. Utilizzando questo metodo (Vedi il protocollo qui sotto), RNA aptameri, hairpin RNA e altro RNAs strutturato è stati facilmente prodotto in quantità di decine di milligrammi per litro di coltura di Escherichia coli in condizioni di laboratorio regolari e purificato ad omogeneità prendendo vantaggio di circolarità12.

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Protocol

1. plasmide costruzione

  1. Amplificare mediante PCR (o da trascrizione d'inversione PCR se partendo da un modello di RNA) il cDNA corrispondente al RNA di interesse utilizzando primer con 5' estensione che consente un assemblaggio nel plasmide di espressione. Per evitare indesiderate mutazioni, utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
    1. Per inserire il cDNA nel plasmide di espressione di Gibson Assemblea20, aggiungere le seguenti estensioni di 5' per gli iniettori PCR: in avanti, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; inverso, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X rappresenta nucleotidi omologhi alle estremità terminale del RNA di interesse.
    2. Incubare per 30 s a 98 ° C, seguita da 30 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 30 s a 72 ° C e un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.
  2. Digest 100 ng di plasmide pLELVd-BZB con 10 U di enzima di restrizione di tipo-IIS Bpi I per 1h a 37 ° C in una reazione di 20 µ l in un 0,5 mL tubo nel buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Nota: Tutti i plasmidi sono disponibili su richiesta all'autore corrispondente. BPI È equivalente a Bbs ho.
  3. Separare i prodotti PCR e la digestione mediante elettroforesi in un gel di agarosio 1% in tampone TAE (40 mM Tris, 20 mM acido acetico, 1 mM EDTA, pH 7,2). Macchia del gel per 15 min agitando in 200 mL di 0,5 µ g/mL di bromuro di etidio. Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV e tagliare le bande corrispondenti a cDNA amplificato e il Bpi ho digerito plasmide (2046 bp) usando un bisturi.
    Nota: BPI Ho la digestione di pLELVd-BZB rilascia anche un prodotto bp 528 corrispondente al reporter LacZ blu-bianco.
  4. Eluire il DNAs dai frammenti gel utilizzando colonne di gel di silice (gel kit di recupero di DNA in Tabella materiali) e quantificare la concentrazione di DNA mediante analisi spettrofotometrica.
  5. Impostare una reazione di assemblaggio Gibson usando il cDNA amplificato e il plasmide digerito. Utilizzare un eccesso molare di 3 volte di inserto versus vettoriale20. Incubare per 1 h a 50 ° C e purificare i prodotti di reazione utilizzando una colonna di gel di silice (DNA pulito & kit di concentratore in Tabella materiali).
  6. Utilizzare i prodotti purificati della reazione Gibson assieme a electroporate competenti le cellule DH5α di e. coli . Utilizzando 1 mm elettroporazione cuvette, applicare le seguenti impostazioni: 1.500 V e 5 ms. Incubare per 1h a 37 ° C in brodo super ottimizzato con la repressione dei cataboliti (SOC; tryptone di 20 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, 0,5 g/L NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl2 20 millimetri di glucosio, pH 7.0) mezzo liquido e quindi diffusione sul Luria-Bertani (LB; tryptone di 10 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, 10 g/L NaCl) piastre di agar (1,5%) contenente 50 ampicillina di µ g/mL.
    1. Per schermare per colonie corrispondente trasformato Escherichia coli cloni che probabilmente incorporato l'inserto, 15 min prima di placcatura delle cellule elettroporate, diffondere 30 µ l di 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) in dimetilformammide. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.
  7. Scegli diverse colonie bianchi e crescere durante la notte a 37 ° C in terreno liquido LB. Purificare plasmidi utilizzando un miniprep kit (Vedi Tabella materiali) e analizzare le loro dimensioni mediante elettroforesi in un gel di agarosio 1% in tampone TAE.
  8. Selezionare il plasmide ricombinante probabilmente basato su migrazione elettroforetica rispetto al controllo pLELVd-BZB. Confermare la sequenza del plasmide selezionato dall'ordinamento utilizzando primer 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' e 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' che fiancheggiano la cassetta di espressione tutta in pLELVd-BZB.
    Nota: Ricordate che questo plasmide contiene un grado di bp 528 con il marcatore di LacZ che viene sostituito con il cDNA di interesse. Mappatura di restrizione può aiutare a selezionare i plasmidi ricombinanti destra.

