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Biochemistry

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli Co expresando un ARN quimérico que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. El principal producto es una molécula circular que facilita la purificación a homogeneidad.

Abstract

Con el aumento de interés en la biología del RNA y el uso de moléculas de ARN en aplicaciones biotecnológicas sofisticadas, los métodos para producir grandes cantidades de ARN recombinante son limitados. Aquí, describimos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli , basado en la expresión de una molécula quimérica que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. Los viroides son RNAs circular relativamente pequeños, no codificante, altamente vinculado de base que son infecciosos a las plantas superiores. El anfitrión planta Arnt Ligasa es una enzima reclutada por viroides que pertenecen a la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd), para mediar la circularización del RNA durante la replicación del Viroide. Aunque ELVd no replicar en e. coli, un precursor de ELVd eficientemente es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli y procesado por la ribozimas de cabeza de martillo incrustado en células bacterianas, y los monómeros resultantes son circular por el Co expresado Arnt Ligasa alcanzando una notable concentración. La inserción de un RNA de interés en el andamio ELVd permite la producción de decenas de miligramos de recombinantes RNA por litro de cultivo bacteriano en condiciones de laboratorio regulares. Una fracción principal del producto RNA es circular, una característica que facilita la purificación del ARN recombinante a homogeneidad virtual. En este protocolo, un complementario DNA (cDNA) correspondiente del ARN de interés se inserta en una particular posición del cDNA ELVd en un plásmido de expresión que se utiliza, a lo largo de los plásmidos expresar Co berenjena Arnt Ligasa, para transformar e. coli. Coexpresión de ambas moléculas bajo el control de promotores constitutivos fuertes conduce a la producción de grandes cantidades de ARN recombinante. El ARN recombinante puede ser extraído de las células bacterianas y separado de la mayor parte del ARN bacteriano aprovechando su circularidad.

Introduction

En contraste con el ADN y las proteínas, los protocolos para producción fácil, eficiente y rentable de grandes cantidades de ARN no son abundantes. Sin embargo, investigación e industria demanda cantidades crecientes de estas biomoléculas para investigar sus propiedades biológicas únicas1, o a emplearse en sofisticadas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo su uso como aptámeros altamente específicos 2, agentes terapéuticos3o pesticidas selectivo4. Transcripción in vitro y la síntesis química se utilizan en la investigación para producir RNA. Sin embargo, estos métodos implican limitaciones importantes cuando se requieren grandes cantidades de los productos. La alternativa lógica es utilizar la maquinaria de transcripción endógena de las células vivas, seguido por un proceso de purificación para separar el ARN de interés de los compañeros celulares. Siguiendo esta estrategia, se han desarrollado métodos para producir arn recombinante en células bacterianas, tales como el ambiente de laboratorio de Escherichia coli5 o la Marina púrpura fototrófica alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. mayoría de los métodos para producir arn recombinante en las bacterias dependen de la expresión de un andamio de RNA muy estable nativa, tales como inserta de un tRNA o un rRNA, en el cual el RNA de interés es7. Esto impone la necesidad de liberar el RNA de interés fuera de la molécula quimérica, si la presencia de ARN extra es un problema para las aplicaciones posteriores8. Otro concepto en recombinante biotecnología de RNA es la producción de complejos de ribonucleoproteína recombinante puede ser el producto deseado por sí o usado como una estrategia protectora para aumentar la estabilidad del ARN de interés9, 10. Del mismo modo, la producción de RNAs circular también ha sugerido como una estrategia para generar productos más estable11.

Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para producir grandes cantidades de RNA recombinante en e. coli que participa en tres de los conceptos anteriores: la inserción del RNA de interés en un andamio de RNA circular muy estable y la expresión conjunta de la células de RNA recombinante con una proteína interacción probable producir un complejo de ribonucleoproteína estable que se acumula en cantidades notables en bacterianas12. En contraste con los desarrollos anteriores, se utilizó un andamio de RNA totalmente ajeno a e. coli, es decir, un Viroide. Los viroides son un tipo muy particular de agentes infecciosos de plantas superiores que están constituidos exclusivamente por una relativamente pequeña (246-401 nt) muy vinculado a base de RNA circular13. Curiosamente, los viroides son no-codificación RNAs y, sin la ayuda de sus propias proteínas, que son capaces de completar ciclos infecciosos complejos en los anfitriones infectados14. Estos ciclos incluyen la replicación del ARN a ARN en el núcleo o cloroplastos, dependiendo de la familia de Viroide:Pospiviroidae o Avsunviroidae, respectivamente — movimiento a través de la planta infectada y la evasión de la respuesta defensiva del huésped. Viroides deben ser alineados entre los RNAs más estables en la naturaleza, como consecuencia de ser un ARN circular desnudo y tener que sobrevivir en el hostil ambiente de células de la planta infectada. Esta propiedad hace que los viroides particularmente conveniente como andamios para estabilizar recombinantes RNA en enfoques biotecnológicos. Además, el nuevo método se basa en la co-expresión del andamio Viroide con una interacción proteína vegetal. Viroides se replican mediante un mecanismo de círculo rodante en que host son reclutadas enzimas para catalizar las distintas etapas del proceso. En particular algunos viroides, concretamente aquellos que pertenecen a la familia Avsunviroidae15, contienen ribozimas que también participan en la replicación. Dependiendo de la especie de Viroide, transcripción de Viroide RNAs está mediada por el host de polimerasa II del RNA o el cloroplástico nuclear codificado polimerasa del RNA (NEP). Procesamiento Viroid RNA parece ser catalizado por un host Rnasa tipo III, aunque en viroides con ARN los ribozimas intermedios uno partirá durante la replicación. Por último, los monómeros resultantes del Viroide están circular, dependiendo de la familia de Viroide, por el ligase de la DNA del anfitrión 1 o la isoforma cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima participa en la ligadura de las formas monoméricas de los viroides de la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd)18.

En el curso de un trabajo para analizar los requisitos de ELVd secuencia y estructurales que determinan el reconocimiento de la berenjena (Solanum melongena L.) Arnt Ligasa, hemos creado un sistema experimental basado en expresión conjunta de ambas moléculas en e. coli 19. nos dimos cuenta que ELVd transcripciones de más que unidad Self-cleave eficientemente en las células de e. coli a través de los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y que los monómeros resultantes de Viroide y 5'-hidroxilo 2', 3'-fosfodiéster termini circular eficientemente por la berenjena Co expresado Arnt Ligasa. Más aún, el ARN Viroide circular resultante alcanzó una inesperada alta concentración en e. coli, superiores a las de los rRNAs endógeno12. Ausencia de replicación intermedios indica falta de amplificación ELVd ARN a ARN en las células bacterianas. Curiosamente, la inserción de RNAs heterólogos en una posición determinada de la molécula de Viroide tuvo un efecto moderado en la acumulación de la circular derivados de Viroide RNAs12. Estas observaciones nos hacen imaginar un método para producir grandes cantidades de recombinante RNAs en bacterias. En este método, se insertan los cDNAs correspondientes a los RNAs de interés en el cDNA ELVd y el ARN quimérico resultante se expresa en e. coli a través de un promotor constitutivo fuerte. Para que el sistema de trabajo, e. coli debe transformarse conjuntamente con un plásmido para expresar la berenjena Arnt Ligasa. La transcripción más que unidad ELVd derivado es procesada por los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y los monómeros resultantes con los términos apropiados son reconocidos y circular por el Arnt Ligasa Co expresado. Así, el ARN de interés se inserta en un andamio circular muy estable de la molécula circular de Viroide. Este ARN quimérico recombinante es probablemente más estabilizada dentro de las células de e. coli por la formación de un complejo a través de la interacción con los Arnt Ligasa ribonucleoproteína. Con este método (ver protocolo más adelante), RNA aptámeros, hairpin RNAs y otros RNAs estructurados han sido fácilmente producidos en cantidades de decenas de miligramos por litro de cultivo de e. coli en condiciones de laboratorio regulares y purificada a homogeneidad tomando ventaja de circularidad12.

