Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Здесь мы представляем протокол производить большое количество рекомбинантных РНК в Escherichia coli совместно выразить химерных РНК, содержащий РНК интерес к вироиды леску и завод лигаза тРНК. Основным продуктом является циркуляр молекула, которая облегчает очистки до однородности.

Abstract

С ростом интереса к биологии РНК и использования молекул РНК в сложных биотехнологических приложений, методы производить большое количество рекомбинантных молекул РНК ограничены. Здесь мы описываем протокол производить большое количество рекомбинантных РНК в Escherichia coli на основе совместного выражения химерных молекулы, содержащий РНК интерес к вироиды леску и завод лигаза тРНК. Вироиды являются относительно небольшой, без кодирования, высоко в паре базы круговой РНК, которые являются инфекционные высших растений. Узел завод tRNA лигаза является ферментом, завербован вироиды, которые принадлежат к семейству Avsunviroidae, как баклажаны латентной вироиды (ELVd), выступить посредником РНК рецензий во время репликации вироиды. Хотя ELVd не реплицируется в E. coli, прекурсор ELVd эффективно транскрибируются РНК полимеразой E. coli и обработаны рибозимы встраиваемых молот в бактериальных клетках и результате мономеров circularized совместно выразили tRNA лигаза достижения замечательных концентрации. Включение РНК интерес в ELVd леса позволяет производство десятков миллиграмм рекомбинантного РНК за литр бактериальной культуры в регулярных лабораторных условиях. Основная часть продукта РНК круговые, особенность, которая облегчает очистки рекомбинантных РНК до виртуальных однородности. В этом протоколе взаимодополняющих ДНК — (cDNA кДНК) соответствует РНК интерес вставляется в определенной позиции ELVd cDNA в выражение плазмида, которая используется, вдоль плазмида выразить совместно баклажаны tRNA лигаза, чтобы преобразовать E. coli. Сопредседатель выражения обеих молекул под контролем сильных учредительный промоутеров приводит к производства большого количества рекомбинантных РНК. Рекомбинантных РНК могут быть извлечены из бактериальных клеток и отделены от основной части бактериальных RNAs воспользовавшись его округлости.

Introduction

В отличие от ДНК и белков протоколы для простой, эффективной и рентабельной производства большого количества РНК не обильные. Однако исследования и промышленность спроса все большее количество этих биомолекул расследовать их уникальные биологические свойства1, или на работу в сложных биотехнологических применений, включая их использование в качестве весьма конкретной аптамеры 2, терапевтические3или селективного пестицидов4. In vitro транскрипция и химического синтеза для производства РНК обычно используются в научных исследованиях. Однако эти методы предусматривают важные ограничения, когда требуются большие объемы продукции. Логической альтернативой является использование механизма эндогенного транскрипции живых клеток, последовал процесс очистки отделить RNAs интерес от сотовой товарищей. Следуя этой стратегии, были разработаны методы для получения рекомбинантных молекул РНК в бактериальной клетки, такие как лаборатории дружественный Escherichia coli5 или морской фиолетовый фототрофных альфа proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. Большинство методов для получения рекомбинантных РНК бактерий полагаются на выражение собственного высокостабильных РНК леску, такие как tRNA или рРНК, в котором находится РНК интерес вставлен7. Это накладывает необходимость освобождения РНК интерес из химерных молекулы, если наличие дополнительных РНК является проблемой для нисходящие приложения8. Другая концепция в рекомбинантной биотехнологии РНК является производство рекомбинантных рибонуклеопротеида комплексов, которые могут быть желаемого продукта per se или используются в качестве защитной стратегии для повышения стабильности РНК интерес9, 10. Аналогично производство круговой РНК также было предложено как стратегии для создания более стабильных продуктов11.