2. RNA Expression

  1. Co-electroporate (Vedi condizioni nella 1.6) il selezionato Escherichia coli ceppo (e. coli BL21 o un derivato di BL21) con il pLELVd-BZB-derivato che contiene il cDNA corrispondente al RNA di interesse e plasmide p15LtRnlSm co-esprimere il melanzana ligasi di tRNA. Utilizzare l' e. coli HT115(DE3), che manca di RNAsi III21, per esprimere RNAs con regioni lungo double-stranded.
    Nota: Sia il RNA di interesse e la ligasi di tRNA mRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli . Nessun lisogene DE3 per espresso T7 RNA polimerasi è necessaria nel ceppo di e. coli , anche se la presenza di questo lisogene ha effetti deleteri.
  2. Dopo 1 h di incubazione a 37 ° C in terreno liquido SOC, piastra individulamente batteri in mezzo solido LB contenente 50 µ g/mL ampicillina e cloramfenicolo µ g/mL 34. Incubare per una notte a 37 ° C.
  3. Scegli una Colonia e inoculare un 1L sconcertato beuta da 250 ml di liquido di copertura eccezionale brodo (TB) (tryptone di 12 g/L, 24 g/L di lievito estratto, 0,4% glicerolo, 0.17 M KH2PO4e 0,72 M K2HPO4), contenente ampicillina di 50 µ g/mL e 34 µ g/mL cloramfenicolo. Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa a 180 giri al minuto (rpm). Raccogliere batteri tra 12 e 16 ore dopo l'inoculazione di cultura.

3. RNA estrazione e purificazione

  1. Per scopi analitici, prendere le aliquote di 2 mL della cultura presso i punti di tempo desiderato e centrifugare a 14.000 x g per 2 min. scartare il supernatante e risospendere le cellule in 50 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM EDTA) nel Vortex.
    1. Aggiungere un volume (50 µ l) di una miscela 1:1 (v/v) di fenolo (imbevuto di acqua ed equilibrato pH 8.0 con Tris-HCl, pH 8.0) e cloroformio. Rompere le cellule nel Vortex vigoroso e separare le fasi acquose e organiche mediante centrifugazione per 5 min a 14.000 x g.
    2. Attentamente e recuperare la fase acquosa (in alto) contenente RNA batterico totale.
      Nota: Preparazioni possono essere conservate a-20 ° C per la successiva analisi.
  2. Ai fini della preparativa, versare cultura in un flacone da 250 mL centrifuga e centrifugare le cellule a 14.000 x g per 10 min. Discard surnatante. Lavare le cellule di risospensione in 30 mL di acqua. Trasferimento in una provetta da centrifuga e rotazione verso il basso le cellule ancora nelle stesse condizioni.
  3. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di tampone di cromatografia (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) nel Vortex.
    Nota: In questa fase, le cellule possono essere congelate a-20 ° C procedere con purificazione in qualsiasi altro momento.
  4. Usando una preparazione batterica fresca o scongelata, rompere le cellule aggiungendo 1 volume (10 mL) di fenolo: cloroformio (Vedi punto 3.2) e Vortex vigorosamente.
  5. Centrifugare per 10 min a 12.000 x g, recuperare la fase acquosa e ri-estrarre con 1 volume (10 mL) di cloroformio nelle stesse condizioni.
    Nota: La preparazione di RNA può essere memorizzata a-20 ° C a questo punto.
  6. Purificare ulteriormente RNA batterico totale dalla cromatografia di scambio anionico. Filtrare la preparazione di RNA attraverso un 45 µm siringa filtro e carico su una colonna di diethylethanolamine (DEAE) di 1 mL.
    1. Per la purificazione di cromatografia, utilizzare un sistema di cromatografia liquida ad una portata di 1 mL/min. Prima di caricamento dei campioni, equilibrare la colonna con 10 mL di buffer di cromatografia (Vedi punto 3.3 per composizione).
    2. Caricare l'esempio e lavare la colonna con 10 mL di buffer di cromatografia. Eluire RNA con 20 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, NaCl di 1m, 0,2 mM EDTA) e raccogliere le aliquote di 1 mL.
      Nota: RNA eluisce rapidamente nelle frazioni iniziale. La colonna può essere riutilizzata per ulteriori purificazioni. Per questo, lavare la colonna con 10 mL di acqua e conservare a 4 ° C in etanolo al 20%.
  7. Da una parte importante del ricombinante che RNA si accumula dentro e. coli in una forma circolare, questa proprietà può essere profittata per purificazione di omogeneità12. Separare il RNAs circolare dalle controparti lineare mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide bidimensionale (2D pagina) che unisce non-denaturante e denaturazione (8m urea) condizioni12,22.

