Summary
여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3 를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.
Abstract
전자의 양성자 펌프 효소 ATP 생산에 사용 되는 양성자 동기 힘을 만드는 막에 걸쳐 체인 몇 redox 반응 양성자 전 좌를 전송 합니다. 막 단백질의 amphiphilic 자연 그들의 처리에 특히 주의 필요 그리고 양성자 전 좌 처럼 막 전송 프로세스를 공부를 할 때 자연 지질 환경으로 재구성 불가결 하지 않습니다. 여기, 우리는 예를 들어 대장균 에서 시 토 크롬 보3 복용 막 산화 환 원 효소의 양성자 펌핑 메커니즘의 조사를 위해 사용 된 방법 선발. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법의 조합 quinone 수영장과 모니터 pH 변화는 루멘의 산화 상태를 제어 하는 데 사용 됩니다. 형광 현미경의 해상도 인해 수백 리 측정할 수 있습니다 동시에 동안 효소 콘텐츠 단일 효소 또는 liposome 당 전송 축소 될 수 있습니다. 각각 단일 효소 분석 전체 인구의 동작에 의해 그렇지 않으면 숨겨져 있을 수 있습니다 효소 기능 역학에서 패턴을 밝힐 수 있다. 우리는 자동된 이미지 분석을 위한 스크립트의 설명을 포함합니다.
Introduction
효소 메커니즘 및 활동에 대 한 정보는 앙상블 또는 macroscale 수준에 분자의 수백만에 수천에서 효소 인구와 측정 통계 평균을 나타내는 일반적으로 얻어진 다. 그러나 그것은 알려져 있다,, 효소 같은 복잡 한 고분자가 그들의 행동에 설명 할지도 모른다 및 앙상블 수준에서 관찰 하는 분자 메커니즘을 반드시 모든 분자에 대 한 유효 하지 않습니다. 개별 분자 가늠 자에 그런 편차는 광범위 하 게 지난 2 년간1동안 신흥 메서드의 다양 한 단일 효소의 연구에 의해 확인 되었습니다. 특히, 형광 탐지 개별 효소 활동의 효소 활동2,3 의 조사 또는 소위 메모리 효과 (낮은의 기간에 의해 성공 했다 높은 효소 활동의 기간을 발견 사용 되었습니다. 활동 및 반대로)4,5.
많은 단일 효소 연구 필요 효소 표면 또는 공간적으로 연속 관측 시야에서 충분히 긴 유지 하는 또 다른 방법은 고정에 움직일 수 있다. 리로 효소 캡슐 표면 효소 또는 단백질 단백질 상호 작용6,7인해 어떤 부정적인 영향을 방지 하면서 효소 immobilization 수 있도록 표시 되었습니다. 또한, 리 그들의 자연적인 지질 bilayer 환경8,,910단일 막 단백질을 공부 하는 독특한 가능성을 제공.
클래스의 막 단백질, 운반, 세포 막, 단백질은 지질 bilayers (예, 리)11로 재구성 하는 경우에 공부 될 수 있다 행동에 걸쳐 물질의 방향 전 연습 12,13. 예를 들어 양성자 전 좌, 간결한 및 핵 전자 수송 체인의 여러 효소에 의해 전시 ATP 합성에 사용 되는 양성자 동기 힘을 생성 하 여 세포 호흡에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 경우에,이 과정의 상세한 메커니즘 종종 애매 남아 있지만 활동을 양수 하는 양성자 전자 전송에 결합 이다.
최근, 우리 전기 화학의 대장균 (시 토 크롬 보3) 터미널 ubiquinol 산화 효소의 단일 효소의 활동을 양수 하는 양성자를 공부와 몇 형광 검출 가능성 입증 리14재구성 된다. 이것은 E 에서 준비 하는 리의 루멘으로는 pH에 민감한 막 불 침투성 형광 염료의 캡슐화에 의해 달성 대장균 극 지 지질 (그림 1A) 단백질 양은 대부분 리 (에 따르면 포아송 분포) 없거나 하나만 재구성된 효소 분자에 포함 되도록 최적화 되었다. 시 토 크롬 보3 의 두 기판 ubiquinone 솔루션에서 리 고 (주변) 산소를 형성 하는 지질 믹스에 추가 하 여 제공 되었다. 에 리는 띄엄띄엄 6-mercaptohexanol의 자기 조립된 단층으로 덮여 반투명 최상의 부드러운 골드 전극에 흡착 됩니다. 마지막으로, 전극은 간단한 spectroelectrochemical 셀 (그림 1B)의 하단에 장착 됩니다. Quinone 풀 산화 상태의 전기 제어 수를 유연 하 게 트리거 또는 pH에 민감한 염료에 의해 양성자 전 좌 결과로 리의 루멘 내 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용은 어떤 순간에 효소 반응을 중지 하는 효소입니다. 두 번째, 지질 바인딩된 형광 염료, 크기와 개별 리의 볼륨의 형광 강도 확인할 수 있습니다 사용 하 고 따라서 효소 양성자 펌프 활동의 정량화. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 특히 시 토 크롬 보3 분자는 양성자 동기 힘을 급속 하 게 사라지는 자연 누수 상태를 들어갈 수을 발견. 이 문서의 목표는 자세히 단일 liposome 측정의 기법을 소개 하는 것입니다.
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Protocol
1. 지질/정리-10/FDLL 믹스의 준비
참고: E. 대장균 지질 리 준비를 위해 사용 해야 한다 aliquoted ubiquinone 10 (효소 기판)와 긴 파장 형광 염료 표시 된 지질 (리 크기 결정)에 대 한 이전에 철저 하 게 혼합 된 재구성입니다.
- 유리 주사기를 사용 하 여, 지질 극의 클로 프롬의 전송 200 µ L에서에서 추출 대장균 (25 mg/mL) 5 mg aliquots 수 있도록 유리 튜브로.
- 1 mg/mL ubiquinone 10의 50 µ L 추가 (정리-10; 클로 프롬) 정리-10의 최종 비율 있도록 지질을: 지질 1: 100 (1 %w / w).