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Protocol

1. construcción de plásmido

  1. Amplificar por PCR (o por transcripción reversa PCR si a partir de una plantilla de RNA) el cDNA correspondiente al RNA de interés usando las cartillas con extensión de 5' para permitir el montaje en el plásmido de expresión. Para evitar las mutaciones no deseadas, utilice una DNA polimerasa de alta fidelidad.
    1. Para insertar el cDNA en el plásmido de expresión por Gibson Asamblea20, agregar las siguientes extensiones de 5' a los iniciadores de la polimerización en cadena: hacia delante, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; reverso, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X representa los nucleótidos homólogas a los terminales extremos del RNA de interés.
    2. Incubar durante 30 s a 98 ° C, seguido de 30 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y 30 s a 72 ° C y una extensión final de 10 min a 72 ° C.
  2. Resumen 100 ng de plásmido pLELVd-BZB con 10 U de la enzima de restricción tipo IIS Bpi para 1 h a 37 ° C en una reacción de 20 μl de 0,5 mL tubo buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Nota: Todos los plásmidos son disponibles bajo petición al autor correspondiente. BPI Es equivalente a Bbs yo.
  3. Separar los productos de PCR y digestión por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE (40 mM Tris, pH de ácido acético, EDTA 1 mM, 20 mM 7,2). Manchar el gel durante 15 min por agitación en 200 mL de bromuro de etidio 0.5 μg/mL. Visualizar el ADN utilizando un transiluminador UV y cortar las bandas correspondientes a cDNA amplificado y el Bpi digerido plásmido (2046 bp) utilizando una hoja de bisturí.
    Nota: BPI I digestión de pLELVd-BZB también lanza un producto de bp 528 correspondiente a reportero LacZ azul blanco.
  4. Eluir el ADN de los fragmentos de gel utilizando columnas de gel de silicona (gel de DNA kit de recuperación en la Tabla de materiales) y cuantificar la concentración de DNA por análisis espectrofotométrico.
  5. Establecer una reacción de la Asamblea de Gibson usando el cDNA amplificado y el plásmido digerido. Utilizar un exceso molar 3-fold de inserción versus vector20. Incubar durante 1 h a 50 ° C y purificar los productos de la reacción usando una columna de gel de sílice (ADN limpio y kit concentrador de la Tabla de materiales).
  6. Uso de los productos purificados de la reacción de la Asamblea de Gibson a electroporate competente células de e. coli DH5α. Utilizar cubetas de electroporación de 1 mm, se aplican los siguientes valores: 1.500 V y 5 Sra. Incubar durante 1 h a 37 ° C en caldo super optimizado con represión catabólica (SOC; triptona 20 g/L, extracto de levadura 5 g/L, 0.5 g/L de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 glucosa 20 mM, pH 7.0) medio líquido y entonces extensión a Luria-Bertani (LB; 10 G/l triptona, extracto de levadura 5 g/L, 10 g/L de NaCl) agar (1.5%) las placas que contienen ampicilina 50 de μg/mL.
    1. Para la pantalla correspondiente a transformada de e. coli colonias de clones que probablemente incorporan el inserto, 15 min antes de platear las células electroporated, extensión 30 μl de 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) en dimetilformamida. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.
  7. Tomar varias colonias blancas y crecen durante la noche a 37 ° C en medio LB líquido. Purificar plásmidos utilizando una miniprep kit (véase Tabla de materiales) y analizar su tamaño por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE.
  8. Seleccione el plásmido recombinante más probable basado en la migración electroforética en comparación con el control de pLELVd-BZB. Confirmar la secuencia del plásmido seleccionado por secuenciación con cebadores 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' y 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' que flanquean el casete de expresión todo en pLELVd-BZB.
    Nota: Recuerde que este plásmido contiene un polylinker 528 de bp con el marcador LacZ que es reemplazado por el ADNc de interés. Mapeo de restricción puede ayudar a seleccionar la plásmidos recombinante derecha.

2. ARN expresión

  1. Co-electroporate (ver condiciones en 1.6) el seleccionado e. coli cepa (e. coli BL21 o un derivado de BL21) con el pLELVd-BZB-derivado que contiene el cDNA correspondientes del ARN de p15LtRnlSm interés y plásmidos expresar conjuntamente las berenjena Arnt Ligasa. Uso de la e. coli HT115(DE3), que carece de ARNasa III21, expresar RNAs con regiones de largo de doble hebra.
    Nota: Ambos el RNA de interés y el Arnt Ligasa mRNA es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli . No lysogen DE3 a expreso polimerasa del RNA T7 es necesaria en la cepa de e. coli , aunque la presencia de este lysogen no tiene ningún efecto nocivo.
  2. Después de 1 h de incubación a 37 ° C en medio líquido SOC, placa de electroporated las bacterias en medio sólido LB que contienen 50 μg/mL ampicilina y cloranfenicol μg/mL 34. Incubar durante una noche a 37 ° C.
  3. Tomar una colonia e inocular 1 L desconcertado matraz Erlenmeyer de 250 mL de medio líquido caldo buenísimo (TB) (triptona de 12 g/L, 24 g/L levadura extracto, 0.4% de glicerol, 0,17 M KH2PO4y 0,72 M K2HPO4), que contiene ampicilina μg/mL 50 y 34 de μg/mL cloranfenicol. Incubar a 37 ° C con agitación vigorosa a 180 revoluciones por minuto (rpm). Cosecha de bacterias entre el 12 y 16 h después de la inoculación de la cultura.