4. RNA analisi

  1. Preparare un gel di poliacrilammide del 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, rapporto tra massa) in TBE buffer (89 mM Tris, acido borico 89 mM, 2 mM EDTA) contenente 8 M urea.
  2. Mix 20 µ l di preparazioni di RNA con 1 volume (20 µ l) di caricamento buffer (98% formammide, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,0025% blu di bromofenolo e 0,0025% xilene cianolo), Incubare 1,5 min a 95 ° C in un blocco di riscaldamento e pressione cool sul ghiaccio.
  3. Caricare i campioni nel gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi a condizioni appropriate a seconda delle dimensioni del gel (ad esempio, eseguire 140 x 130 x 2 mm gel per 2,5 h a 200 V). Macchiare il gel per 15 min a 0,5 µ g/mL di bromuro di etidio, lavare con acqua e visualizzare RNA sotto luce UV.

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Representative Results

Per produrre RNA di ricombinante in e. coli usando il sistema ELVd-derivato12, il RNA di interesse si innesta in un'impalcatura di RNA ELVd. Questo RNA chimerico è co-espresso lungo la melanzana ligasi di tRNA in e. coli. Una volta elaborati, spaccati e circolarizzazione, il RNA chimerico circolare, dalla quale sporge il RNA di interesse, costituisce probabilmente una ribonucleoproteina complessa con l'enzima di melanzane co-espresso che raggiunge la notevole concentrazione nelle cellule batteriche ( Figura 1). Di conseguenza, il primo passo per produrre RNA ricombinante usando questo sistema consiste nell'inserire il cDNA corrispondente al RNA di interesse in una particolare posizione nel cDNA ELVd, T245-T246 nella variante di sequenza ELVd AJ536613. Plasmide pLELVd-BZB, che contiene un grado su questa posizione con due Bpi riconoscimento siti e un gene marcatore blu/bianco LacZ, facilita questo inserimento dal metodo molto efficiente Gibson Assemblea20. Selezione di trasformato Escherichia coli cloni contenenti i plasmidi ricombinanti desiderati è facilitata dalla proiezione del LacZ marcatore blu/bianco. Plasmidi in cui la doppia Bpi ho digestione era incompleta e non potrebbe integrare le colonie di probabile produrre blu inserto in presenza di X-gal. La figura 2 Mostra l'analisi elettroforetica di diversi plasmidi ricombinanti in cui sono stati inseriti diversi cDNAs. Questi plasmidi mostrano diverse migrazioni rispetto a pLELVd-BZB. Nota che pLELVd-BZB contiene il marcatore LacZ (528 bp) che è sostituito dal cDNA corrispondente al RNA di interesse. Così, anche se questo dipende dalla dimensione del cDNA inserito, i plasmidi ricombinanti solitamente migrano più velocemente rispetto il plasmide di controllo (Figura 2).