- 지질/정리-10에는 긴 파장 형광 염료 표시 된 지질 (FDLL) 1 mg/mL (0.4 %w / w)의 20 µ L를 추가 합니다.
- 짧은 vortexing, 클로 프롬 해결책 균질 하 고 부드러운 질소 또는 아르곤 흐름에서 클로 프롬의 대부분을 증발. 적어도 1 시간에 대 한 진공에서 더 증발에 의해 전적으로 클로 프롬 흔적을 제거 합니다.
참고: 지질 aliquots 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 불활성 분위기에서 몇 달 동안.
2. 시 토 크롬 보3 의 재구성
주: 시 토 크롬 보3 대장균에서 정화에 대 한 Rumbley 외에서 프로토콜을 따릅니다. 15 기본적으로 접혀 효소 샘플의 순도 보장 하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피 후 추가 Rumbley 그 외 여러분 에 의해 설명 된 선호도 정화 단계 15
- 그래서4, pH 7.4, 지질/정리-10/FDLL 건조의 한 약 수를 (5 mg, 단계 1.4)를 혼합 하 고 지질 영화 완전히 resuspended는 초음파 목욕 치료의 2 분 뒤까지 소용돌이와 혼합 40 m m MOPS-코/60 m m K2의 312.5 µ L를 추가 합니다.
- 25 m m 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic 산 (HPTS)는 리 안에 캡슐화 되어야 하는 pH에 민감한 형광 염료의 125 µ L를 추가 합니다.
- 250 m m n octyl β-D-glucopyranoside (OGP) 계면 활성 제의 137.5 µ L을 추가 하 고 소용돌이 사용 하 여 혼합 모든 지질에 계면 활성 제 micelles solubilized는 되도록 10 분 동안 초음파 물 목욕에서 sonicate. 1.5 mL 플라스틱 관으로 분산 전송.
참고: 지질 흐린 정지 계면 활성 제와 가용 화 후 투명 해야한다. - 시 토 크롬 보3 의 필요한 금액을 추가 (아래 참고 참조) 초순 50 µ L (시 토 크롬 보3 솔루션 플러스 물)의 총 볼륨을 추가 하 고. 롤러 믹서에 10 분 동안 4 ° C에서 품 어.
참고: 단일 효소 조건에 대 한 일반적인 금액은 0.1-0.2% (w/w 단백질 지질, 즉. 단백질의 5-10 µ g), 비록 목표만 전기 활동 (아래 참조)를 관찰 하는 경우 1-2% (단백질의 50-100 µ g)까지 증가 될 수 있다. 부정적인 제어로 리 시 토 크롬 보3 없이 준비 될 수 있습니다. - 그리고 4 개의 1.5 mL 튜브 캡으로 2 x 50 mg 및 폴리스 티 렌 microbeads의 2 x 100 mg 무게 건조 방지 하기 위해 파라핀 영화와 닫습니다.
참고: 사용 하기 전에, 폴리스 티 렌 microbeads 메탄올으로 세척 한다, 물 및 제조업체의 설명서에 따라 물에 저장.
참고: 물/microbead 혼합물을 사용 하는 경우 폴리스 티 렌 microbeads 편리 하 게 전송할 수 있습니다 넓은 팁 micropipette와 모자에. 물 다음 얇은 팁는 micropipette를 사용 하 여 microbeads에서 제거할 수 있습니다. - 분산 된 1.5 mL 플라스틱 튜브에 폴리스 티 렌 microbeads와 모자를 추가 하 고 몇 초에 대 한 짧은 회전을 수행 하 여 재구성 혼합물 (단계 2.4)로 폴리스 티 렌 microbeads의 1일50 mg 을 추가 합니다. 30 분에 대 한 계면 활성 제를 흡착 하는 폴리스 티 렌 microbeads에 대 한 롤러 믹서에 4 ° C에서 품 어.
- 폴리스 티 렌 microbeads 및 외피의 추가 반복 하 여 다음과 같습니다: microbeads 외피;의 60 분 의 50 밀리 그램 을 추가 microbeads 보육;의 60 분 의 100 mg 을 추가합니다 그리고 microbeads 외피의 120 분 의 100 mg 을 추가.
참고: 위에 정착된 microbeads 솔루션 단계 2.6 반투명으로 바뀝니다 proteoliposomes 형성 된다.
- 폴리스 티 렌 microbeads 및 외피의 추가 반복 하 여 다음과 같습니다: microbeads 외피;의 60 분 의 50 밀리 그램 을 추가 microbeads 보육;의 60 분 의 100 mg 을 추가합니다 그리고 microbeads 외피의 120 분 의 100 mg 을 추가.
- 얇은 팁는 micropipette를 사용 하 여 폴리스 티 렌 microbeads에서 proteoliposome 솔루션을 구분 합니다. 그래서 20 m m MOPS-코/30 m m K2의 90 mL에 분산을 희석4, pH 7.4 (MOPS 버퍼)와 Ti45 ultracentrifuge 튜브에 전송.
- Ultracentrifuge 유형 45 Ti를 사용 하 여 분산 125000 x g (r최대)에 proteoliposomes 펠 릿을 1 h에서 회전자.
참고: 비록 큰 버퍼에 희석은 마지막에 캡슐화 되지 않은 HPTS의 농도 줄이는 데 도움이 됩니다 작은 원심 분리기 튜브를 사용할 수 있습니다. - 상쾌한, 그래서4, pH 7.4 (펠 릿 resuspending) 없이 버퍼 20mm MOPS-코/30 m m K2와 펠 릿을 씻어. 헹 구는 버퍼를 삭제 후 다시 일시 중지는 proteoliposomes MOPS 버퍼의 500 µ L에 얇은 팁 micropipette와 앞뒤로 pipetting으로. 다음 1.5 mL 플라스틱 튜브를 전송 합니다.
- 12000 x g 파편을 제거에 5 분 동안 정지 원심 새로운 유리병으로 상쾌한 (재구성 된 proteoliposomes)를 전송 합니다.