Мы недавно разработали новый метод производить большое количество рекомбинантных РНК в E. coli , который участвует в трех вышеупомянутых концепций: вставки РНК интерес к высокостабильных круговой РНК леску и Сопредседатель выражение рекомбинантных РНК с взаимодействуя белками вероятно производить стабильный рибонуклеопротеида комплекс, который накапливается в замечательной количествах в бактериальных клетках12. В отличие от предыдущих разработок мы использовали РНК эшафот, совершенно чужды кишечной палочки, а именно вироиды. Вироиды представляют собой особый тип инфекционных агентов высших растений, которые составляются исключительно на относительно небольшой (246-401 nt) высоко в паре базы круговой РНК13. Интересно, что вироиды не кодирования РНК, и без помощи от их собственных белков, они способны выполнять сложные инфекционные циклы в зараженных хостов14. Эти циклы относятся репликация РНК-РНК в ядрах или хлоропласты, в зависимости от семьи вироиды —Pospiviroidae или Avsunviroidae, соответственно — движение через зараженные растения и уклонение разместить защитную реакцию. Вироиды должны быть занимала среди наиболее стабильных РНК в природе, будучи голый круговой РНК и того, чтобы выжить в условиях враждебной зараженных растительных клеток. Это свойство может сделать вироиды особенно подходит как подмости для стабилизации рекомбинантной РНК в биотехнологических подходов. Кроме того новый метод на основе совместного выражения вироиды леску с взаимодействующих растительного белка. Вироиды реплицировать через механизм подвижного круга, в котором хозяин ферменты набираются стимулировать различные этапы этого процесса. Особенно некоторые вироиды, в частности тех, которые принадлежат к семье Avsunviroidae15, содержат рибозимы, которые также участвуют в репликации. В зависимости от видов вироиды транскрипция вироиды РНК при посредничестве принимающей РНК-полимераза II или хлоропластной-кодировке РНК-полимеразы (НЭП). Вироиды РНК обработки, как представляется, быть катализатором узлом РНКазы III типа, хотя в вироиды с рибозимы олигомерных РНК интермедиаты самостоятельно прилепится во время репликации. Наконец результате вироиды мономеров являются circularized, в зависимости от семьи вироиды, принимающей ДНК лигаза 1 или хлоропластной изоформы tRNA лигаза16,17. Этот последний фермент участвует в перевязки Мономерных форм вироиды в семье Avsunviroidae, как баклажаны латентной вироиды (ELVd)18.

В ходе работы проанализировать последовательность и структурных требований ELVd определяют признание, баклажаны (Solanum melongena L.) tRNA лигаза, мы создали экспериментальной системы на основе совместного выражения обеих молекул в E. coli 19. Мы заметили, что больше чем единица ELVd стенограммы самостоятельно эффективно расщеплять в клетках E. coli через встроенный молот рибозимы и что результате вироиды мономеров с 5'-гидроксильные и 2', 3'-Фосфодиэфирная Термини эффективно circularized, совместно выразили баклажаны лигаза тРНК. Даже больше результирующий РНК круговой вироиды достигли неожиданные высокой концентрации в E. coli, превышающие эндогенного теорией12. Отсутствие посредников репликации указывает отсутствие усиления ELVd РНК-РНК в эти клетки бактерий. Интересно, что вставки гетерологичных РНК в определенной позиции вироиды молекулы имел умеренное воздействие на накопление круговой вироиды производные РНК-12. Эти замечания сделал нас себе метод производить большое количество рекомбинантных молекул РНК бактерий. В этом методе cDNAs соответствующий RNAs интерес вставляются в ELVd cDNA и результате химерных РНК выражается в E. coli через сильный учредительный промоутер. Для работы системы E. coli совместно должны быть преобразованы с плазмида выразить баклажаны лигаза тРНК. Стенограмма дольше чем блок ELVd производные обрабатывается рибозимы встраиваемых молот и результате мономеров с соответствующим Термини, признаются и circularized совместно выразили лигаза тРНК. Таким образом, в очень стабильные круговые эшафот, состоящий из вироиды циркуляр молекула вставляется РНК интерес. Этот рекомбинантных химерных РНК является наиболее вероятно далее стабилизировать внутри клеток E. coli путем формирования рибонуклеопротеида комплекса путем взаимодействия с тРНК лигаза. С помощью этого метода (см. Протокол ниже), были легко производится в количестве десятков миллиграмма на литр культуры е. coli в регулярных лабораторных условиях и очищен до однородности принимая аптамеры РНК, заколка РНК и других структурированных РНК преимущество округлости12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. плазмида строительство