3. purificación y extracción de RNA

  1. Para fines analíticos, tomar alícuotas de 2 mL de la cultura en los puntos de tiempo deseado y centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 50 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0 y 1 mM EDTA) con un vórtex.
    1. Añadir un volumen (50 μL) de una mezcla 1:1 (v/v) de fenol (saturado con agua y equilibrado a un pH 8.0 con Tris-HCl, pH 8,0) y cloroformo. Romper las células con un vórtex vigoroso y separar las fases acuosas y orgánicas por centrifugación durante 5 minutos a 14.000 x g.
    2. Recupere cuidadosamente las fases acuosas (superior) que contiene ARN bacteriano.
      Nota: Las preparaciones pueden almacenarse a-20 ° C para posterior análisis.
  2. Para fines de preparación, vierta cultura en una botella de centrífuga de 250 mL y rotación de las células de 14.000 x g durante 10 min descartar sobrenadante. Lavar las células a resuspender en 30 mL de agua. Transferir a un tubo de centrífuga y centrifugar por células otra vez bajo las mismas condiciones.
  3. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de tampón de cromatografía (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) con un vórtex.
    Nota: En este momento, las células se pueden congelar a-20 ° C para proceder a la purificación en cualquier otro momento.
  4. Utilizando una preparación bacteriana fresca o descongelada, romper las células mediante la adición de 1 volumen (10 mL) de fenol: cloroformo (ver paso 3.2) y Vortex vigorosamente.
  5. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g, recuperar la fase acuosa y volver a extraer con 1 volumen (10 mL) de cloroformo en las mismas condiciones.
    Nota: La preparación de RNA puede almacenarse a-20 ° C en este punto.
  6. Además purificar RNA bacteriana total por cromatografía de intercambio aniónico. Filtrar la preparación de RNA a través de 45 μm filtro de la jeringuilla y carga en una columna de 1 mL diethylethanolamine (DEAE).
    1. Para la purificación de la cromatografía, utilizan un sistema de cromatografía líquida a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Antes muestra de cargar, equilibrar la columna con 10 mL de tampón de cromatografía (vea el paso 3.3 para la composición).
    2. Carga de la muestra y lavar la columna con 10 mL de tampón de cromatografía. Eluir el RNA con 20 mL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) y recogen alícuotas de 1 mL.
      Nota: RNA elutes rápidamente en las fracciones iniciales. La columna puede ser reutilizada para otras purificaciones. Para ello, lavar la columna con 10 mL de agua y almacenar a 4 ° C en 20% de etanol.
  7. Desde una parte importante de los recombinantes que RNA se acumula en e. coli en forma circular, esta propiedad puede ser beneficiada para la purificación a homogeneidad de12. Separar RNAs circular de las contrapartes lineales por electroforesis en gel de poliacrilamida de dos dimensiones (2D PAGE) combinando no desnaturalizantes y desnaturalizantes (urea de 8 M) condiciones12,22.

4. Análisis RNA

  1. Preparar un gel de poliacrilamida al 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- Metilenbisacrilamida, relación entre la masa) en la que contiene 8 M urea TBE buffer (89 mM Tris, el ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM).
  2. Mezcla 20 μl de preparaciones de RNA con 1 volumen (20 μl) de la carga del buffer (98% formamida, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, azul de bromofenol 0.0025% y 0.0025% xileno cyanol), incubar durante 1,5 minutos a 95 ° C en un bloque de calefacción y broche de presión frío en hielo.
  3. Cargar las muestras en el gel de poliacrilamida y correr la electroforesis en condiciones adecuadas según las dimensiones del gel (por ejemplo, ejecutar 140 x 130 x 2 geles mm 2,5 h a 200 V). Teñir el gel durante 15 min en bromuro de etidio 0.5 μg/mL, lavar con agua y visualizar RNA bajo luz UV.