- 밤새 4 ° C에서 재구성된 proteoliposomes 분산 저장 하 고 2 일 이내에 사용 합니다.
3입니다. 반투명 금 전극의 제조
참고: 부드러운 골드 표면 원자적 부드러운 실리콘 웨이퍼에서 99.99% 골드의 30 nm 두께 층의 서식 파일 제거 방법에 의해 얻어진 다. 금 층의 작은 두께 반투명 한 형광 관찰을 허용 해야 합니다 이후 중요 하다. 골드 증발 (물리적 증기 증 착, PVD)의 세부 정보는 다른 곳에16 찾을 수 수 하 고 여기에 덮여 있다만 템플릿-스트립. 또는, 매우 부드러운 골드 칩 구입하실 수 있습니다 다른 곳 ( 재료의 표참조).
- 표면에 증발 골드 bi 구성 요소 낮은 형광 에폭시를 사용 하 여 최대 9 유리 커버 전표 (두께 0.17 m m)를 붙입니다. 80 ° C 4 h에서 접착제를 치료.
- 자기 조립된 단층 (4 단계)와 수정, 전 그냥 칼 날 유리 커버 전표 실리콘 웨이퍼에서 분리 합니다. 커버 슬립의 얇음 때문에 균열 또는 휴식 유리 슬라이드 커버 전표를 분리할 때 주의.
4. 자기 조립된 단층 (SAM)와 금 표면 수정
- 5 mL 1 m m 6-mercaptohexanol (6MH)의 물 솔루션의 준비.
- 6MH 솔루션으로 갓 분리 골드 코팅 커버 전표 (3.1 단계)를 찍어와 밤새 20-25 ° C에 두고 (> 16 h) SAM을 형성 하기 위하여.
참고: Thiol 솔루션 골드 코팅 커버 슬립 잠복기 때 닫힌된 용기를 사용 해야 합니다 그래서 불쾌 한 냄새가 있다. - 다음 날, 6MH 솔루션에서 골드 코팅 커버 슬립을 제거, 물 또는 메탄올 그리고 소 프로 파 놀 간단히 씻고. 부드러운 가스 흐름에서 건조.
5. 전기 Proteoliposomes 활동의 테스트
참고: 효소의 화학 활동에 밀접 하 게 포장된 리 레이어 (5 단계) 확인 먼저 하 고 낮은 기 보장 범위 리 (6 단계)의 루멘에서 pH 변화를 측정 하 단일 소포 실험에 사용 됩니다.
- 골드 코팅 커버 슬립 spectro 전기 화학 셀에 조립 ( 그림 1참조). 확인 연락처 고무 o 링에 의해 정의 된 영역 외부 플랫 와이어와 금.
- 전해질 버퍼 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 셀 참조와 보조 전극 배치.
참고: 더 토론 섹션에서 논의 염화 없이 참조 전극 Au (I) 전기 화학 중 Cl의 형성을 방지 하기 위해 선호 됩니다. 여기, Hg/Hg2등4 (토. K2이렇게4) 참조 전극 사용 고 전위는 표준 수소 전극 (그녀)에 대 Hg/Hg20.658 V vs 그녀를 사용 하 여 등등4 (토. K2이렇게4). - 샘의 품질을 평가 하기 위해 오픈 셀 잠재적인 (OCP) 잠재력에 전기 임피던스 분광학 (0.1 Hz-100 kHz)를 실행 합니다. 입원을 임피던스 값을 변환 하 고 2πω ω는 주파수가 콜 콜 음모를 나누어 (다음 참조 임피던스 해석 및 변환에 대 한 내용은16,,1718 참조 스펙트럼)입니다.
참고: 6MH의 콤팩트 하 고 조밀한 SAMs 세미 원 콜-콜 플롯에 게 가까이 하 고 2.5-3.0 µ F/c m2 (그림 2A) 커패시턴스 값의 범위에서를 제공 해야 합니다. 세미 원 모양 또는 범위 밖 커패시턴스 값에서 상당한 편차를 가져온 경우 전극을 변경 합니다. - 스캔 속도 100 및 10 mV/s 잠재적인 지역-0.3-빈 순환 voltammograms (CVs) 실행 0.8 V. 일반적인 이력서 (그림 2B, 파선)에 표시 됩니다.
참고:이 입증 해야 거의 순수 용량 성 행동과 주변 산소 조건 에서도 중요 한 faradaic 전류의 부재 여기서 합니다. - 전기 화학 셀 proteoliposomes (0.5 mg/mL 최종 지질 농도, 1-2% (w/w) 시 토 크롬 보3 지질의 비율)을 추가 하 고는 피 펫과 약간 혼합. Proteoliposomes 전극 표면에의 흡착은 완료 (30-60 분 상 온에서) 때까지 기다립니다.
참고: 10 mV/s에서 순환 voltammograms (CVs) proteoliposomes 흡착 과정을 수행 하는 동안 실행할 수 있습니다. 흡착 연속 CVs 중지 변경 완료 됩니다. CV 기법에 대 한 정보는 다음 교과서에서 찾을 수 있습니다. 19 , 20 - 버퍼 솔루션 10 번 이상 변경 하 여 셀을 씻고 있지만 전극 표면이 완전히 건조 떠나 마십시오.
- OCP (그림 2A, 파란 선) 골드 전극에 SAM 그대로 확인 하에서 전기 화학적 임피던스 분광학을 실행 하 고 CVs와 스캔 속도 10 및 100 mV/s 시 토 크롬에 의해 촉매 ubiquinol 산화 (와 산소 감소)를 관찰 하 보 3 0 V vs 그녀에 대 한 전기 quinone 감소의 발병 가능성에서) (그림 2B).
6. 효소 양성자 형광 현미경 검사 법에 의해 펌핑의 탐지
- 골드 전극 단계 5.5 (즉, 5 µ g/mL)에 비해 적은 proteoliposomes x 100을 사용 하 여 있지만 5 단계에서 수정 합니다. 단일 효소 연구, 감소 시 토 크롬 보3 지질 비율 0.1-0.2% (w/w).