  1. Усилить методом ПЦР (или обратной транскрипции ПЦР если начиная с шаблоном РНК) cDNA, соответствующий РНК с помощью грунтовки с 5' расширение чтобы позволить Ассамблее в выражение плазмиду интереса. Чтобы избежать нежелательных мутации, используйте высококачественный ДНК-полимеразы.
    1. Чтобы вставить cDNA в выражение плазмида, Гибсон Ассамблеи20, добавьте следующие 5' расширения праймеры PCR: вперед, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; обратный, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X представляет нуклеотидов гомологичных терминала концы РНК интерес.
    2. Инкубируйте 30 s на 98 ° C, а затем 30 циклов 10 s на 98 ° C, 30 сек при 55 ° C и 30 s при 72 ° C и окончательное расширение 10 мин при 72 ° C.
  2. Дайджест 100 нг плазмида pLELVd-BZB с 10 U энзима ограничения типа IIS Bpi я за 1 ч при 37 ° C в 20 мкл реакции в 0,5 мл трубку в буфере G (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 10 мм MgCl2, 50 NaCl 0,1 мг/мл BSA).
    Примечание: Все плазмид доступны по запросу соответствующего автора. BPI Я эквивалентно Bbs я.
  3. Отдельные продукты PCR и пищеварение электрофорезом геля агарозы 1% в буфер TAE (40 мм трис, уксусная кислота, ЭДТА 1 мм, 20 мм pH 7.2). Пятно гель для 15 мин путем встряхивания в 200 мл 0,5 мкг/мл ethidium метила. Визуализировать ДНК с помощью УФ transilluminator и нарезать полосы, соответствующие усиливается cDNA и я переваривается плазмида Bpi (2046 bp), с помощью лезвием скальпеля.
    Примечание: BPI Я переваривания pLELVd-BZB также выпускает 528 bp продукт, соответствующий LacZ сине белых репортер.
  4. Элюировать ДНК из фрагментов геля, с использованием столбцов силикагель (гель kit восстановление ДНК в Таблице материалов) и количественного определения концентрации ДНК спектрофотометрический анализ.
  5. Настройка реакции Ассамблеи Гибсон, используя усиливается cDNA и переваривается плазмида. Используйте вывозимому Молярная избыток вставка против вектор20. Инкубировать 1 час при температуре 50 ° C и очистить продуктов реакции, с помощью столбца силикагель (ДНК чистой и концентратор kit в Таблице материалы).
  6. Используйте чистые продукты реакции Ассамблеи Гибсон на electroporate компетентным E. coli DH5α клетки. С помощью 1-мм электропорации кюветы, применяются следующие параметры: 1500 V и 5 г-жа инкубировать 1 ч при 37 ° C в супер оптимизированный бульон с catabolite репрессий (SOC; Триптон 20 г/Л, экстракт дрожжей 5 г/Л, 0,5 г/Л NaCl, 2,5 мм KCl, 10 MgCl2 глюкозы 20 мм, pH 7.0) жидкой среде и затем распространилась на Бертани Лурия (LB; Триптон 10 г/Л, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 10 г/Л NaCl) агар (1,5%) плиты содержащий ампициллина 50 мкг/мл.
    1. Экран для колоний, соответствующий преобразованный E. coli клоны, которые вероятно включены вставки, 15 мин до обшивки electroporated клетки, распространение 30 мкл 50 мг/мл 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) в диметилформамиде. Инкубировать пластин на ночь при 37 ° C.
  7. Выбрать несколько белых колоний и расти на ночь при 37 ° C в жидких средах фунтов. Очищения плазмиды, используя алкалический комплекта (см. Таблицу материалы) и анализировать их размеры электрофорезом геля агарозы 1% в буфер TAE.
  8. Выберите наиболее вероятно рекомбинантных плазмид, основанные на электрофорезном миграции по сравнению с pLELVd-BZB управления. Подтвердить последовательность выбранных плазмиды путем sequencing используя праймеры 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' и 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' что фланг всего выражения кассету в pLELVd-BZB.
    Примечание: Помните, что эта плазмида содержит 528 bp polylinker с маркером LacZ, который заменяется cDNA интерес. Ограничения сопоставления может помочь выбрать право рекомбинантных плазмид.