I pLELVd-BZB-derivati contenenti i cDNA corrispondente per il RNA di interesse vengono utilizzati lungo p15LtRnlSm a co-electroporate e. coli. Co-trasformati batteri sono selezionati su piastre contenenti ampicillina e cloramfenicolo. Quindi, selezionata e. coli cloni sono fatte crescere a 37 ° C con agitazione forte nel terreno ricco di TB. In questa condizioni di coltura, produzione di ricombinante che RNA è ingrandita12. La presenza del RNA ricombinante nei batteri possa essere facilmente monitorata rompendo le cellule con un mix di fenolo e cloroformio in presenza di un buffer e analizzando il RNA, quali partizioni in tampone acquoso, denaturando pagina. Figura 3 Visualizza il bromuro di etidio macchiato i gel di poliacrilammide in cui RNA totale da diversi Escherichia coli cloni sono stati separati. Le immagini mostrano forti bande che corrispondono ai ELVd vuota e forme chimeriche ELVd in cui sono stati inseriti diversi RNA di interesse. È interessante notare che troviamo una frazione rilevante del RNA ricombinante come forma circolare. Utilizzando una combinazione di due pagine in condizioni denaturanti a forza ionica ad alta e bassa, la circolarità della frazione principale del ricombinante RNA possa essere facilmente osservata (Figura 4).

A seconda dell'applicazione a valle, il totale di e. coli RNA preparazione che contiene la ELVd-RNA chimerico di interesse può essere l'obiettivo del protocollo attuale. Tuttavia, quando necessario, la preparazione di RNA può essere ulteriormente purificata mediante cromatografia di scambio anionico. Cromatogramma in Figura 5 viene illustrato l'efficiente ritenzione di e. coli RNA sulla colonna a bassa forza ionica (150 mM NaCl) e successiva eluizione a alta forza ionica (NaCl di 1m). La maggior parte del RNA sono raccolti in frazioni 2 e 3. Per purificare il RNA ricombinante ad omogeneità, può essere preso vantaggio di circolarità. RNAs circolari sono in ritardo rispetto alle loro controparti lineari a denaturare condizioni22. Questi RNA possono essere eluiti dal gel dopo la macchiatura di bromuro di etidio. L'uso di un gel di poliacrilammide solubilizable, come quelli reticolato con N, N'-bis (acriloil) cistamina23, facilita la depurazione di grandi quantità di RNA ricombinante (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del sistema basato su viroide per produrre RNA ricombinante in e. coli. Il cDNA corrispondente al RNA di interesse (il 98 nt-lungo RNA aptamero spinaci nello schema) viene inserito nel plasmide pLELVd-BZB. E. coli è co-trasformato con il p15LtRnlSm pLELVd-BZB-derivato e plasmide per co-esprimere melanzana ligasi di tRNA. In E. coli, la trascrizione chimerica di RNA ELVd-spinaci è self-spaccate (frecce rosse) dai viroide hammerhead ribozimi. Il monomero risultante è riconosciuto dalla ligasi di tRNA co-espressi e circolarizzazione. il RNA ricombinante è costituito da un'impalcatura di viroide circolare dalla quale sporge il RNA di interesse (in verde). Accumulazione del RNA ricombinante a grandi quantità in e. coli probabile deriva dalla stabilizzazione della ribonucleoproteina complessa con ligasi di tRNA. Oltre la divisione ELVd cDNA, plasmide pLELVd-BZB contiene un origine di replicazione di pUC (pUC ori), un gene di selezione di ampicillina (AmpR), il promotore di murino della lipoproteina (lpp) di e. coli e terminator rRNA (rrnC) e il LacZ marcatore. P15LtRnlSm plasmide contiene un p15A origine di replicazione (ori p15A), un gene di resistenza di cloramfenicolo (CmR), il promotore di e. coli lpp e un terminatore di trascrizione fago T7, oltre il cDNA di ligasi tRNA melanzana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi elettroforetica dei plasmidi di espressione pLELVd-BZB-derivati che contengono diversi cDNA di interesse. Plasmidi sono stati separati mediante elettroforesi in un gel di agarosio all'1% che è stato colorato con bromuro di etidio. Lane 1, marcatore del DNA con dimensioni in kbp di alcuni dei componenti sulla sinistra; Lane 2, pLELVd-BZB; Vicolo 3, derivato di pLELVd-BZB per esprimere un ELVd vuoto; corsie 4 a 7, derivati di pLELVd-BZB per esprimere il RNA aptamero spinaci (vicolo 4), la streptavidina associazione aptamer (vicolo 5), un tornante di RNA con una regione contigua del doppio filamento bp 42 (vicolo 6) e il 3' traduzione cap-indipendente enhancer (CITE) di una pianta virus (corsia 7). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: RNA ricombinante prodotta in e. coli utilizzando il sistema basato su viroide. RNA totale da diversi Escherichia coli cloni sono stati estratti dal trattamento con il fenolo: cloroformio e aliquote separate da denaturare la pagina. Gel colorato con bromuro di etidio sono mostrati. RNAs ricombinante sono state prodotte in e. coli (A) BL21 (DE3) e (B) HT115(DE3). (A e B) corsie 1, indicatore di RNA con dimensioni in nt sulla sinistra; corsie 2, RNAs da cloni di e. coli per esprimere un ELVd vuoto (333 nt). Corsie (A) 3 e 4, RNAs da cloni di e. coli per esprimere un chimerico ELVd formano contenente l'aptamero spinaci (98 nt) e l'associazione aptamer streptavidina (42 nt), rispettivamente. (B) vicolo 3, RNA da un clone di e. coli per esprimere una forma chimerica ELVd contenente un 42 bp-lungo doppio incagliato RNA. Frecce rosse scegliere il RNAs ricombinante circolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Circolarità del RNA ricombinante prodotta in e. coli utilizzando il sistema basato su viroide. RNA totale da un clone di e. coli per esprimere un chimerico ELVd contenente l'aptamero spinaci erano separate da 2D denaturazione prima pagina in alta e in bassa forza ionica. I gel sono stati macchiati con il bromuro di etidio. Le frecce blue indicano le direzioni di migrazione elettroforetica. La freccia rossa punta a circolare ELVd-spinaci che è selettivamente ritardata dalle controparti lineare delle stesse dimensioni durante le due separazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Purificazione cromatografica di un RNA ricombinante prodotta in e. coli utilizzando il sistema basato su viroide. RNA totale da un clone di e. coli che produce un chimerico ELVd-3' CITE (55 nt) sono stati caricati su una colonna di cromatografia DEAE che è stata lavata in presenza di NaCl 150 mM. RNA è stato eluito in presenza di NaCl di 1m. Il cromatogramma Mostra assorbanza a 254 nm (linea blu) e conducibilità in mS/cm (linea arancione) rispetto al volume. Sono indicate le varie fasi della separazione cromatografica (rigenerazione di equilibrazione, iniezione, wash, eluizione e colonna). Raccolta differenziata è anche indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Purificazione per omogeneità di un RNA ricombinante prodotta in e. coli utilizzando il sistema basato su viroide. RNA totale da un clone di e. coli che produce un chimerico ELVd-3' CITE erano prima purificati mediante cromatografia utilizzando una colonna di DEAE-Sepharose e quindi separati da pagina 2D. Primo gel è stato eseguito con denaturazione condizioni (8m urea, buffer TBE). Dopo colorazione con etidio bromuro, la band di gel che contiene la forma circolare del RNA ricombinante è stata trasferita alla parte superiore di un gel secondo cui è stato eseguito in condizione di non-denaturante (buffer TAE). L'acrilamide del gel secondo era reticolato con N, N'-cistamina bis (acriloil), che ha permesso di solubilizzazione del frammento gel contenente il RNA ricombinante puro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Mentre la ricerca i requisiti di struttura coinvolti nel riconoscimento della melanzana ligasi di tRNA ed ELVd sequenza, abbiamo notato che co-espressione di entrambe le molecole nel non host Escherichia coli ha condotto ad un grande accumulo imprevisto di viroide circolare forme in cellule batteriche19. Abbiamo capito che il grande accumulo di viroide RNA in e. coli era più probabilmente la conseguenza di cheesprimono una molecola di RNA altamente stabile, ad esempio il relativamente piccolo (333 nt), altamente basato-accoppiato, viroide circolare e una proteina per la quale questa particolare viroide Visualizza alta affinità. ELVd RNA deve reclutare la ligasi di tRNA host per mediare il suo circularization durante la replica a pianta infetta17. Anche se non abbiamo conferma sperimentale, anticipiamo che entrambe le molecole formano una ribonucleoproteina complessa in e. coli che ulteriormente si stabilizza il viroide RNA e permette di raggiungere la straordinaria concentrazione di 150 mg per litro di batterico cultura che altamente supera quelli di RNA endogeni, come ad esempio i rRNAs12. Poiché ELVd non replica in e. coli, abbiamo ragionato che inserimento di un RNA eterologa non aveva intenzione di influenzare notevolmente l'accumulo di RNA viroide-derivato e, infatti, che era il caso. Questa osservazione è alla base del metodo per produrre grandi quantità di RNA di ricombinante in e. coli che descriviamo qui. Il metodo utilizza la molecola di RNA circolare di ELVd come impalcatura su cui viene presentato il RNA di interesse. Per produrre un'impalcatura ELVd circolare dentro e. coli, abbiamo bisogno di esprimere un precursore RNA con il dominio duplicato del ribozima hammerhead viroide. ELVd ribozimi self-cleave in modo molto efficiente in e. coli e i monomeri viroide risultante sono riconosciuti e circolarizzazione dalla ligasi di tRNA co-espressi. Co-espressione della ligasi di tRNA è una funzionalità chiave del sistema. ELVd RNA difficilmente viene rilevato in e. coli , a meno che questo particolare enzima è co-espressi12.