참고: 리 됩니다 띄엄띄엄 단일 기 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링 활성화 전극 표면에 흡착 됩니다. 이러한 단일 효소 조건에서 효소 전극 표면에 움직일 수 양의 촉매 전류의 관찰에 대 한 충분 하지 않습니다. - 전기 화학 셀 침수 기름 한 방울과 함께 거꾸로 형광 현미경의 오일 목표 (60 X)에 놓습니다. 전극 표면에 초점을 FDLL 형광에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여. 단일 리 현미경/목표의 회절 한계에 밝은 반점으로 나타납니다. FDLL 형광의 이미지를 가져가 라.
- HPTS 형광 필터 세트 HPTS 형광은 명확 하 게 표시 하 고 배경에서 구별할 수 확인 하려면 현미경에의 한 전환 (선택한 노출 시간에 단계 6.4 참조). 그렇지 않으면 경우 빛의 강도 증가.
- 두 HPTS 필터 세트를 대체 하 여 초과 이미지 수집을 수행 하기 위해 현미경 소프트웨어 프로그램 (메뉴 응용 프로그램 | ND 취득 Define/Run). 최소한 이미지 인수 사이의 지연 시간을 설정 합니다. 이 실험에서 사용 하 여 1 s 노출 (때문에 터렛 운동) 0.3 s 지연.
참고: 이러한 두 개의 채널에 형광 강렬 비율 나중 변환 됩니다 각 시간 지점에서 리 내부 pH에. 인수 기간; 예상된 pH 변화 속도 따라 다를 수 있습니다. 5 분은이 문서에서 사용 됩니다. - 이미지 수집 동안 잠재력을 변경 하는 potentiostat의 설정을 조정 합니다. 예,이 실험에서 사용 하 여 다음과 같은 순서: 0-60 s: 잠재력 적용 (즉, OCP); 60-180 s-0.2 V (vs 그녀);: 180-300 s: 0.4 V (vs 그녀) 이 경우, 두 번째 단계에만 적용 된 잠재력 (-0.2 V vs 그녀)는 효율적으로 quinone 풀을 줄이기 위해 충분 한.
- 실행 동시에 타임된 이미지 수집 (현미경) 및 잠재적인 시퀀스 (potentiostat) 동시에 두 측정을 수동으로 시작 합니다.
참고: 실험 반복할 수 있습니다 동일한 전극에 몇 시간 다른 영역 표면에서 현미경 단계 이동 하 여. 인수 사이의 지연 표면에 리의 완전 한 pH 평형 막으려고 5-10 분 이상 이어야 한다. 다른 기간 및 잠재적인 패턴 중 제한 때문에 HPTS의 photobleaching는 시간 이미징, 필요에 따라 적용할 수 있습니다.
7입니다. 형광 이미지 분석
참고: 일반적인 실험 즉, 두 개의 채널의 각 시간 단계 (예를 들어, 2.6 s) 이미지의 집합을 생성 (기간 * 2 / 2.6) 이미지. 이러한 이미지는 단일 효소 실험 하는 동안 기록 된 설정의 예로 연구 데이터 리즈 저장소21를 통해 액세스할 수 있습니다. 피지 (ImageJ) 및 높은 수준의 수학적 분석 프로그래밍 언어 소프트웨어 (이제부터 소프트웨어를 스크립팅으로 자세한 테이블의 자료 를 참조 함)를 사용 하 여 여러 단계는 이미지 처리에 의하여 이루어져 있었다.
- 피지를 사용 하 여 시간 경과 파일을 별도 이미지를 정렬 하 고 별도 채널 및 시간대 저장.
- 피지 내에서 제공 하는 Bioformats 가져오기를 사용 하 여 오픈 시간 경과 파일 (매크로 명령: 실행 ("바이오 형식 가져오기")).
- 플러그인 StackReg를 사용 하 여 정렬 단계 움직임을 담당 하는 첫 번째 각 프레임 또는 열 드리프트를 수집 하는 동안 발생 (매크로 명령: 실행 ("StackReg", "변환 번역 =")).
- 단일 폴더에 TIFF 형식에서 각 시간 단계 및 각 채널에 대 한 별도 압축 되지 않은 이미지 파일을 저장 합니다.
- 시간 경과 파일 메타 데이터에서 각 프레임에 대 한 정확한 타임 스탬프를 추출 하 고 이미지와 같은 폴더에 CSV 파일으로 저장. 또는, 수집 소프트웨어를 사용 하 여 타임 스탬프를 추출 하 고 수동으로 스프레드 시트 소프트웨어를 사용 하 여 CSV 파일에 저장 합니다.
참고: 이미지와 타임 스탬프 폴더 이제 스크립트 소프트웨어에 의해 분석 될 준비가 되어 있습니다. 7.1.1 단계입니다. -7.1.4. 피지 스크립트를 사용 하 여 automatized 수 있습니다 (제공 되는 시간 경과 파일의 일괄 처리에 대 한 파이썬에서 작성 된 스크립트 사용 하 여 "Ctrl-Shift-N" (Windows), 다음 파일 | 오픈 스크립트를 로드).
- 스크립트 소프트웨어를 사용 하 여 이미지의 automatized 처리. 소프트웨어에 제공 된 코드를 로드 하 고 끝에 실행을 클릭 합니다. 메시지가 나타나면 단계 7.1에서에서 이미지가 포함 된 폴더를 선택 합니다.
참고: 분석을 위한 스크립트 mlx 형식 라이브 스크립트, 식별 하 단일 리 차원 가우스 함수에 맞게, 필터링 하 고, 시간 적 각 관점에 pH 값을 측정의 광범위 한 의견으로 제공 됩니다. 다음 하위 단계는 스크립트에 의해 자동으로 실행 됩니다.- 하나의 실험에 대 한 모든 시간 프레임 이미지를 메모리에 로드 합니다.