2. РНК выражение

  1. Co-electroporate (см. условия в 1.6) выбранного E. coli штамм (E. coli BL21 или производная BL21) с pLELVd-BZB-производная, содержащий соответствующий РНК интерес и плазмида p15LtRnlSm совместно выразить cDNA Баклажаны tRNA лигаза. Используйте E. coli HT115(DE3), которому не хватает РНКазы III21, чтобы выразить с регионами длинные двуцепочечные РНК.
    Примечание: Оба РНК интерес и тРНК лигаза мРНК транскрибируются РНК полимеразой E. coli . Хотя присутствие этой lysogen не имеет вредных эффектов в штамм E. coli , требуется не DE3 lysogen для Экспресс T7 РНК-полимеразы.
  2. После инкубации 1 ч при 37 ° C в жидкой среде SOC тарелка electroporated бактерий в фунтов твердых среде, содержащей 50 мкг/мл Ампициллин и 34 хлорамфеникол мкг/мл. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  3. Выберите колонии и прививать 1 Л озадаченного колбу Эрленмейера с 250 мл жидкой среды потрясающий бульон (ТБ) (Триптон 12 г/Л, 24 г/Л дрожжевой экстракт, 0,4% глицерина, 0,17 М х2PO4и 0,72 М K2HPO4), содержащий ампициллина 50 мкг/мл и 34 хлорамфеникол мкг/мл. Проинкубируйте при 37 ° C с энергичной встряхивания на 180 оборотов в минуту (об/мин). Урожай бактерий между 12 и 16 часов после прививки культуры.

3. РНК извлечение и очистка

  1. Для аналитических целей Возьмите 2 мл аликвоты культуры в точках желаемое время и центрифуги в 14.000 x g на 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 50 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, pH 8.0 и 1 мм ЭДТА), vortexing.
    1. Добавьте один объем (50 мкл) 1:1 (v/v) смесь фенола (насыщена водой и достижение равновесного уровня рН 8,0 с трис-HCl, рН 8.0) и хлороформе. Разбить ячейки путем энергичных vortexing и отдельные водные и органические фазы центрифугированием на 5 мин в 14.000 x g.
    2. Тщательно восстановления водной фазы (верхний), которые содержит всего бактериальных РНК.
      Примечание: Препараты могут храниться при температуре-20 ° C для последующего анализа.
  2. Для препаративных целей наливайте культуры в центрифуге бутылка 250 мл и спин вниз клетки в 14.000 x g для 10 минут удалить супернатант. Вымойте клетки, resuspending в 30 мл воды. Трансфер в пластиковых пробирок и спин вниз клетки снова на тех же условиях.
  3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 10 мл буфера хроматографии (50 мм трис-HCl, рН 6,5, 150 мм NaCl, ЭДТА 0,2 мм), vortexing.
    Примечание: В это время клетки могут быть заморожены при-20 ° C приступить к очистке в любой другой момент.
  4. Используя свежие или талой бактериальным препаратом, перерыв клетки, добавив 1 тома (10 mL) фенол: хлороформа (см. шаг 3.2) и vortexing энергично.
  5. Центрифуга для 10 мин на 12000 x g, восстановления водной фазе и заново распаковать с 1 тома (10 mL) метилхлороформа на тех же условиях.
    Примечание: Подготовка РНК может храниться при температуре-20 ° C на данный момент.
  6. Дальнейшего очищения всего бактериальных РНК хромотографией Анионообменная. Фильтр RNA подготовка через 45 мкм фильтром шприц и нагрузки на 1 мл diethylethanolamine (открытое) столбца.
    1. Для очистки хроматографии используйте систему жидкостной хроматографии со скоростью потока 1 мл/мин. До загрузки образца, сбалансировать столбец с 10 мл буфера хроматографии (см. шаг 3.3 для композиции).
    2. Загрузить образец и промойте колонку с 10 мл буфера хроматографии. Элюировать РНК с 20 мл буфера (50 мм трис-HCl, рН 6,5, 1 M NaCl, 0,2 мм ЭДТА) и собирать 1 мл аликвоты.
      Примечание: РНК быстро elutes в первоначальных фракций. Столбец может быть повторно использован для дальнейшего очищения. Для этого промойте колонку с 10 мл воды и хранить при 4 ° C в 20% этанола.
  7. Поскольку большая часть рекомбинантного РНК накапливается в E. coli в круглую форму это свойство можно выгоду для очистки до однородности12. Отделите круговой РНК от линейной коллегами электрофорезом двумерного гель полиакриламида (2D стр.)-денатурации и денатурировать (8 М мочевиной) условий12,22.