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Representative Results

Para producir RNA recombinante en e. coli utilizando el sistema derivado ELVd12, el RNA de interés se injerta en un andamio ELVd ARN. Este ARN quimérico es co expresado a lo largo de la berenjena Arnt Ligasa de e. coli. Una vez procesado, troceados y circular, el ARN circular quimérico, de la que sobresale el RNA de interés, probablemente forma una ribonucleoproteína complejo con la enzima berenjena Co expresó que alcanza notable concentración en las células bacterianas ( Figura 1). En consecuencia, el primer paso para producir RNA recombinante utilizando este sistema consiste en insertar el cDNA correspondiente al RNA de interés en una determinada posición en el cDNA ELVd, T245 T246 en la variante de la secuencia ELVd AJ536613. Plásmido pLELVd-BZB, que contiene un polylinker en esta posición con dos Bpi I reconocimiento de sitios y un gen marcador azul/blanco de LacZ, facilita esta inserción la Asamblea Gibson muy eficiente método20. Selección de transformadas de e. coli clones que contienen la plásmidos recombinante deseada es facilitada por la proyección de azul/blanco de marcador LacZ. Plásmidos en los que la doble Bpi mi digestión era incompleta y no podría incorporar el inserto azul probable producir colonias en presencia de X-gal. La figura 2 muestra el análisis electroforético de varios plásmidos recombinantes en los que se insertaron diferentes cDNAs. Estos plásmidos muestran diferentes migraciones comparado pLELVd-BZB. Nota que pLELVd-BZB contiene el marcador LacZ (528 bp) que es substituido por el cDNA correspondiente al RNA de interés. Por lo tanto, aunque esto depende del tamaño del cDNA insertado, la plásmidos recombinante generalmente migran más rápido que el plásmido de control (figura 2).

El pLELVd-BZB-derivados que contienen los cDNAs correspondientes a los RNAs de interés se utilizan a lo largo de p15LtRnlSm a co-electroporate e. coli. Bacterias transformadas Co se seleccionan en las placas que contiene ampicilina y cloranfenicol. Seleccionado, e. coli clones se cultivan a 37 ° C con agitación fuerte en el medio rico de TB. Bajo esta condiciones de cultivo, producción de recombinantes que RNA es máximo12. La presencia del ARN recombinante en las bacterias puede controlarse fácilmente romper las células con una mezcla de fenol y cloroformo en presencia de un buffer y analizando el ARN, que las particiones en el buffer acuoso, desnaturalizando la página. Figura 3 ver bromuro de etidio manchado geles de poliacrilamida en que RNAs totales de e. coli de diferentes clones fueron separados. Las imágenes muestran fuertes bandas que corresponden al vacío ELVd y quimérica ELVd las formas en que se insertaron diferentes RNAs de interés. Curiosamente nos encontramos con una importante fracción del ARN recombinante como forma circular. Usando una combinación de dos páginas bajo condiciones de desnaturalización a fuerza iónica alta y baja, la circularidad de la principal fracción de los recombinantes RNA puede fácilmente observarse (figura 4).

Dependiendo de la aplicación aguas abajo, el total de e. coli RNA preparación que contiene el ARN ELVd quimérico de interés puede ser el objetivo del protocolo actual. Sin embargo, cuando sea necesario, la preparación de RNA puede ser más purificada por cromatografía de intercambio aniónico. Cromatograma en la figura 5 muestra la retención eficaz de e. coli RNA en la columna de baja fuerza iónica (150 mM de NaCl) y posterior elución a fuerza iónica alta (1 M NaCl). La mayor parte del RNA se recoge en las fracciones 2 y 3. Para purificar el RNA recombinante a homogeneidad, se puede tomar ventaja de circularidad. RNAs circular se retrasan con respecto a sus contrapartes lineales en desnaturalizar condiciones22. Estos RNAs pueden ser eluidos del gel después de la tinción de bromuro de etidio. El uso de un gel de poliacrilamida solubilizable, tales como reticulado con N, N'-bis (acryloyl) cistamina23, facilita la purificación de grandes cantidades de ARN recombinante (figura 6).