- 단일 채널 (선택 높은 형광 강도 채널)에 대 한 모든 이미지를 평균 하 고 평균된 이미지를 사용 하 여 단일 리 일치 수도 있습니다 모든 최대값을 식별.
- 맞는 평균 이미지 2D-가우스를 확인 된 최대 기능을 하 고는 결과 저장 맞는 각 liposome에 대 한 매개 변수 (예: 장착된 liposome 그림 4A 참조).
- 크기, 순환 성, 강도 등 예상된 단일 리 기준에 따라 최대값 필터링. 낮은 신호를 소음으로 인해 제대로 장착 되어 리 거부, 밀접 하 게 liposome 이웃 또는 너무 이미지 가장자리 있습니다.
- 외부 파일에서 타임 스탬프를 로드 하 고 별도로 각 시간 프레임 이미지 차원 가우스 함수에 필터링 된 각 liposome을 맞는.
참고: 병렬 프로그래밍, 멀티 코어 CPU를 사용 하 여 크게 향상 시킬 수 계산 속도이 단계에서. - 필터링 단계 7.2.4 적용 하지만 각 시간 프레임에서 유사한 기준에 따라 다시 리.
- 각 시간 단계에서 볼륨 2 채널에 장착 되어 2 차원 가우스 함수로의 비로는 liposome의 형광 강도 비율을 정의 합니다. 두 개의 HPTS 채널에서 결정 및 보정 곡선 (8 단계)를 사용 하 여 농도의 비율에서 pH 값을 계산 합니다. 리에 대 한 결과 pH-시간 곡선을 플롯 하 고 그들의 pH 잠재력 적용 될 때 변경 합니다.
8. 수행 HPTS 형광의 보정 곡선
참고: 변환할 HPTS 형광 비율 intravesicular pH, 보정 곡선 해야 합니다 먼저 설립을 골드 투과율, 필터 품질, 등등과 같은 실험의 특정 한 조건 계정에 걸릴. 이 단계는만 번 수행 하 고 설치 및 측정 매개 변수 6 단계에서 동일 하 게 유지로 캘리브레이션 데이터를 사용할 수 있습니다.
- (시 토 크롬 보3 단계 5와 6.1에 설명 된 대로) 없이 띄엄띄엄 흡착된 리와 전극 준비.
- 농도 100 ng/mL를 만들려고 버퍼의 2 개 mL를 에탄올에 0.1 mg/mL gramicidin 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다.
- 두 개의 HPTS 채널에 대 한 두 개의 형광 이미지를 캡처하십시오.
- 그래서 1 M HCl 또는 1 M H2의 작은 aliquots의 추가 의해 세포의 pH를 변경4. 표준 pH 미터는 버퍼의 pH를 측정 하 고 두 개의 HPTS 채널에 대 한 두 개의 형광 이미지를 캡처하십시오.
- PH 범위 6-9 단계 8.4 반복 합니다.
- 7.2에서 알고리즘을 사용 하 여, 적합, 필터 및 모든 pH에서 개별 리의 평균 HPTS 형광 비율. 인계 HPTS 비율 평균 모든 리.
- 다음 방정식을 결과 pH 비 의존에 맞는:
어디 pK는는, R는a 와 Rb는 피팅 매개 변수. - PK는는, R는은 Rb하 고 변환 단계 7.2.7에서에서 개별 리의 HPTS 비율을 사용 합니다. 에 pH 값입니다.
어디 pK는는, R는a 와 Rb는 피팅 매개 변수.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
6MH의 샘과 금 수정 커버 슬립 (전극)의 품질 각 전기 화학 임피던스 분광학 실험 하기 전에 검사 됩니다. 그림 2A 리 흡착 전후 전기 화학 임피던스 분광학을 사용 하 여 측정 하는 대표적인 콜 콜 플롯을 표시 합니다. 샘의 품질 충분 한 경우에, 임피던스 분광학 세미 원 콜-콜 플롯 결과 거의 순수 용량 성 행동을 보여주어야 합니다. 콜 콜 플롯에 세미 원의 지름 2.5-3.0 µ F/c m2 범위에 있어야 하는 전극 표면의 더블 레이어 커패시턴스를 같습니다. 커패시턴스 변경 해야 크게 리 흡착 시 비록 커패시턴스에 약간의 증가 (높은 리 범위, 그림 2A, 하단) 관찰 될 수 있습니다 또는 낮은 임피던스에 약간의 변화를 관찰할 수 있다 주파수 (낮은 liposome 그림 2A, 보장 범위 위쪽).
전기 화학 촉매 전류 측정 주기적 voltammetry ubiquinol 산소 oxidoreductase 활동을 반영, proteoliposomes에서 시 토 크롬 보3 의 촉매 활동을 테스트 하 사용할 수 있습니다. 그러나, 흡착된 proteoliposomes의 높은 수량에만 중요 한 촉매 전류를 감지할 수 있으며 금 수정 커버 슬립에 proteoliposomes의 밀접 하 게 포장된 레이어 합니다. 그림 2B 중 낮은 또는 높은 liposome 보도 리 흡착 전후 전극의 대표적인 순환 voltammograms (CVs)를 보여 줍니다. 없음 faradaic 전류는 산소 감소 맨 골드 전극에 의해 SAM에 의해 차단 되기 때문에 빈 이력서에 관찰 된다. 0 V, 즉, 의 발병 가능성이 ubiquinone의 잠재력 관찰은 때 표면 리 높은 시 토 크롬 보3 콘텐츠 (1.3% (w/w)이이 경우에서), 산소 감소 때문에 명확한 촉매 파와 포화 감소 (그림 2B, 파란 선). Ubiquinone 풀 효소에 대 한 자연적인 기질으로와 전극 표면에 효소에서 전자 전송 전자 중개자로 작동 합니다. 우리 주의 높은 liposome 범위에서 개별 vesicles의 구별은 현미경에 의해 가능 및 낮은 범위 단일 liposome 연구에 필요한. 낮은 liposome 범위 (하지만 지질 비율이 높은 단백질), 촉매 전류는 크게 감소, 배경 (그림 2B, 빨간색 선)에서 거의 구별할 수 있습니다. 참고 단일 효소 조건 (낮은 단백질 지질 비율) 촉매 전류는 더 낮은 조차 및 안정적으로 측정 될 수 없습니다.