4. РНК анализ

  1. Подготовить 5% гель полиакриламида (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, массе) в КЭ буфера (89 мм трис, 89 мм борной кислоты, 2 мм ЭДТА) содержащий 8 M мочевины.
  2. Микс 20 мкл РНК препаратов с 1 объем загрузки буфера (98% формамида, 10 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм ЭДТА, 0,0025% бромфеноловый синий и 0,0025% ксилола cyanol), (20 мкл) Инкубируйте 1,5 мин при 95 ° C в блоке Отопление и защелкните прохладно на льду.
  3. Загрузить образцы в геле полиакриламида и запустить электрофореза в соответствующих условиях в зависимости от размеров гель (например, запустить 140 x 130 x 2 мм гели для 2,5 ч в 200 V). Пятно гель для 15 минут в 0,5 мкг/мл бромид ethidium, смыть водой и визуализировать РНК под УФ светом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Производить рекомбинантные РНК в E. coli с помощью ELVd производные системы12, РНК интерес привиты к ELVd РНК эшафот. Этот химерных РНК совместно выразили вдоль баклажаны лигаза tRNA в E. coli. После обработки, расщепляется и circularized, химерных круговой РНК, из которого выступает РНК интерес, вероятно образует рибонуклеопротеида комплекс с совместно выразили баклажаны фермента, который достигает замечательных концентрация в бактериальных клетках ( Рисунок 1). Следовательно первый шаг для получения рекомбинантных РНК с помощью этой системы состоит из вставки cDNA, соответствующий РНК интерес в определенной позиции в ELVd cDNA, T245-T246 в ELVd варианте последовательности AJ536613. Плазмида pLELVd-BZB, который содержит polylinker на этой позиции с двумя Bpi I признание, сайты и синий/белый маркер ген LacZ, облегчает этой вставки, очень эффективный метод Гибсон Ассамблеи20. Выбор преобразованные E. coli клоны, содержащий нужный рекомбинантных плазмид облегчается синий/белый скрининг LacZ маркера. Плазмид в котором двойной Bpi я пищеварения была неполной и не может включать Вставка может производить синий колоний присутствии X-Гал. Рисунок 2 показывает электрофоретического анализа нескольких рекомбинантных плазмид, в которых были вставлены различные cDNAs. Эти плазмиды показывают различные миграции по сравнению с pLELVd-BZB. Обратите внимание, что pLELVd-BZB содержит маркер LacZ (528 bp), заменена cDNA, соответствующий РНК интерес. Таким образом хотя это зависит от размера вставленного cDNA, рекомбинантных плазмид обычно мигрируют быстрее, чем управления плазмида (рис. 2).

PLELVd-BZB-производные, которые содержат cDNAs соответствующий RNAs интерес используются вдоль p15LtRnlSm к co-electroporate E. coli. Совместно преобразованные бактерии выбираются на тарелках, содержащий ампициллина и хлорамфеникола. Затем, выбрали E. coli клоны выращенные при 37 ° C с сильным агитации в богатой среде ТБ. В условиях этой культуры производство рекомбинантного РНК является максимально12. Присутствие рекомбинантных РНК бактерий может контролироваться легко разорвать клетки с смесь фенола и хлороформа присутствии буфера и анализа РНК, какие разделы в буфере водный денатурации страницы. Рисунок 3 шоу бромид ethidium витражи полиакриламидных гелей, в которых общая РНК из различных E. coli клоны были отделены. Фотографии показывают сильных полос, которые соответствуют пустым ELVd и химерных ELVd форм, в которых были вставлены различные RNAs интерес. Интересно, мы находим основных фракции рекомбинантных РНК как круглую форму. Используя сочетание двух страниц под денатурируя условия на высокой и низкой ионной силы, цикличность основной фракции рекомбинантного РНК можно легко заметить (рис. 4).