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del Viroide-sistema para producir arn recombinante en e. coli. El cDNA correspondiente al RNA de interés (el 98 nt-largo RNA aptámeros espinaca en el esquema) se insertan en el plásmido pLELVd-BZB. E. coli es transformado junto con la p15LtRnlSm pLELVd-BZB-derivado y plásmidos expresar Co berenjena Arnt Ligasa. En E. coli, la transcripción de ARN ELVd espinacas quimérica es uno mismo-hendida (flecha roja) por las ribozimas de cabeza de martillo de Viroide. El monómero resultante es reconocido por el conjunto expresado Arnt Ligasa y circular. El ARN recombinante consiste en un andamio de Viroide circular de la que sobresale el RNA de interés (en verde). Acumulación del RNA recombinante a grandes cantidades de e. coli probablemente resultado de la estabilización de la ribonucleoproteína complejo Arnt Ligasa. Además de la división ELVd cDNA, plásmido pLELVd-BZB contiene un origen de replicación pUC (pUC ori), un gen de selección ampicilina (AmpR), el promotor de lipoproteína murino (lpp) de e. coli y terminador de rRNA (rrnC) y el LacZ marcador. Plásmido p15LtRnlSm contiene un origen de replicación p15A (p15A ori), un gen de resistencia a cloranfenicol (CmR), el promotor de la e. coli lpp y un terminador de transcripción del fago T7, además de la berenjena tRNA ligase cDNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: análisis electroforético de plásmidos de expresión pLELVd-BZB-derivados que contienen diferentes cDNAs de interés. Plásmidos se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% que se tiñó con bromuro de etidio. Carril 1, marcador de ADN con tamaños de kbp de algunos de los componentes a la izquierda; carril de 2, pLELVd-BZB; carril 3, derivado de pLELVd-BZB expresar un ELVd vacía; Carriles 4 a 7, derivados de pLELVd-BZB para expresar el aptámero RNA espinacas (carril 4), la estreptavidina enlace aptámeros (carril 5), una horquilla de RNA con una región de doble hebra 42 contiguo de las bp (carril 6) y el 3' traducción de la casquillo-independiente potenciador (CITE) de una planta virus (carril 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: RNA recombinante producida en e. coli utilizando el sistema de Viroide. RNAs totales de e. coli de diferentes clones fueron extraídos por tratamiento con fenol: cloroformo y alícuotas separadas por desnaturalización de la página. Se muestran los geles teñidos con bromuro de etidio. Se produjeron ARN recombinante en e. coli (A) BL21(DE3) y (B) HT115(DE3). (A y B) carril 1, marcador de RNA con tamaños de nt a la izquierda; carriles 2, RNAs de clones de e. coli para expresar un vacío ELVd (333 nt). (A) carriles 3 y 4, RNAs de clones de e. coli para expresar una quimérica ELVd forman que contiene el aptámero espinacas (98 nt) y la estreptavidina enlace aptámeros (42 nt), respectivamente. (B) carril 3, RNAs de un clon de e. coli para expresar una forma ELVd quimérica que contiene un RNA trenzado doble 42 de bp de largo. Flechas rojas señalan el ARN recombinante circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Circularidad del ARN recombinante producida en e. coli utilizando el sistema de Viroide. Total RNAs de un clon de e. coli para expresar un ELVd quimérico que contiene el aptámero espinaca fueron separados por 2D desnaturalización página primero bajo alto y luego bajo baja fuerza iónica. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio. Las flechas azules indican las direcciones de migración electroforética. La flecha roja señala la circular ELVd-espinaca que selectivamente se retrasa de las contrapartes lineales del mismo tamaño durante las dos separaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Purificación cromatográfica de un recombinante RNA producida en e. coli utilizando el sistema de Viroide. Total RNAs de un clon de e. coli que produce un quimérico ELVd-3' CITE (55 nt) fueron cargados en una columna de cromatografía DEAE que fue lavada en presencia de 150 mM de NaCl. RNA eluyó en presencia de 1 M de NaCl. El cromatograma muestra absorbancia a 254 nm (línea azul) y la conductividad en mS/cm (línea naranja) versus volumen. Se indican los diferentes pasos de la separación cromatográfica (equilibrado, inyección, colada, elución y columna de regeneración). También se indican las fracciones recogidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Purificación a homogeneidad de un recombinante RNA producida en e. coli utilizando el sistema de Viroide. Total RNAs de un clon de e. coli que produce un quimérico ELVd-3' CITE primero purificada por cromatografía utilizando una columna de DEAE-Sepharose y entonces separado por página 2D. Primer gel se ejecutó bajo desnaturalizar condiciones (8 M urea, tampón TBE). Después de la tinción con bromuro de etidio, la banda de gel que contiene la forma circular del ARN recombinante fue transferida a la parte superior de un segundo gel que se ejecute en condiciones no desnaturalizantes (Tampón TAE). La acrilamida del gel del segundo fue reticulada con N, N'-bis (acryloyl) cistamina, que permite la solubilización del fragmento del gel que contiene el ARN recombinante puro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Durante la investigación los ELVd secuencia y estructura requisitos implicados en el reconocimiento por la berenjena Arnt Ligasa, nos dimos cuenta de que la expresión conjunta de ambas moléculas en el host no e. coli conducido a una inesperado gran acumulación de Viroide circular se forma en las células bacterianas19. Comprendimos que la gran acumulación de Viroide RNA en e. coli probablemente fue consecuencia de expresar Co una molécula de ARN altamente estable, como el relativamente pequeño (333 nt), basado en altamente-emparejado, Viroide circular y una proteína para que esta Viroide particular muestra alta afinidad. ELVd ARN debe reclutar el Arnt Ligasa de host para mediar su circularización durante la replicación en la planta infectada17. Aunque no tenemos confirmación experimental, Anticipamos que ambas moléculas forman un complejo en e. coli que además estabiliza el Viroide RNA y permite llegar a la notable concentración de 150 mg por litro de bacteriano ribonucleoproteína cultura que supera altamente los RNAs endógenos, tales como rRNAs12. Puesto que ELVd no reproduce en e. coli, razonamos que la inserción de un RNA heterólogo no iba a afectar dramáticamente acumulación del ARN Viroide derivado y, de hecho, ese fue el caso. Esta observación es la base del método para producir grandes cantidades de RNA recombinante en e. coli que Describimos aquí. El método utiliza la molécula de ARN circular de ELVd como un andamio en el que se presenta el RNA de interés. Para producir un andamio ELVd circular en e. coli, necesitamos expresar un precursor RNA con el dominio duplicado de la ribozima de cabeza de martillo de Viroide. Ribozimas ELVd auto partirá muy eficientemente en e. coli y los monómeros resultantes del Viroide son reconocidos y circular por el Arnt Ligasa Co expresado. Coexpresión de Arnt Ligasa es una característica clave del sistema. El ARN ELVd apenas es detectado en e. coli a menos que este enzima particular se expresa Co12.