그림 3 리 3 다른 보상에서 전극에 흡착의 형광 이미지를 보여준다. 모든 이미지는 동일한 빛과 노출 조건에서 찍은 하 고 그들의 밝기가 직접 비교를 가능 하 게 동등 하 게 조정 했다. 염료 포함 하 리 밝은 반점으로 이미지에 표시 됩니다. 이미지의 중앙 부분 photobleached 몇 분 배경 형광 수준 (우리 주의 FDLL 상대적으로 photostable 이며 그림 3에서 완전 하 게 photobleached 되지 않습니다)을 공개 했다. 두 HPTS 채널에서 이미지는 어디에 superimposable, 두 채널 사이의 비율 (410/535와 470/535) 해당 pH 7.4이이 실험에 사용 하. 리 수 없습니다 HPTS 캡슐화는 리의 존재를 나타내는 FDLL 채널 볼 수 있습니다. HPTS 및 FDLL 채널의 차이 더 높은 보상에서 발음 가능성이 높은 liposome 범위에서 리 더 높습니다 파열 또는 표면에 융합 때문에.
이미지 분석 필요 ImageJ, 플러그인 StackReg 사용 하 여 (첫 번째 프레임)에 대 한 프레임의 정렬을 합니다. 맞춤 샘플의 약간의 열 드리프트 liposome 좌표 변경 실험의 표시줄 내에서 일반적으로 발생 합니다 때문에 대부분의 상황에서 불가결 아니다. 모든 추가 분석 스크립트 소프트웨어 코드를 사용 하 여 수행 됩니다. 이 코드는 자동 liposome 식별을 수행합니다. 리의 크기 Abbe 회절 제한 때문에, 그들의 형광 점 확산 함수 (그림 4A) 실제 liposome 직경 보다 훨씬 더 큰 볼 수 있다. 코드 2 차원 가우스 함수 (그림 4A)에 2 채널에 각 기의 형광 강도 맞는 고 pH 보정 곡선을 사용 하 여 변환 될 수 있는 그들의 체적 농도 비율을 계산 합니다. 모든 시간 프레임에 이러한 작업을 수행 하 여 pH 실험 (동영상 1)의 날짜 표시줄에서 모든 소포 안에 얻을 수 있습니다. 그림 4B 시 토 크롬 보3 콘텐츠는 1.3% 때 단일 이미지 내의 모든 소포 pH 변화의 중앙값을 보여 줍니다. (양성자 펌프) pH의 증가 명확 하 게 보이는 때-0.1과-0.3 V 사이 잠재적인 적용 됩니다, 하지만 하지 후자 이후 0 V 하지 quinone 풀을 줄이기 위해 충분 한. 시 토 크롬 보3 콘텐츠는 매우 더 낮다 (0.1%, 그림 4C의 단백질 지질 비율), 중간 곡선 될 그 빈 리 (그림 4D)에서 거의 구별할. 무작위 리 (그림 5, 6 및 7)의 개별 pH 흔적을 고려할 때 차이 분명 됩니다. 시 토 크롬 보3 없이 리 잡음 (그림 7)에 관하여 중요 한 pH 변경 표시, 리의 선택 (지배적) 증가 보여 또는 잠재적인 때 pH의 감소는 actives 적용 시 토 크롬 보3 (그림 6, 회색 영역). 리 사이 pH 추적에 확실 한 차이 시 토 크롬 보3 리 작업의 작은 하위 집합에만 낮은 단백질 지질 비율이 일치 합니다. 감소는 pH 증가의 보급은 효소 분자 (ca. 75%)의 "밖 으로" 방향을 호의 재구성 방법으로 설명 했다. 시 토 크롬 보3 지질 비율이 높은 (그림 5)는 pH 변화를 표시 하는 리의 일부 증가 됩니다. Note 또한 일부 리 양성자를 양수 중지 하 고 잠재적인 응용 프로그램의 끝 전에 양성자 분산 모드로 입력. 우리는 "누수 상태", liposome 루멘14다시 흘러 양성자를 수 있는 입력 시 토 크롬 보3 분자에이 동작 특성.
그들의 피팅 및 양성자 펌핑/누수 율의 결정을 포함 하 여 pH 흔적의 추가 분석을 수행할 수 있습니다 우리가 이전14,22 출판 및 연구 데이터 리즈 저장소에서 얻을 수 있습니다 스크립트를 사용 하 여 23 , 24.