В зависимости от вниз по течению, общая E. coli РНК подготовки, содержащий химерных ELVd-РНК интерес может быть цель нынешнего протокола. Однако при необходимости, подготовка РНК может неразделимая Анионообменная хроматографии. Хроматограмма на рисунке 5 показано эффективное сохранение E. coli РНК на столбец при низкой ионной силы (150 мм NaCl) и последующего элюции в высокой ионной силы (1 M NaCl). Большая часть РНК собирается в частях 2 и 3. Для очистки рекомбинантных РНК до однородности, могут быть приняты преимущество округлости. Круговой RNAs задерживаются в отношении их линейной коллегами в денатурации условий22. Эти РНК может быть этого eluted от геля после окрашивания бромид ethidium. Использование solubilizable геля полиакриламида, например, сшитого с N, N'-бис (acryloyl) Цистамин23, облегчает очищение большое количество рекомбинантных молекул РНК (рис. 6).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление системы на основе вироиды производить рекомбинантные РНК в E.coli. CDNA, соответствующий РНК интерес (98 nt Лонг РНК aptamer шпинат в схеме) вставляется в плазмиду pLELVd-BZB. E. coli совместно превращается с pLELVd-BZB-производная и плазмида p15LtRnlSm выразить баклажаны tRNA лигаза совместно. В E. coli, химерных Стенограмма ELVd-шпинат РНК является самостоятельной рассеченного (красные стрелки), рибозимы молот вироиды. Результате мономера признан совместно выразили лигаза тРНК и circularized. Рекомбинатные РНК состоит из круговой вироиды эшафот, из которого выступает РНК интерес (в зеленом). Накопление рекомбинантных РНК крупных сумм в E. coli вероятно результатом стабилизации рибонуклеопротеида комплекс с тРНК лигаза. Помимо разделения ELVd cDNA, плазмида pLELVd-BZB содержит МПУЕ репликации происхождения (pUC ori), ампициллин выбор ген (AmpR), промоутер мышиных липопротеина (lpp) E. coli и Терминатор рРНК (rrnC) и LacZ маркер. Плазмида p15LtRnlSm содержит p15A репликации происхождения (p15A ori), хлорамфеникол сопротивления ген (смR), E. coli lpp промоутер и Терминатор транскрипции фага Т7, помимо баклажаны tRNA лигаза cDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: электрофоретического анализа pLELVd-BZB-производные выражение плазмиды, которые содержат различные cDNAs интерес. Плазмиды были отделены электрофорезом геля агарозы 1%, который был окрашенных бромидом ethidium. Переулок 1, ДНК маркер с размерами в kbp некоторых компонентов на левой стороне; переулок 2, pLELVd-BZB; переулок 3, pLELVd-BZB производная выразить пустой ELVd; полосы 4-7, pLELVd-BZB производные выразить РНК aptamer шпинат (переулок 4), стрептавидина привязки aptamer (майной 5), РНК шпилька с прилегающих 42 регион двуцепочечной bp (переулок 6) и 3' перевод Кап независимые усилитель (КРТЗ) растения вирус (пер. 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Рекомбинантных РНК производится в E. coli с использованием системы, основанной на вироиды. Всего РНК из различных E. coli клоны были извлечены лечение с фенолом: хлороформ и аликвоты, разделенных денатурации страницы. Гели, окрашенных бромидом ethidium показываются. Рекомбинантных молекул РНК были произведены в BL21(DE3) E. coli (A) и (B) HT115(DE3). (A и B) дорожки 1, РНК маркер с размерами в nt слева; полосы 2, РНК из клонов E. coli выразить пустой ELVd (333 nt). (A) майнах 3 и 4, РНК из клонов E. coli выразить химерных ELVd форма, содержащая шпинат aptamer (98 nt) и aptamer привязки стрептавидина (42 nt), соответственно. (B) переулок 3, РНК из клон E. coli выразить химерных ELVd форма, содержащая 42 bp Лонг двойной мель РНК. Красные стрелки указывают на круговой рекомбинантных молекул РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Цикличность рекомбинантных РНК производится в E. coli с использованием системы, основанной на вироиды. Всего РНК из клон E. coli выразить химерных ELVd, который содержит aptamer шпинат были отделены от 2D денатурации страницы сначала под высоким и затем при низкой ионной силы. Бромидом ethidium были витражные гели. Синие стрелки показывают направления электрофоретической миграции. Красная стрелка указывает на круговой ELVd-шпинат, выборочно задерживается от линейной аналогов такого же размера в течение двух цветоделения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Хроматографическое очистки рекомбинантных РНК производится в E. coli с использованием системы, основанной на вироиды. Всего РНК от кишечной палочки клона, который производит химерных ELVd-3' КРТЗ (55 nt) были погружены на открытое хроматографии столбца, который был смыт присутствии 150 мм NaCl. РНК была этого eluted присутствии 1 M NaCl. Хроматограмма показывает поглощения в 254 Нм (синяя линия) и проводимости в mS/cm (оранжевая линия) против тома. Указываются различные этапы хроматографического разделения (уравновешивания, инъекции, вымыть, элюирование и столбец регенерации). Также указаны собранные фракций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Очистка до однородности рекомбинантного РНК производится в E. coli с использованием системы, основанной на вироиды. Всего РНК от кишечной палочки клона, который производит химерных ELVd-3' CITE были впервые очищенная методом хроматографии с использованием открытое-Sepharose столбец и затем разделенных 2D страницы. Первый гель был запущен под денатурации условий (8 M мочевины, буфер КЭ). После окрашивания бромидом ethidium, Группа гель, содержащий круглую форму рекомбинантного РНК была передана в верхней части второй гель, который выполнялся при условии не денатурации (буфер TAE). Акриламид второй гель был Пенополиолефины с N, N'-бис (acryloyl) Цистамин, что позволило солюбилизация фрагмент гель, который содержит чисто рекомбинантных РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследуя ELVd последовательность и структура потребностей участвующих в признании, баклажаны лигаза tRNA, мы заметили, что Сопредседатель выражение обеих молекул в не хост E. coli привело к неожиданным большое накопление вироиды круговой формы в бактериальных клетках19. Мы поняли, что большое накопление вироиды РНК в E. coli наиболее вероятно является следствием совместного выражения высокостабильных молекулы РНК, например относительно небольшой (333 nt), высоко на основе парные, круговой вироиды и белок, для которых это особое вироиды показывает высокое сродство. ELVd РНК должны набирать хост tRNA лигаза посредничать его рецензий во время репликации в зараженных растений17. Хотя у нас нет экспериментальное подтверждение, мы ожидаем, что оба молекулы образуют рибонуклеопротеида комплекса в E. coli , далее стабилизирует вироиды РНК и позволяет достичь замечательных концентрации 150 мг на литр бактериальных Культура, которая высоко превышает те эндогенных молекул РНК, такие как теорией12. Так как ELVd не реплицировать в E. coli, мы полагали, что вставки гетерологичных РНК не будет существенно влиять на накопление вироиды производные РНК, и в самом деле, это было так. Это замечание является основой метода производить большое количество рекомбинантных РНК в E. coli , что мы здесь описать. Данный метод использует Циркуляр молекула РНК ELVd как леса, на котором представлен РНК интерес. Производить круговой ELVd леску в E. coli, мы должны выразить предшественником РНК с повторяющиеся области вироиды молот рибозима. Рибозимы ELVd само прилепится очень эффективно в E. coli и результате вироиды мономеров, признаются и circularized совместно выразили лигаза тРНК. Совместное выражение tRNA лигаза является ключевой особенностью системы. ELVd РНК в E. coli вряд ли обнаруживается, если этот особый фермент совместно выразили12.