En nuestro protocolo, plásmido pLELVd-BZB permite para insertar el cDNA correspondiente al RNA de interés conjunto de Gibson simple y eficiente entre las posiciones U245 y U246 de ELVd. Este sitio corresponde al bucle terminal de una horquilla larga presente en la conformación ELVd probablemente24,25. Inserción en esta posición particular debe promover que el RNA de interés sobresale del andamio muy estable formado por ELVd y debe evitar la interacción intramolecular entre el RNA de interés y ELVd (figura 1). No hemos explorado el efecto de la inserción del RNA de interés en posiciones alternativas de la molécula ELVd. Plásmido p15LtRnlSm permite la expresión de la berenjena Arnt Ligasa. ARN se transcribe en ambos plásmidos bajo el control de un fuerte constitutiva e. coli promotor, es decir, lipoproteína de murein (lpp). Esto hace que el sistema constitutivo sin necesidad de inducción. Sin embargo, también construir un plásmido similar (p15tRnlSm) para expresar el Arnt Ligasa bajo el control de la polimerasa del RNA T7 de fago en un sistema inducible de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Utilizando de este plásmido, acumulación del RNA recombinante sólo ocurre después de la inducción de expresión de tRNA ligase añadiendo IPTG12. En el sistema actual, el RNA de interés se expresa de un plásmido número copia alta con origen de replicación pUC, mientras que el Arnt Ligasa se expresa de un plásmido número copia moderada con origen de replicación p15A. Si alterar el número de copias ambos plásmidos implicados en el sistema mejora la acumulación de los recombinantes RNA no ha sido explorado hasta ahora. El rango de tamaño del RNA de interés admitido por el sistema no ha sido sistemáticamente investigado, aunque pequeño RNAs lógicamente se espera que se acumule a concentraciones más altas que los más grandes.