그림 1: 방법의 원리. (A) 단일 효소 활동 모니터링의 원리 그리고 (B) 셀의 내부 부분을 설명 하는 장면으로이 작품에 사용 하는 실험적인 체제의 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 리의 전기 화학 반응. (A) 콜-콜 플롯 리 전후 OCP (0.22 V vs 그녀, 검은 제곱된 선)에서 측정 (1.3 %w / w 시 토 크롬 보3) 5 µ g/mL (빨간색 원 선)와 500 µ g/mL (파란색 원 선)의 농도에 솔루션에서 흡착. (100 mV/s (왼쪽된 패널)에서 B) 순환 voltammograms 및 10 mV/s (오른쪽 패널)의 Au-샘 (검은색 파선) 리 전후 (1.3 %w / w 시 토 크롬 보3) 5 µ g/mL (레드 라인)의 농도와 500 µ g/mL (파란 선) 솔루션에서 흡착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 형광 현미경 검사 법 리의. 다른 표면 보장 범위에 리의 형광 이미지: 5 µ g/mL (맨 위 행), 20 µ g/mL (중간 줄) 및 500 µ g/mL (아래쪽 행)의 리 솔루션으로 30 분 동안 incubated 표면. 왼쪽된 열에 해당 470/535 nm 여기/방출 필터 설치 (1세인트 HPTS 채널); 중간 열-410/535 nm (2nd HPTS 채널); 오른쪽 열-560/645 nm (FDLL 채널). 이미지 1 s 노출과 유사한 빛의 강도 (60 X 목표와 카메라 전에 현미경으로 1.5 배 확대), X 90 배율에서 찍은. 50 µ m에 해당 하는 규모 바 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Liposome 식별 및 pH 변화. (A) 형광 이미지를 포함 하는 전형적인 단일 liposome의 일부의 3D 보기. 그것의 형광 강도 포인트 확산 차원 가우스 함수 (블랙 메쉬)에 맞추는 기능 (색상 표면)으로 볼 수 있다. (B-D) 산도, 다른 적용된 잠재력에 (일반적으로 몇 백) 단일 이미지 영역 내에서 모든 소포의 중간값으로 표시 됩니다. 0-60 s에서 잠재력은 적용 (OCP). 60 그리고 180 s (회색 영역) 사이 다른 잠재력 적용: 0 V (블랙)-V (레드), 0.1-0.2 V (녹색),-0.3 V (파란색). 180와 300 사이 s, 0.4 V vs. 그녀는 적용 했다. 시 토 크롬 보3 지질 비율을 했다 (B) 1.3%, (C) (D) 0.1% 0%. 자취는 편의상 상쇄 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 효소의 1.3%를 포함 하는 리의 pH 흔적. PH의 72 단일 리, 무작위로 선택, 포함 하는 시 토 크롬 보3 (1.3 %w / w) 측정 및 실험을 한 동안 분석의 변화. 0-60 s에서 잠재력은 적용 (OCP); 60 그리고 180 s (회색 영역) 사이-0.2 V vs. 그녀; 180와 300 사이 s, 0.4 V vs. 그녀는 적용 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 효소의 0.1%를 포함 하는 리의 pH 흔적. PH의 72 단일 리, 무작위로 선택, 포함 하는 시 토 크롬 보3 (0.1 %w / w) 측정 및 실험을 한 동안 분석의 변화. 0-60 s에서 잠재력은 적용 (OCP); 60 그리고 180 s (회색 영역) 사이-0.2 V vs. 그녀; 180와 300 사이 s, 0.4 V vs. 그녀는 적용 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 효소 없이 리의 pH 흔적. 시 토 크롬 보3 측정 하 고 실험을 한 동안 분석 없이 무작위로 선택 72 단일 리의 pH 변화의 자취. S: 0-60에서에서 잠재력은 적용 (OCP); 60 그리고 180 s (회색 영역) 사이-0.2 V vs. 그녀; 180와 300 사이 s, 0.4 V vs. 그녀는 적용 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 단일 liposome pH 변화 애니메이션. (맨 위 패널) 두 개의 HPTS 채널에서 (해당 영역의 3D 표면 플롯으로 표시) 300 동안 liposome 형광의 변화 실험의 s. 감소 잠재력 60 사이 적용 된 s와 180 s. (하단 패널) 대응 플롯 시간 대 두 HPTS 채널의 체적 농도 비율의. 감소 잠재적인 응용 프로그램의 영역 회색에서 음영입니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
설명 하는 방법을 리로 재구성 될 수 있다 호흡 막 단백질에 의해 양수 하는 양성자를 공부 하는 게 적당 하다 고 quinone 풀 전자를 교환할 수 있습니다. Liposome 루멘 (그림 1A)에 pH에 민감한 (비율 계량) 염료를 사용 하 여 단일 효소 수준에서 양성자 펌프 활동을 모니터링할 수 있습니다.
방법은 전극 샘18수정 전자 교환 ubiquinone (또는 다른 퀴 논), 지질 bilayer에 통합의 능력에 의존 합니다. 샘, 수정 금 전극의 속성은 매우 구체적인. 리는 샘과 샘에 흡착 충분히 빠른 전기 화학 산화와 감소는 리에 quinone 수영장의 수 있도록 얇은 해야 필요가 있다. 중요 한 것은, 전극과 liposome 사이 상호 작용은 지질 막의 무결성을 손상 하지 않기 위하여 충분히 약한 있이 필요가 있다. 또한, 실험 시스템의 세부 사항에 따라 그것은 바람직한 경우는 샘 방지 측면 금 촉매 반응, 산소 감소 등. 마지막으로, SAM을 사용 하는 잠재적인 창 내에서 안정 해야 합니다. 6MH의 높은-품질 샘과 수정 초 평면 금 전극 사용 시 토 크롬 보3의 경우 이러한 요구 사항을 충족. 원자적 평면 실리콘 웨이퍼에서 골드 전극 스트립 만듭니다 매우 부드러운 골드 표면 근처 이상적인 샘 임피던스 스펙트럼에 표시 된 대로. 우리가 물에 6MH에서 SAM 형성 note 하시기 바랍니다. 우리가 이전에 보고 된 SAMs에 소 프로 파 놀16, 6MH와 함께 하지만 이러한 SAMs 전시 높은 더블 레이어 커패시턴스 값 및 더 많은 다른 유형의 표면 나타내는 임피던스 스펙트럼 (즉., 더 많은 결함) 낮은 저항. 또한, 6MH에서 SAMs는 물 해결책에서 준비는 때 (금 촉매 산소 감소) 때문에 적은 배경 산소 감소는 관찰 SAMs에 비해 에탄올/소 프로 파 놀 솔루션에서 형성. 이러한 모든 관측 물 솔루션에서 6MH에서 SAMs 적은 결함을 가진 더 높은 품질을 나타냅니다. 높은 품질 SAMs 또한 더 긴 알칸 사슬 (예를 들어, 1-hydroxy-decane-thiol), thiol 화합물에서 형성 될 수 있다 그러나 전자 전송 속도 느린 샘 두께 증가 된다.
이후 그들은 아마도 샘 품질 악화, 높은 잠재력에 금 표면에 chemosorb 수 있습니다 (spectro) 전기 화학, 중 염화 이온 버퍼 솔루션에 피해 한다. 같은 이유로 염화 무료 참조 전극 선호 해야 합니다.