В нашем протокол плазмида pLELVd-BZB позволяет вставить cDNA, соответствующий РНК интереса, простой и эффективный Гибсон Ассамблеей между позициями, U245 и U246 ELVd. Этот сайт соответствует терминала цикла длинный шпильки в конформации скорее ELVd,24,,25. Вставки в этой конкретной позиции должны содействовать РНК интерес выступает из очень стабильная эшафот, образованный ELVd и должны избегать внутримолекулярной взаимодействия РНК интерес и ELVd (рис. 1). Мы не исследовали эффект вставки РНК интерес альтернативные положения молекулы ELVd. Плазмида p15LtRnlSm позволяет совместно выражение баклажаны лигаза тРНК. РНК транскрибируется в обоих плазмид под контролем учредительный сильный E. coli промоутер, а именно murein липопротеины плотности (ЗПС). Это делает систему учредительный без необходимости индукции. Однако мы также построить аналогичный плазмида (p15tRnlSm) выразить tRNA лигаза под контролем фага Т7 РНК-полимеразы в изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) индуцибельной системе. С помощью этого плазмида, накопление рекомбинантных РНК происходит только после индукции tRNA лигаза выражения путем добавления IPTG12. В текущей системе РНК интерес выражается с высоким копии номер плазмида с МПУЕ репликации происхождения, в то время как tRNA лигаза выражается от умеренных копии номер плазмида с p15A репликации происхождения. Ли изменения копировать количество обоих плазмид, участвующих в системе улучшает накопление рекомбинантного, которую РНК пока не изучены. Диапазон размеров РНК интерес, признался в системе не был систематически расследуются либо, хотя логически, ожидается, что малые РНК будут аккумулироваться до более высоких концентрациях, чем крупные.