Nel nostro protocollo, plasmide pLELVd-BZB permette di inserire il cDNA corrispondente al RNA di interesse dall'Assemblea di Gibson semplice ed efficiente tra le posizioni U245 e U246 di ELVd. Questo sito corrisponde all'anello terminale di un lungo tornante presente nel più probabile ELVd conformazione24,25. Inserimento in questa posizione particolare deve promuovere che il RNA di interesse sporge dal patibolo molto stabile formato da ELVd e deve evitare l'interazione intramolecolare tra il RNA di interesse ed ELVd (Figura 1). Non abbiamo esplorato l'effetto di inserire il RNA di interesse in posizioni alternative della molecola ELVd. Plasmide p15LtRnlSm permette di co-espressione della melanzana ligasi di tRNA. RNAs sono trascritti in entrambi plasmidi sotto il controllo di un forte costitutiva e. coli promotore, vale a dire della lipoproteina murein (lpp). Questo rende il sistema costitutiva senza necessità di induzione. Tuttavia, abbiamo anche costruire un plasmide simile (p15tRnlSm) per esprimere la ligasi di tRNA sotto il controllo della polimerasi T7 RNA dei fagi in un sistema inducibile isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Utilizzando questo plasmide, accumulo di RNA ricombinante si verifica solo dopo l'induzione dell'espressione di ligasi di tRNA con l'aggiunta di IPTG12. Nel sistema attuale, il RNA di interesse è espresso da un plasmide numero alta copia con origine di replicazione del pUC, mentre la ligasi di tRNA è espressa da un plasmide numero moderato copia con p15A origine di replicazione. Se alterando il numero di copie di entrambi coinvolti nel sistema di plasmidi migliora accumulo di ricombinante RNA non è stato esplorato finora. La gamma di dimensioni del RNA di interesse ammesso dal sistema non è stato sistematicamente studiato entrambi, anche se piccolo RNAs logicamente prevedibilmente verranno accumulati a concentrazioni più elevate rispetto a quelle più grandi.

Uno dei motivi perché la produzione di RNA ricombinante in vivo non è facile è molto probabilmente a causa della intrinseca bassa emivita di molecole di RNA. Il nostro sistema non è estranea a questo problema. Infatti, a un fine Escherichia coli fase di crescita, accumulo di RNA ricombinante inizia a diminuire per praticamente scomparire12. Questo costringe a trovare la finestra di destra per raccogliere le cellule. Abbiamo osservato, però, che questa finestra è grande abbastanza per rendere il sistema amichevole. Tuttavia, abbiamo anche osservato che la finestra ottima dipende da molti fattori tra cui il particolare Escherichia coli ceppo, terreno di coltura, coltivazione condizioni (agitazione, volume del pallone, ventilare, ecc.) e la fase fisiologica dei batteri utilizzato per avviare la coltura liquida. Si consiglia di iniziare la produzione di RNA ricombinante utilizzando freschi Escherichia coli colonie da una piastra inoculata il giorno precedente e cresciuto a 37 ° C. Conservare le piastre in frigo rende la finestra di raccolta più imprevedibile. Abbiamo ottenuto i risultati più costanti a partire da colture liquide con batteri selezionati da una piastra con uno stuzzicadenti. L'uso di una pre-cultura liquida, specialmente se saturi, anche unità alla variabilità nel protocollo di produzione.