또 다른 중요 한 점은 실험의 날짜 표시줄에 효소 양성자 전 좌 결과로 양성자 축적을 허용 하도록 충분히 낮은 되어야 양성자에 리의 배경 침투성. 정확한 지질 성분이이 침투성에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 작업에서 사용 하는 폴라 대장균 지질 추출 ubiquinone 10 보충. 비록이 더 복잡 한 지질 구성26연구에 상충는 양성자 투과율25-지방산 사슬 길이 강하게 의존 하 표시 되었습니다. 흥미롭게도, ubiquinone 최근 막 안정성27을 향상을 보여줘 왔다. 마지막으로, 단백질 재구성 절차에서 잔여 세제 양성자 누출 영향을 미칠 수 및 따라서 그것은 세제를 소수 성 폴리스 티 렌 microbeads, 원심 분리 뒤 희석을 사용 하 여 가능한 한 완전히 제거 하는 것이 중요 하 고 철저 한 rinsing 화학적 셀의 후는 proteoliposomes 표면에 흡착 됩니다. 의심 하는 경우 liposome 침투성 외부 pH 점프28에 대 한 응답 (HPTS)를 통해 루멘 pH 변화에 따라 확인할 수 있습니다.
단일 효소 측정 필요 unilamelar 리 및 작은 리 루멘의 볼륨 감소도 더 빨리 또는 더 높은 pH 변화를 보여줄 것으로 예상 된다. 이를 위해, 폴리스 티 렌 microbeads 점차적으로 소량 리 형성의 느린 속도에 지도에 추가 됩니다. 같은 조건에서 동종 크기의 작은 리 70의 평균 직경으로 형성 및 우리의 경우140.24의 증가할수록 인덱스. HPTS 또한 폴리스 티 렌 microbeads에 세제를 adsorb 폴리스 티 렌 microbeads의 용량을 줄이고 드리웁니다. 따라서, 초과 폴리스 티 렌 microbeads의 손실에 대 한 보상에 추가 되어야 합니다. 폴리스 티 렌 microbeads 치료 (3-4 m m 5 m m)에서 분기에 대 한 의해 지질 단백 정지에 HPTS 농도를 관찰 했다. 그러나, liposome의 루멘에서 실제 HPTS 농도 리 폴리스 티 렌 microbeads와 치료에 일찍 형성 이후 높은 수 있습니다. HPTS, 대신 다른 pH에 민감한 염료를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 중요 한 염료는 막 불 침투성 및 비율. 후자의 캡슐화 된 염료의 photobleaching와 다양 한 실험 오류를 방지합니다.
간단한 계산 여부, 확률론, 비어 리의 대부분을 포함 한 효소 분자 추정 할 수 있다. 70의 평균 liposome 직경 가정 nm, 750 다의 지질 분자 무게와 0.65 nm2 의 지질 지역 우리에 게 5.2x10-17 g, 즉, 준비 (5 mg의 지질) 당 9.6x1013 리 liposome 질량. 시 토 크롬 보3 의 0.1% (MW = 144 kDa), 2 x 1013 효소 분자는 존재, 0.2 단백질: liposome 비율. 포아송 분포를 사용 하 여, 한 수 더 계산을 한 효소 분자 (17%)을 찾을 수 있는 확률 liposome 당 10 배 이상의 분자 (1.7%)을 찾을 확률 보다 높은 것은 이다. 효소와 지질 재구성 해당 분석 실험에서 결정 중의 손실을 고려 하는 경우 더 정확한 계산을 만들 수 있습니다. 후자 수 수 추정 단백질 분석 결과에서 준비 된 리의 FDLL 형광을 측정 하 여.
일단 프로토콜 설정 되 고 단일 효소 추적 기록, 추가 메서드의 수정은 목표에 따라 가능 합니다. 하나는 효소 억제제 추가 또는 시스템에 있는 ionophore의 도입에 대해 생각할 수 있습니다. 확인의 추가 ionophore 준비 하는 데 사용 또는 억제제 재고는 리의 침투성 또는 샘의 상태를 좌우 하지 않는다 주의 한다.
여기에 설명 된 대로 기술 막 양성자 전송기와 quinone 변환 효소의 특정 그룹으로 제한 됩니다. 장비 및 실험 조건 여기서 시 토 크롬 보3의 효소 활동에 대 한 최적화 했다. 여기, 시간 분해능은 노출 시간과 터렛 필터를 변경 하는 데 걸리는 시간에 따라 2-3 초. 실험 기간 형광 염료의 photobleaching에 의해 및, 따라서, 빛의 강도 의해 제한 됩니다. 우리는 이전 시 토 크롬 보3 20 양성자/s 활동 검색 73 ± 2.2 양성자/s이이 기술을 사용 하 여 것의 평균 양성자 전 좌 속도 발견. 어느 정도 활동 효소에 대 한 이러한 기법을 사용, 이미지 수집 매개 변수 필요가 적응 (즉., 빛의 강도, 노출 시간 및 실험 기간). 미래에,이 방법은 확장할 수 있다 양성자 펌프 효소, 미토 콘 드 리아 복잡 한 되 고 예를 운전 하는 다른 전자 전송으로 나. 다른 효소는 다른 재구성 프로토콜, 필요할 수 있습니다 그리고이 각 다른 전송에 최적화 될 필요가 있을 것입니다. Quinone 변환 되지 않은 양성자 펌프 효소 수 있습니다 공부, 예를 들면, ATP 구동29, 양성자 전 좌를 화학적, 트리거될 수 없습니다이 경우에 (예를 들어, ATP) 초기자의 추가 필요 하지만. 후자의 경우 금 수정 커버 슬립을 사용 하는 필요가 있다. 또한, 적합 한 막 불 침투성 및 이온-민감한 형광 염료 사용이 방법은 다른 이온 펌프, 예를 들면, 나트륨과 칼륨을 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 BBSRC (BB/P005454/1) 재정 지원에 대 한 인정합니다. NH는 VILLUM 재단 젊은 수 사관 프로그램에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
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