Una de las razones por qué la producción de ARN recombinante en vivo no es fácil es más probablemente debido al período baja intrínseco de las moléculas de ARN. Nuestro sistema no es ajeno a este problema. De hecho, en una tarde e. coli fase de crecimiento, acumulación de RNA recombinante empieza a disminuir para prácticamente desaparecer12. Esto obliga a encontrar la ventana adecuada para cosechar las células. Sin embargo, observamos que esta ventana es lo suficientemente grande como para que el sistema amistoso. Sin embargo, también observamos que la ventana óptima depende de muchos factores, incluyendo la particular e. coli cepa, medio de cultivo, cultivo de condiciones (agitación, volumen del matraz, respiradero, etcetera.) y la etapa fisiológica de las bacterias utilizado para iniciar el cultivo líquido. Recomendamos comenzar la producción de RNA recombinante utilizando fresco e. coli colonias de una placa inoculados el día anterior y aumentado a 37 ° C. Almacenar las placas en la nevera hace que la ventana de cosecha más impredecible. Se obtuvieron los resultados más consistentes por a partir de cultivos líquidos con bacterias de una placa con un palillo de dientes. El uso de un precultivo líquido, particularmente si saturado, también conduce a la variabilidad en el protocolo de producción.

Con respecto a la purificación, tratamiento de las células bacterianas con fenol: cloroformo es una manera muy eficaz para romper las células y permite la recuperación cuantitativa del ARN bacteriano en la fase acuosa. Según la aplicación posterior de los recombinantes RNA, esta fase acuosa o la preparación que resulta de la precipitación del ARN de este fase acuosa con un alcohol puede ser suficiente. Si necesita purificación adicional, se recomienda la cromatografía de intercambio aniónico, empleando una columna de intercambio aniónico DEAE (figura 5). Este paso de purificación permite la eliminación eficiente de ADN y de metabolitos bacterianos que también reparten en la fase acuosa. Si la aplicación aguas abajo del ARN recombinante requiere purificación a homogeneidad, el sistema deriva de Viroide ofrece una clara ventaja en comparación con otros métodos. Puesto que una fracción principal del RNA recombinante es producida como una forma circular, de esta propiedad puede aprovechar para separar de la mayor parte de ARN bacteriano. RNAs circular experimentan un retraso en la migración electroforética de desnaturalizar las condiciones con respecto a las contrapartes lineales del mismo tamaño22. Este retraso es más pronunciado cuando el ARN es electrophoresed en fuerza iónica baja. En la práctica, puede de RNAs circular también ha separado por página desnaturalización bidimensional de alta y baja fuerza iónica (figura 4). Después de la separación electroforética, el ARN recombinante debe ser eluido del gel. El uso de un vinculante reversible de acrilamida, tales como N, N'-bis (acryloyl) cistamina23, facilita la recuperación, especialmente cuando purificar grandes cantidades de ARN (figura 6). Por último, si uso aguas abajo del ARN producido exige separación del ARN de interés desde el andamio de Viroide, nuestro protocolo no ofrece ninguna ventaja particular a los métodos anteriores. El RNA de interés debe ser suprimido de la molécula quimérica utilizando algunas de las estrategias anteriormente descritas, como el uso de ribozimas, DNAzymes o, posiblemente más eficiente, el uso de la Rnasa H guiada por dos oligonucleótidos de ADN7. Tratando de evitar este último paso de purificación engorroso, hemos trabajado en tratar de reducir el tamaño del andamio Viroide, aunque con éxito parcial. Hemos sido capaces de producir notables cantidades de RNA recombinante utilizando formas de Viroide eliminado (175, 215 y 246 nt) pero aumentando las canceladuras del andamio Viroide correlaciona con disminución de acumulación12.

En suma, aquí un protocolo se describe para producir grandes cantidades de RNA recombinante en e. coli que, a nuestro conocimiento, mejora el rendimiento de los métodos previamente publicados. El protocolo se basa de coexpresión en e. coli del RNA de interés insertado en un andamio de Viroide (ELVd) y la berenjena Arnt Ligasa, la enzima que circularizes este Viroide en plantas infectadas. Una característica distintiva de nuestro protocolo es eso recombinantes que RNA se produce principalmente como una forma circular, una característica que facilita la purificación a homogeneidad de aplicaciones posteriores. Utilizando este protocolo decenas de miligramos de recombinantes que RNA puede ser fácilmente producido por litro de cultivo de e. coli en condiciones de laboratorio regulares.

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Disclosures

Los autores declaran que la tecnología se describe en este protocolo ha sido patentado (nosotros patente. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas BIO2017-83184-R y BIO2017-91865-EXP desde el Ministerio Español de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanciados fondos FEDER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

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References

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Bioquímica número 141 recombinantes RNA RNA circular Viroide Arnt Ligasa RNA aptámeros Escherichia coli
Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en <em>Escherichia coli</em>
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Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

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