Relativa alla depurazione, trattamento delle cellule batteriche con il fenolo: cloroformio è un modo molto efficace per rompere le cellule e consente il recupero quantitativo di RNA batterico totale nella fase acquosa. A seconda dell'applicazione a valle di RNA ricombinante, questa fase acquosa o la preparazione risultante dalla precipitazione del RNA da questa fase acquosa con un alcool può essere sufficiente. Se è necessaria una ulteriore purificazione, si consiglia di cromatografia di scambio anionico utilizzando una colonna a scambio anionico DEAE (Figura 5). Questo passaggio di purificazione consente un'efficiente rimozione di DNA e metaboliti batterici che inoltre diviso nella fase acquosa. Se l'applicazione a valle del RNA ricombinante richiede purificazione di omogeneità, il sistema derivato viroide offre un chiaro vantaggio rispetto ad altri metodi. Poiché una frazione principale del RNA ricombinante è prodotto come una forma circolare, vantaggio di questa proprietà può essere assunto per separarla dalla maggior parte degli RNA batterico. Circolare RNAs verificarsi un ritardo nella migrazione elettroforetica nel denaturare le condizioni per quanto riguarda le controparti lineare di stessa dimensione22. Questo ritardo è più evidente quando il RNA è electrophoresed sotto bassa forza ionica. In pratica, circolare RNAs inscatolano anche separati da pagina bidimensionale denaturante in alta e bassa forza ionica (Figura 4). Dopo la separazione elettroforetica, il RNA ricombinante deve essere eluito dal gel. L'uso di un reticolante reversibile di acrilammide, come N, N'-bis (acriloil) cistamina23, facilita il recupero, in particolare quando purificare grandi quantità di RNA (Figura 6). Infine, se a valle applicazione del RNA prodotto richieste di separazione del RNA di interesse dal patibolo viroide, il nostro protocollo non offre alcun vantaggio particolare ai metodi precedenti. il RNA di interesse deve essere asportata dalla molecola chimerica utilizzando alcune delle strategie precedentemente descritte, come l'uso dei ribozimi, DNAzimi o, forse più efficiente, l'uso di RNasi H guidato da due DNA oligonucleotides7. Cercando di evitare questo ultimo passaggio di purificazione ingombrante, abbiamo lavorato per cercare di ridurre le dimensioni dell'impalcatura viroide, anche se con un successo parziale. Siamo stati in grado di produrre notevoli quantità di RNA ricombinante usando forme viroide eliminato (175, 215 e 246 nt) ma le eliminazioni dell'impalcatura viroide l'aumento correlato con la diminuzione di accumulo12.

In somma, qui un protocollo è descritto per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in e. coli che, a nostra conoscenza, migliora il rendimento dei metodi precedentemente pubblicati. Il protocollo si basa di co-espressione in e. coli del RNA di interesse inseriti in un'impalcatura viroid (ELVd) e la melanzana ligasi di tRNA, l'enzima che circularizes questo viroide in piante infette. Una caratteristica distintiva del nostro protocollo è quello ricombinante che RNA viene prodotta principalmente come una forma circolare, una proprietà che facilita la purificazione di omogeneità per applicazioni a valle. Usando questo protocollo decine di milligrammi di ricombinante che RNA possa essere prodotte facilmente per litro di coltura di Escherichia coli in condizioni normali di laboratorio.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che la tecnologia descritta in questo protocollo è stato brevettato (US Patent No. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP da Spagnolo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanziati fondi FEDER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

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References

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Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in <em>Escherichia coli</em>
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