Одна из причин, почему производство рекомбинантных РНК в естественных условиях не просто является наиболее вероятно из-за внутренней низкой half-life молекул РНК. Наша система не является чужеродным для этой проблемы. В самом деле в конце E. coli растущей фазе, накопление рекомбинантных РНК начинает уменьшаться практически исчезают12. Это вынуждает найти в правом окне урожай клетки. Мы, однако, отметил, что это окно является достаточно большой, чтобы сделать систему удобной. Однако мы также отметил, что оптимальный окна зависит от многих факторов, включая особую E. coli напрягаться, питательной среды, условий роста (психомоторное возбуждение, объём колбы, проветривания, и т.д..) и стадии физиологического бактерий используется для запуска культур в жидкой среде. Мы рекомендуем начинать рекомбинантных производства РНК, с использованием свежих E. coli колоний от пластины прививки накануне и выросли на 37 ° C. Хранение в холодильнике пластины делает окно урожай более непредсказуемым. Мы получили наиболее последовательные результаты, начиная жидкого культур с бактериями, взял из плиты с зубочисткой. Использование жидкого предварительно культуры, особенно если насыщенных, также диски к изменчивости в протоколе производства.

Что касается очистки лечение бактериальных клеток с фенолом: хлороформ является весьма эффективным образом сломать клетки и позволяет количественных восстановления общей бактериальной РНК в водной фазе. В зависимости от течению применение рекомбинантного РНК эта водная фаза или подготовки, что результаты от проникающих РНК из этой водной фазе с алкоголем может быть достаточно. Если требуется дополнительная очистка, мы рекомендуем Анионообменная хроматографии с использованием открытое анион обменной колонны (рис. 5). Этот шаг очистки позволяет эффективное удаление ДНК и бактериальных метаболитов, которые также разделены в водной фазе. Если ниже по течению применение рекомбинантного РНК требует очистки до однородности, вироиды производные системы предлагает явное преимущество по сравнению с другими методами. Поскольку основная часть рекомбинантных РНК добывается как круглой формы, преимущество этого свойства могут быть приняты для отделить его от основной части бактериальных РНК. Круговой RNAs задержка в электрофоретической миграции в денатурации условий относительно линейной коллегами же размер22. Эта задержка является более выраженным при РНК electrophoresed под нижней ионной силы. На практике, круговой РНК может также были разделены двумерных денатурируя страницы под высоким и низким ионной силы (рис. 4). После электрофоретического разделения рекомбинантных РНК должны быть этого eluted от геля. Использование обратимых крест-компоновщик акриламида, такие как N, N'-бис (acryloyl) Цистамин23, способствует восстановлению, особенно когда очистки большого количества РНК (рис. 6). Наконец если течению применения производимых РНК требует разделения РНК интерес от вироиды эшафот, наш протокол не предлагают каких-либо преимуществ в предыдущих методах. РНК интерес должен иссечена от химерных молекулы, используя некоторые из ранее описанных стратегий, таких, как использование рибозимы, DNAzymes, или, возможно наиболее эффективным, руководствуясь двумя ДНК-олигонуклеотиды7использование H РНКазы. Пытаясь избежать этот последний шаг громоздкой очистки, мы работали на попытках уменьшить размер вироиды леску, хотя и с частичным успехом. Мы были в состоянии произвести заметное количество рекомбинантных РНК с помощью форм вироиды удалены (175, 215 и 246 nt) но увеличивая удаления вироиды эшафот коррелирует с снижение накопления12.

В общем здесь Протокол описан производить большое количество рекомбинантных РНК в E. coli , который, к нашему знанию, повышает доходность опубликованных ранее методов. Протокол основан совместного выражения интереса, вставляется в леске вироиды (ELVd) и баклажаны tRNA лигаза, фермент, который circularizes это вироиды в зараженных растений в E. coli РНК. Отличительной особенностью нашего протокола является что рекомбинантной РНК производится главным образом в виде круговой, свойство, которое облегчает очистки до однородности для нисходящие приложения. Используя этот протокол десятков миллиграмм рекомбинантного РНК могут быть легко произведены за литр культуры е. coli в регулярных лабораторных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что технология, описанная в настоящем протоколе был запатентован (нас патент No. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантов BIO2017-83184-R и BIO2017-91865-EXP от испанской Ministerio де наук, Декабрь Innovación y (совместно финансируемых ФЕДЕР фонды).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 141 рекомбинантные РНК круговой РНК РНК aptamer кишечная палочка вироиды tRNA лигаза
Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter