Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3 como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.
Abstract
Bombeamento de prótons enzimas de elétron transferir reações de redox de duas cadeias de translocação de prótons através da membrana, criando uma força motriz protónica usada para a produção de ATP. A natureza anfifílica das proteínas de membrana requer especial atenção ao seu manuseamento e reconstituição no ambiente natural de lipídios é indispensável ao estudar os processos de transporte da membrana como translocação de prótons. Aqui, detalhamos um método que foi usado para a investigação do mecanismo de bombeamento de prótons de enzimas redox de membrana, tomando citocromo bo3 de Escherichia coli , por exemplo. Uma combinação de eletroquímica, microscopia de fluorescência é usada para controlar o estado de redox das quinona monitor e piscina pH mudanças no lúmen. Devido a resolução espacial de microscopia fluorescente, centenas de lipossomas podem ser medidas simultaneamente enquanto o conteúdo de enzima pode ser escalado para baixo para uma única enzima ou transportador por lipossomas. A análise dos respectivos única enzima pode revelar padrões na dinâmica funcional da enzima que pode ser oculto pelo comportamento de toda a população. Nós incluímos uma descrição de um script para análise automatizada de imagem.
Introduction
Informação sobre a cinética e mecanismos de enzima é normalmente obtida a nível ensemble ou macroescala com população de enzima em milhares de milhões de moléculas, onde as medições representam uma média estatística. Sabe-se, entretanto, que macromoléculas complexas tais como enzimas podem demonstrar a heterogeneidade em seu comportamento e mecanismos moleculares observados no nível de conjunto não são necessariamente válidos para cada molécula. Tais desvios na escala de molécula individual foram extensivamente confirmados por estudos de enzimas único com uma variedade de métodos emergentes durante as últimas duas décadas1. Notavelmente, deteção de fluorescência da atividade de cada enzima tem sido usada para investigar a heterogeneidade das enzimas atividade2,3 ou descobrir o efeito de memória so-called (períodos de atividade de enzimas alta sucedido por períodos de baixa atividade e vice-versa)4,5.
Muitos estudos única enzima exigem que as enzimas são imobilizadas na superfície ou espacialmente fixo em outra maneira de manter-se suficientemente longo no campo de visão para observação contínua. Encapsulamento de enzima em lipossomas foi mostrado para habilitar a imobilização da enzima, evitando qualquer impacto negativo devido a superfície-enzima ou proteína-proteína interações6,7. Além disso, os lipossomas oferecem uma possibilidade única de estudar proteínas de membrana única em sua natural lipídios BICAMADA ambiente8,9,10.
Uma classe de proteínas de membrana, transportadores, exerce uma translocação direcional de substâncias através da membrana celular, um comportamento que pode ser estudado somente quando as proteínas são reconstituídas para o lipid bilayers (por exemplo, os lipossomas)11, 12,13. Por exemplo, translocação de protões, exibida por várias enzimas das cadeias de transporte electrónico de procariontes e eucariontes, desempenha um papel importante na respiração celular através da criação de uma força motriz protónica usada para a síntese de ATP. Neste caso, o próton atividade de bombeamento é acoplado à transferência de elétrons, embora o mecanismo detalhado deste processo muitas vezes continua elusivo.
Recentemente, temos demonstrado a possibilidade de detecção fluorescente de casal com eletroquímica para estudar próton bombeamento a atividade das enzimas única da terminal ubiquinol oxidase de Escherichia coli (citocromo bo3) reconstituído em lipossomas14. Isto foi conseguido através do encapsulamento de um corante fluorescente-membrana impermeável de sensíveis ao pH no lúmen de lipossomas preparados a partir de E. coli lipídios polares (figura 1A). A quantidade de proteína foi otimizada, assim que a maioria dos lipossomas também continham nenhuma ou apenas uma molécula de enzima reconstituído (de acordo com a distribuição de Poisson). Os dois substratos do citocromo bo3 foram fornecidos pela adição de ubiquinona à mistura lipídica que formou os lipossomas e oxigênio (ambiente) em solução. Os lipossomas são, então, escassamente adsorvidos em um eletrodo de ouro ultra-suave semi transparente, coberto com uma monocamada auto montada de 6-mercaptohexanol. Finalmente, o eletrodo é montado na parte inferior de uma célula de spectroelectrochemical simples (figura 1B). Controle eletroquímica do estado redox quinona piscina permite flexìvel acionar ou parar a reação enzimática, a qualquer momento, enquanto a tintura sensíveis ao pH é usada para monitorar as alterações de pH dentro do lúmen dos lipossomas como resultado da translocação de protões pelo enzimas. Usando que a intensidade de fluorescência de uma segunda, lipid-limite tintura fluorescente, o tamanho e volume de lipossomas individuais pode ser determinada e, portanto, a quantificação do próton enzima atividade de bombeamento. Usando esta técnica, nomeadamente encontramos que moléculas de citocromo bo3 são capazes de entrar em um estado de fuga espontânea que dissipa-se rapidamente a força motriz protónica. O objetivo deste artigo é apresentar a técnica de medições em lipossomas único em detalhe.
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Protocol
1. preparação de uma mistura de lipídeos/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lipídios usados para a preparação dos lipossomas devem ser aliquotadas e cuidadosamente misturada com ubiquinona-10 (substrato) e long-comprimento de onda fluorescentes tingir-etiquetados lipídios (para determinação de tamanho de lipossomas) antes do reconstituição.
- Utilizando uma seringa de vidro, 200 µ l de transferência de estoque de clorofórmio de lipídios polares extrair de Escherichia coli (25 mg/mL) em frascos de vidro tornar-se alíquotas de 5 mg.
- Adicionar 50 µ l de 1 mg/mL ubiquinona-10 (UQ-10; em clorofórmio) para os lipídios tornar a relação final de UQ-10: 1: 100 de lipídios (1% w/w).
- Adicione 20 µ l de 1 mg/mL (0,4% w/w) de um comprimento de onda longo fluorescente tingir-etiquetados lipídico (FDLL) para a mistura de lipídeos/UQ-10.
- Homogeneizar a solução de clorofórmio por curto num Vortex e evaporar a maioria de clorofórmio sob um fluxo suave de nitrogênio ou argônio. Remova os traços de clorofórmio inteiramente por mais evaporação sob vácuo durante pelo menos 1 h.
Nota: Alíquotas de lipídios podem ser armazenadas sob atmosfera inerte a-20 ° C, durante vários meses.
2. reconstituição de citocromo bo3
Nota: Para a purificação do citocromo bo3 de e. coli, segui o protocolo de Rumbley et al. 15 para assegurar o elevado grau de pureza das amostras de enzima nativamente-dobrado, adicionar cromatografia de exclusão-tamanho após a etapa de purificação de afinidade descrita por Rumbley et al . 15
- Adicione 312,5 µ l de 40mm MOPS-KOH/60 mM K24, pH 7,4, a uma alíquota de lipídios/UQ-10/FDLL seco misture (5 mg, passo 1.4) e misturar com vortex até o filme lipídico é totalmente resuspended, seguido por 2 min de tratamento em um banho ultra-sônico.
- Adicione 125 µ l de ácido de 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic de 25 mM (HPTS), uma tintura fluorescente sensíveis ao pH que precisa ser encapsulado dentro de lipossomas.
- Adicione 137.5 µ l de surfactante de (OGP) 250 mM n-octil-β-D-glucopiranósido, misturar usando o vórtice e proceda à sonicação em um banho ultra-sônico para 10 min garantir que todos os lipídios são solubilizados em micelas de surfactante. Transferi a dispersão em um tubo de plástico de 1,5 mL.
Nota: Suspensão turva de lipídeos deve tornar-se transparente após a solubilização com surfactante. - Adicione a quantidade necessária de citocromo bo3 (veja a nota abaixo) e adicionar água ultrapura para fazer um volume total de 50 µ l (solução de bo3 citocromo mais água). Incube a 4 ° C por 10 min em um misturador de rolos.
Nota: Valor típico para condições única enzima é 0,1 – 0,2% (w/w de proteína-para-lipídico, i. e. 5 a 10 µ g de proteína), embora isso pode ser aumentado até 1-2% (50 a 100 µ g de proteína), se o objetivo é observar somente a atividade eletroquímica (veja abaixo). Como um controle negativo, podem ser preparados lipossomas sem citocromo bo3 . - Pesar 2 x 50 mg e 2 x 100 mg de poliestireno microbeads tampas quatro 1.5 mL-tubo e feche com a película de parafina para impedir a secagem.
Nota: Antes de utilizar, poliestireno microbeads devem ser lavados com água, metanol e armazenado em água de acordo com o manual do fabricante.
Nota: Se for usada uma mistura de água/Microconta, poliestireno microbeads pode convenientemente ser transferido para a tampa com uma micropipeta com uma ponta larga. Água pode então ser retirada o microbeads utilizando uma micropipeta com uma ponta fina. - Adicione o 1st50 mg de poliestireno microbeads a mistura de reconstituição (passo 2.4), colocando a tampa com poliestireno microbeads sobre o tubo de 1,5 mL-plástico com dispersão e realizando uma rotação curta para um par de segundos. Incube a 4 ° C, em um misturador de rolos para poliestireno microbeads adsorver o surfactante por 30 min.
- Repita as adições de poliestireno microbeads e incubação do como segue: Adicionar 50 mg de microbeads para 60 minutos de incubação; Adicione 100 mg de microbeads para 60 minutos de incubação; e adicione 100 mg de microbeads para 120 min de incubação.
Nota: A solução acima o assentamento microbeads girará translúcida durante a etapa de 2.6 como proteoliposomes são formados.
- Repita as adições de poliestireno microbeads e incubação do como segue: Adicionar 50 mg de microbeads para 60 minutos de incubação; Adicione 100 mg de microbeads para 60 minutos de incubação; e adicione 100 mg de microbeads para 120 min de incubação.
- Separe a solução de proteoliposome o poliestireno microbeads utilizando uma micropipeta com uma ponta fina. Diluir a dispersão em 90 mL de 20mm MOPS-KOH/30 mM K2então4, pH 7,4 (tampão MOPS) e transferência em um tubo de se Ti45.
- Se a dispersão usando tipo 45 Ti rotor a 125.000 x g (em rmáx) por 1h para o proteoliposomes de Pelotas.
Nota: Tubos de centrífuga de menor podem ser usados, embora a diluição em volume de buffer grande ajuda a reduzir a concentração da HPTS não-encapsulado na suspensão de final. - Desprezar o sobrenadante, enxágue as pelotas com 20mm MOPS-KOH/30 mM K2para4, pH 7,4 tampão (sem resuspending a pelota). Após descartar o buffer de enxaguamento, re-suspenda o proteoliposomes em 500 µ l de tampão MOPS pipetando-lo e para trás com micropipeta de ponta fina. Em seguida, transfira para um tubo de plástico de 1,5 mL.
- Centrifugar a suspensão por 5 min a 12.000 x g para remover os detritos. Transferi o sobrenadante (reconstituído proteoliposomes) para um tubo novo.
- Armazenar a dispersão proteoliposomes reconstituído a 4 ° C durante a noite e usar dentro de 2 dias.
3. fabricação de eletrodos de ouro semitransparentes
Nota: A superfície lisa do ouro é obtida por um método de descascamento de modelo de 30 nm de espessura camada de ouro de 99,99% de uma bolacha de silicone suave atomicamente. A pequena espessura da camada de ouro é importante, uma vez que deve ser semi transparente para permitir a observação da fluorescência. Detalhes de ouro da evaporação (deposição de vapor físico, PVD) pode ser encontrar em outro lugar16 e modelo único-descascamento é coberto aqui. Alternativamente, ultra-suave fichas de ouro podem ser compradas em outro lugar (ver a Tabela de materiais).
- Cola até 9 vidro lamínulas (0,17 mm de espessura) sobre a superfície de ouro evaporada usando bi-componente epóxi de baixa-fluorescência. Cure a cola a 80 ° C, durante 4 h.
- Antes de modificação com um monolayer Self montado (etapa 4), retire as lamínulas de vidro partir os wafers de silício com uma lâmina. Devido a magreza das lamínulas, tome cuidado ao retirar as lamínulas para não rachar ou quebrar as lâminas de vidro.
4. modificação da superfície de ouro com self-Assembled Monolayer (SAM)
- Prepare-se 5 mL da solução de água de 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
- Mergulhe 6MH solução recentemente desanexadas revestido de ouro lamínulas (passo 3.1) e deixar a 20-25 ° C durante a noite (> 16 h) para formar o SAM.
Nota: Soluções de tiol tem um cheiro desagradável, então de um recipiente fechado deve ser usado quando a incubar a lamela revestido de ouro. - No dia seguinte, retirar a lamínula revestido de ouro da solução 6MH, lavar rapidamente com água ou metanol e, em seguida, com isopropanol. Seco, sob um fluxo de gás suave.
5. eletroquímica testes de atividade Proteoliposomes
Nota: A atividade eletroquímica da enzima é verificada primeiro em uma camada de lipossomas estreitamente agrupadas (passo 5) e coberturas de vesículas menores são usadas em vesículas único experimento para medir as mudanças de pH no lúmen dos lipossomas (etapa 6).
- Montar a lamínula revestido de ouro em uma célula eletroquímica-spectro (ver Figura 1). Fazer contato com o ouro com um fio liso fora de uma área definida por uma-Ring de borracha.
- Adicionar 2 mL de solução-tampão de eletrólito e colocar a referência e eletrodos auxiliares na célula.
Nota: Como discutido na seção de discussão, eletrodos de referências sem cloreto de são preferidos para evitar a formação de Au (I) Cl durante eletroquímica. Aqui, um Hg/Hg2SO4 (sáb. K2SO4) eletrodo de referência é usado e potenciais são dadas contra eletrodo padrão de hidrogênio (que) com 0,658 V vs para o de Hg/Hg2SO4 (sáb. K2então4). - Execute a espectroscopia de impedância eletroquímica (0,1 Hz-100 kHz) em potencial de (OCP) potencial de célula aberta para avaliar a qualidade do SAM. Converter valores de impedância de entrada e dividir por 2πω para traçar um plano Cole-Cole, onde ω é a frequência (consulte as seguintes referências16,17,18 para obter detalhes sobre conversão e interpretação de impedância espectros).
Nota: SAMs compactos e densos de 6MH devem dar um fim a trama de Cole-Cole semicírculo e dar valores de capacitância na faixa de 2.5-3.0 µF/cm2 (Figura 2A). Se o desvio significativo da forma de semi círculo ou valores fora do intervalo de capacitância é obtido, mude o eletrodo. - Correr em branco voltammograms cíclica (CVs) com varredura taxas 100 e 10 mV/s na região potencial-0.3 – 0,8 V. Um CV típico é mostrado na (Figura 2B, linha tracejada).
Nota: Isto deve demonstrar comportamento capacitivo quase puro e uma ausência de corrente faradaic significativa, mesmo sob condições de oxigênio ambiente como usado aqui. - Adicionar proteoliposomes (concentração de lipídios final de 0,5 mg/mL, 1-2% (w/w) relação do citocromo bo3 lipídios) para a célula eletroquímica e misture levemente com uma pipeta. Espere até que a adsorção de proteoliposomes na superfície do eletrodo é terminado (30-60 min à temperatura ambiente).
Nota: Voltammograms cíclica (CVs) a 10 mV/s pode ser executado durante a adsorção de proteoliposomes para acompanhar o processo. A adsorção é concluída quando o CVs consecutivos para de mudar. Informações sobre técnicas de CV podem ser encontradas nos seguintes livros. 19 , 20 - Lavar a célula alterando a solução-tampão de pelo menos 10 vezes, mas Evite deixar a superfície do eletrodo completamente seco.
- Executar a espectroscopia de impedância eletroquímica da OCP (Figura 2A, linha azul) para confirmar que o SAM sobre o eletrodo de ouro permanece inalterado e CVs com varredura taxas 10 e 100 mV/s para observar a oxidação catalítica ubiquinol (e redução do oxigênio) pelo citocromo Bo 3 em potenciais de início de redução eletroquímica quinona sobre 0 V vs) (Figura 2B).
6. detecção de próton enzimática de bombeamento por microscopia de fluorescência
- Modifica o eletrodo de ouro como no passo 5, mas usando 100 x menos proteoliposomes em relação ao passo 5.5 (ou seja, 5 µ g/mL). Para estudos de enzima única, reduzir o citocromo bo3 a proporção de lipídios para 0,1-0,2% (w/w).
Nota: Lipossomas escassamente irão adsorver na superfície do eletrodo permitindo única vesícula monitoramento por microscopia de fluorescência. Sob essas condições de single-enzima, a quantidade de enzima imobilizada na superfície do eletrodo é insuficiente para a observação de uma corrente catalítica. - Coloque a célula eletroquímica sobre o objetivo do óleo (60 X) de um microscópio de fluorescência invertido com uma gota de óleo de imersão. Usando filtros adequados para fluorescência FDLL, concentre-se na superfície do eletrodo. Os lipossomas único devem aparecer como pontos brilhantes no limite de difração do microscópio/objectivo. Criar a imagem de fluorescência FDLL.
- Alternar para um dos conjuntos de filtros de fluorescência HPTS no microscópio para verificar se a fluorescência HPTS é claramente visível e distinguível do fundo (na época de exposição escolhido, consulte a etapa 6.4). Se não for o caso, aumente a intensidade da luz.
- Programar o software microscópio para realizar uma aquisição de imagem cronometrado pela alternância de dois conjuntos de filtros HPTS (menu de aplicações | Define/Run ND aquisição). Defina o atraso entre aquisições de imagem no mínimo. Neste experimento, use uma 1 exposição s e atraso de s 0.3 (devido ao movimento de torre).
Nota: A relação entre as intensidades de fluorescência nestes dois canais será convertida mais tarde ao pH dentro os lipossomas em cada ponto de tempo. A duração da aquisição pode variar de acordo com a taxa de mudança de pH esperado; 5 min é usado neste artigo. - Ajuste as configurações do potentiostat para alterar o potencial durante a aquisição de imagem. Por exemplo, neste experimento, use a seguinte sequência: 0 – 60 s: sem potencial aplicado (ou seja, OCP); 60-s: 180-0.2 V (vs); 180-300 s: 0.4 V (vs). Neste caso, apenas o potencial aplicado na segunda fase (-0.2 V vs) é suficiente para eficientemente reduzir o pool de quinona.
- Execute simultaneamente a aquisição de imagens temporizada (microscópio) e a sequência de potencial (potentiostat) iniciando manualmente as duas medições ao mesmo tempo.
Nota: O experimento pode ser repetido no mesmo eletrodo vários tempo movendo-se a fase de microscópio para uma área diferente na superfície. O atraso entre as aquisições deve ser pelo menos 5-10 min para garantir o equilíbrio de pH completa de lipossomas na superfície. Diferentes durações e potenciais padrões podem ser aplicados dependendo da necessidade, embora o tempo de imagem é limitada devido à fotobranqueamento de HPTS durante a aquisição.
7. análise de imagens de fluorescência
Nota: Um experimento típico produz um conjunto de imagens com um passo de tempo (por exemplo, 2.6 s) para cada um dos dois canais, ou seja, (duração * 2 / 2.6) imagens. Um exemplo de tal imagem definida gravado durante uma experiência única enzima pode ser acessado através do repositório de pesquisa dados Leeds21. Um tratamento de imagem consiste em vários passos usando Fiji (ImageJ) e análise matemática de alto nível, programação de software de linguagem (doravante referido como o software de criação de scripts, consulte Tabela de materiais para obter detalhes).
- Use Fiji para separar arquivo de lapso de tempo, alinhar imagens e salve como canais separados e prazos.
- Arquivo de lapso de tempo aberto usando o importador Bioformats fornecido dentro Fiji (comando macro: executar ("Bio-formatos importador")).
- Usar o plugin StackReg para alinhar cada quadro ao primeiro para contabilizar os movimentos possíveis do palco ou deriva térmica ocorreu durante a aquisição (comando macro: executar ("StackReg", "transformação = tradução")).
- Salve arquivos de imagem descompactada separados para cada canal e cada passo de tempo no formato TIFF em uma única pasta.
- Extrair os carimbos de hora exata para cada quadro dos metadados de arquivos de lapso de tempo e salvá-los como um arquivo CSV na mesma pasta das imagens. Alternativamente, usando o software de aquisição de carimbos de hora de extrair e salvar manualmente para um arquivo CSV usando um software de planilha.
Nota: A pasta com imagens e carimbos de hora agora está pronta para ser analisados pelo software do script. 7.1.1 de passos. -7.1.4. podem ser automatizados usando um script de Fiji (um script escrito em Python para processamento em lote de arquivos de lapso de tempo é fornecido, usar "Ctrl-Shift-N" (no Windows) e, em seguida, arquivo | Abrir para carregar o script).
- Use script software para processamento automatizado das imagens. Carregar o código fornecido para o software e clique em Executar para final. Quando solicitado, selecione a pasta que contém as imagens do passo 7.1.
Nota: Um script para análise é fornecido como script de mlx-formato ao vivo, com comentários extensos, identificar único lipossomas, encaixá-los para função 2D-Gaussian, filtrá-los e quantificar os valores de pH em cada ponto do tempo. As seguintes subetapas são executadas automaticamente pelo script.- Carrega todas as imagens de prazos para uma única experiência na memória.
- Média de todas as imagens para um único canal (selecione o canal com a mais alta intensidade de fluorescência) e usar a imagem em média para identificar todos os máximos que podem corresponder do único lipossomas.
- Ajuste os máximos identificados na imagem em média para o 2D-Gaussian funcionam e salvar o resultado ajustar parâmetros para cada lipossoma (ver Figura 4A por exemplo lipossoma equipada).
- Filtre os máximos segundo os critérios de lipossomas único esperados, como tamanho, circularidade e intensidade. Rejeitar os lipossomas que estão mal equipados devido ao baixo sinal-ruído, estreitamente vizinhas em lipossomas ou ser demasiado perto da borda da imagem.
- Carregar carimbos de hora de arquivo externo e encaixar cada lipossoma filtrada à função em cada imagem de tempo de 2D-gaussian separadamente.
Nota: O uso de programação paralela e com vários núcleos da CPU pode aumentar consideravelmente a velocidade de cálculo nesta fase. - Filtre os lipossomas novamente de acordo com os critérios semelhantes como na etapa 7.2.4 mas aplicada a cada período de tempo.
- Em cada passo de tempo, defina a relação de intensidade de fluorescência de um lipossoma como a razão de volumes delimitada pela função de 2D-Gaussian cabida em dois canais. Calcule os valores de pH a partir da razão de intensidades, determinado a partir dos dois canais HPTS e usando uma curva de calibração (passo 8). Traçar curvas de pH-tempo resultantes para os lipossomas e observar o seu pH mudar quando o potencial é aplicado.
8. realização de uma curva de calibração da fluorescência HPTS
Nota: Para converter a proporção de fluorescência HPTS para um pH intravesicular, uma curva de calibração deve primeiro estabelecer que levaria em conta condições particulares de experiências como transmitância ouro, filtros de qualidade, etc. Esta etapa tem que ser executado apenas uma vez ou duas vezes e os dados de calibração podem ser usados, desde as instalação e medição de parâmetros permanecem os mesmos na etapa 6.
- Prepare um eletrodo com lipossomas escassamente adsorvidos (sem citocromo bo3 conforme descrito nas etapas 5 e 6.1).
- Adicione 2 µ l da solução de gramicidin de 0,1 mg/mL em etanol a 2 mL de tampão para criar a concentração de 100 ng/mL.
- Capture duas imagens de fluorescência para os dois canais HPTS.
- Alterar o pH da célula pela adição de pequenas alíquotas de 1m HCl ou 1 M H2então4. Medir o pH do buffer com um medidor de pH padrão e capturar duas imagens de fluorescência para os dois canais HPTS.
- Repita as etapas de 8.4 para a faixa de pH 6-9.
- Usando o algoritmo de 7.2, caber, filtrar e calcular a taxa média de fluorescência HPTS de lipossomas individuais em cada pH. Assuma a relação HPTS média todos os lipossomas.
- Ajuste da dependência do pH-relação resultante para a seguinte equação:
, onde pKum, Ra e Rbestão cabendo parâmetros. - Use pKum, Ra e Rbpara converter a proporção HPTS de lipossomas individuais na etapa 7.2.7. para valores de pH.
, onde pKum, Ra e Rbestão cabendo parâmetros.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A qualidade do ouro-modificado lamínula (eletrodo) com uma SAM de 6MH é verificada antes de cada experimento com espectroscopia de impedância eletroquímica. Figura 2A mostra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando espectroscopia de impedância eletroquímica, antes e depois de lipossomas são adsorvidos. Se a qualidade do SAM é suficiente, espectroscopia de impedância deve demonstrar um comportamento capacitivo quase puro, resultando em uma trama do semicírculo Cole-Cole. O diâmetro do semi-círculo em uma trama de Cole-Cole é igual a capacitância da dupla camada da superfície do eletrodo, que deve estar no intervalo 2.5-3.0 µF/cm2 . Note-se que a capacitância não deve alterar significativamente a adsorção de lipossomas, apesar de um ligeiro aumento da capacidade pode ser observada (fundo de cobertura, Figura 2A, lipossomas alta) ou uma ligeira mudança de impedância pode ser observada em baixa frequências (top de coberturas, Figura 2A, lipossoma baixa).
Eletroquímica pode ser usada para testar a atividade catalítica do citocromo bo3 no proteoliposomes, onde correntes catalíticas medidas com voltametria cíclica refletem a atividade de oxidorredutase ubiquinol-oxigênio. No entanto, significativas correntes catalíticas só podem ser detectadas em quantidades elevadas de proteoliposomes adsorvida e uma camada estreitamente agrupada de proteoliposomes sobre a lamínula de ouro-modificado é necessário. Figura 2B demonstra representante voltammograms cíclica (CVs) do eletrodo antes e após a adsorção de lipossomas com qualquer cobertura de lipossomas de baixa ou alta. Nenhuma corrente faradaic é observada no CV em branco porque redução de oxigênio até o eletrodo de ouro desencapada é bloqueada pelo SAM. Quando a superfície está saturada com lipossomas com alta citocromo bo3 conteúdo (1,3% (w/w), neste caso), uma onda clara catalítica devido à redução do oxigênio é observada com um potencial de aparecimento de 0 V, ou seja, o potencial de ubiquinona redução (Figura 2B, linha azul). A ubiquinona atua como substrato para a enzima natural e como um mediador de elétron, transferência de elétrons de enzima para a superfície do eletrodo. Notamos que sob cobertura alta em lipossomas, sem distinção de vesículas individuais é possível por microscopia e cobertura inferior é necessária para estudos de lipossoma único. A cobertura de baixo em lipossomas (mas proteína elevada proporção de lipídios), a corrente catalítica é significativamente reduzida, mal distinguíveis de fundo (Figura 2B, linha vermelha). Observe que, sob condições única enzima (proteína baixa a proporção de lipídios), a corrente catalítica é ainda menor e não pode ser mensurada fiavelmente.
A Figura 3 mostra imagens de fluorescência de lipossomas adsorvidos em eletrodos em três diferentes coberturas. Todas as imagens foram tiradas em idênticas condições de luz e exposição e seu brilho foi ajustado igualmente para permitir a comparação direta. Os corante contendo lipossomas são visíveis nas imagens como pontos brilhantes. A parte central da imagem foi a foto por alguns minutos para revelar o nível de fluorescência de fundo (notamos que FDLL é relativamente fotoestável e não é foto completamente na Figura 3). As imagens em dois canais HPTS são superponíveis, onde a relação entre os dois canais (410/535 e 470/535) corresponde ao pH 7,4 usado neste experimento. Um número maior de lipossomas é visível com o canal FDLL, que indica a presença de lipossomas que têm não HPTS encapsulado. A diferença entre os canais HPTS e FDLL é mais pronunciada em coberturas superiores, possivelmente porque na cobertura de alta em lipossomas, os lipossomas são mais propensos a estourar ou se fundem na superfície.
A análise de imagem requer o alinhamento de quadros (contra o primeiro quadro) usando o ImageJ, plugin StackReg. O alinhamento é indispensável na maioria das situações, desde uma ligeira deriva térmica da amostra geralmente ocorre dentro da escala de tempo do experimento, mudar as coordenadas de lipossomas. Toda uma análise mais aprofundada é executada usando um código de script do software. Esse código executa identificação automática em lipossomas. Como o tamanho dos lipossomas são abaixo do limite de difração de Abbe, sua fluorescência é vista como um ponto de espalhar função muito maior do que o diâmetro real em lipossomas (Figura 4A). O código se ajusta a intensidade de fluorescência de cada vesícula em dois canais para uma função gaussiana-2D (Figura 4A) e calcula a sua proporção de intensidade volumétrica que pode ser convertida em pH utilizando uma curva de calibração. Por meio dessas ações em todos os prazos, o pH é obtido dentro de todas as vesículas dentro escala de tempo do experimento (filme 1). Figura 4B mostra as medianas de todas as alterações de pH de vesículas dentro de uma única imagem quando citocromo bo3 conteúdo é 1,3%. Aumento do pH (bombeamento de prótons) é claramente visível quando um potencial entre-0.1 e-0.3 V é aplicado, mas não para 0 V desde o último não é suficiente para reduzir o pool de quinona. Quando o citocromo bo3 conteúdo é muito mais baixo (relação proteína-para-lipídios 0,1%, Figura 4), as curvas medianos tornam-se quase indistinguíveis dos lipossomas vazios (Figura 4). A diferença torna-se evidente quando se consideram os traços individuais pH de lipossomas aleatórios (Figura 5, 6 e 7). Enquanto lipossomas sem citocromo bo3 não exibir nenhuma alteração significativa do pH em relação ao ruído (Figura 7), uma seleção de lipossomas mostram um aumento (predominantemente) ou uma diminuição do pH quando um potencial é aplicado a ativos citocromo bo3 (figuras 6, zona cinzenta). A diferença óbvia entre os lipossomas em pH-rastreamentos é consistente com o rácio de lipídios proteína-para baixo, onde citocromo bo3 está presente apenas em um pequeno subconjunto de atividade de lipossomas. A prevalência de um aumento de pH diminuição é explicada pelo método de reconstituição que favorece uma orientação "para fora" de moléculas de enzima (ca. 75%). A fração de lipossomas que exibem uma alteração de pH aumenta quando o citocromo bo3 a proporção de lipídios é maior (Figura 5). Observe também que alguns lipossomas parem de bombear protões e entram em modo de dissipação próton antes do final da aplicação potencial. Atribuímos este comportamento para as moléculas de citocromo bo3 entrando em um estado"vazamento", que permite que os prótons fluir de volta ao lipossoma lúmen14.
A uma análise mais aprofundada dos traços pH incluindo a sua montagem e determinação de próton taxas de bombeamento/vazamento pode ser feita usando um script que publiquei anteriormente14,22 e pode ser obtidos no repositório de Leeds de dados de pesquisa 23 , 24.
Figura 1: princípio do método. (A) princípio de monitoramento da atividade da enzima única e (B) o regime da instalação experimental utilizado neste trabalho com um fraque para demonstrar uma parte interna da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resposta eletroquímica de lipossomas. (A) Cole-Cole parcelas medido da OCP (0,22 V vs; linha quadrada preta) antes e depois de lipossomas (citocromo de 1,3% w/w bo3) adsorção de soluções nas concentrações de 5 µ g/mL (linha de círculo vermelho) e 500 µ g/mL (linha do círculo azul). (B) cíclico voltammograms a 100 mV/s (painel esquerdo) e 10 mV/s (painel direito) de Au-SAM (tracejado preto) antes e depois de lipossomas (citocromo de 1,3% w/w bo3) adsorção de soluções em concentrações de 5 µ g/mL (linha vermelha) e 500 µ g/mL (linha azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: microscopia de fluorescência de lipossomas. Imagens de fluorescência de lipossomas em diferentes coberturas de superfície: superfícies incubado por 30 min com uma solução de lipossomas de 5 µ g/mL (linha superior), 20 µ g/mL (linha média) e 500 µ g/mL (linha inferior). Coluna da esquerda corresponde à configuração de filtro de excitação/emissão do 470/535 nm (1 canal dest HPTS); coluna do meio - 410/535 nm (2 canais dend HPTS); coluna da direita - 645/560 nm (canal FDLL). As imagens foram tiradas na ampliação 90 X (60 X objetivo e ampliação de X 1,5 por microscópio antes da câmera), 1 s exposição e intensidade de luz semelhante. Barras de escala correspondem a 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: identificação de lipossomas e pH mudar. (A) vista 3D de uma parte da imagem de fluorescência contendo um lipossoma único típico. Sua intensidade de fluorescência é vista como um ponto de espalhar função (superfície de cor) que seja equipada para uma função gaussiana-2D (malha preta). PH (B-D), exibido como a mediana de todas as vesículas dentro da área de imagem única (tipicamente centenas) em diferentes potenciais aplicadas. De 0-60 s, sem potencial é aplicado (OCP). Entre 60 e 180 s (zona cinzenta) foram aplicadas diferentes potenciais: 0 V (preto),-0.1 V (vermelho),-0.2 V (verde),-0.3 V (azul). Entre 180 e 300 s, 0,4 V vs. Ela foi aplicada. O citocromo bo3 para rácios de lipídios foram (B) 1,3%, (C) (D) de 0,1%, 0%. Os traços são compensados pela clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: traços de pH de lipossomas contendo 1,3% da enzima. Vestígios de pH mudam de 72 lipossomas único, selecionados aleatoriamente, contendo citocromo bo3 (1,3% w/w) medidos e analisados durante um experimento. De 0-60 s, sem potencial é aplicado (OCP); entre 60 e 180 s (zona cinzenta)-0.2 V vs. ELA; entre 180 e 300 s, 0,4 V vs. Ela foi aplicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: traços de pH de lipossomas contendo 0,1% de enzima. Vestígios de pH mudam de 72 lipossomas único, selecionados aleatoriamente, contendo citocromo bo3 (0,1% w/w) medidos e analisados durante um experimento. De 0-60 s, sem potencial é aplicado (OCP); entre 60 e 180 s (zona cinzenta)-0.2 V vs. ELA; entre 180 e 300 s, 0,4 V vs. Ela foi aplicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: traços de pH de lipossomas sem enzima. Vestígios de mudança de pH de 72 lipossomas único, selecionados aleatoriamente, sem citocromo bo3 medidos e analisados durante um experimento. De s: 0-60 sem potencial é aplicado (OCP); entre 60 e 180 s (zona cinzenta)-0.2 V vs. ELA; entre 180 e 300 s, 0,4 V vs. Ela foi aplicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: animação da mudança de pH único lipossoma. (painel superior) Mudança de uma fluorescência em lipossomas em dois canais HPTS (mostrado como enredo de 3D da superfície da área correspondente) durante 300 s do experimento. Aplicou-se o potencial redutora entre 60 s e 180 s. trama de correspondentes (painel inferior) da relação de intensidade volumétrica de dois canais HPTS versus tempo. A zona de aplicação potencial redutora é sombreada em cinza. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
O método descrito é adequado para estudar o próton bombeamento por proteínas de membrana respiratória que podem ser reconstituídas em lipossomas e são capaz de trocar elétrons com o pool de quinona. Atividade de bombeamento de prótons podem ser monitorado no nível do single-enzima usando corantes sensíveis ao pH (ratiometric) encapsulados no lúmen do lipossoma (figura 1A).
O método baseia-se na capacidade de ubiquinona (ou outras quinonas), incorporada a bicamada lipídica, a troca de elétrons com eletrodos modificados com um SAM18. As propriedades do eletrodo ouro, modificado com uma SAM, são muito específicas. Lipossomas precisam absorver para o SAM e o SAM precisa ser fina o suficiente para permitir oxidação eletroquímica rápida e redução da piscina quinona nos lipossomas. Importante, a interação entre o eléctrodo e lipossoma precisa ser fraco o suficiente para não prejudicar a integridade da membrana lipídica. Além disso, dependendo os detalhes do sistema experimental, é desejável se o SAM impede reações catalisadas por ouro lado, tais como redução do oxigênio. Finalmente, o SAM precisa ser estável dentro da janela do potencial utilizada. O uso de eletrodos de ouro ultrafino modificado com SAM de alta qualidade de 6MH cumpre estes requisitos no caso de citocromo bo3. Descascamento de eletrodos de ouro de wafers de silício atomicamente bemol cria uma superfície ultra Lisa ouro com uma próxima SAM ideal conforme indicado pelos espectros de impedância. Por favor, note que formamos o SAM de 6MH na água. Informamos anteriormente sobre SAMs com 6MH em isopropanol16, mas estes SAMs apresentam maiores valores de capacitância da dobro-camada e espectros de impedância que indicam uma superfície mais heterogênea (i. e., mais defeitos) com uma menor resistência. Além disso, quando SAMs de 6MH são preparadas a partir de uma solução de água, menos redução de oxigênio de fundo (devido à redução de oxigênio catalisada ouro) é observada em relação ao SAMs formado a partir de uma solução de etanol/isopropanol. Todas estas observações indicam que o SAMs de 6MH em soluções de água têm uma qualidade superior com menos defeitos. SAMs superior também podem ser formadas a partir tiol-compostos com cadeias mais longas de alcano (por exemplo, 1-hidroxi-decano-tiol), mas a cinética de transferência de elétrons tornam-se mais lenta à medida que aumenta a espessura do SAM.
Durante eletroquímica (spectro), íons de cloro devem ser evitados em solução-tampão de desde que eles podem chemosorb na superfície do ouro em altos potenciais, possivelmente se deteriorando a qualidade de SAM. Pela mesma razão, um eletrodo de referência de cloreto livre deve ser preferido.
Outro ponto importante é a permeabilidade de fundo dos lipossomas de prótons, que devem ser baixos o suficiente para permitir a acumulação de protões como resultado da translocação de protões enzimática na escala de tempo de experiência. A composição exata de lipídios pode influenciar esta permeabilidade. Em nosso trabalho, usamos polar Escherichia coli extratos lipídicos suplementados com ubiquinona-10. Permeabilidade de próton tem demonstrada dependem fortemente do comprimento de cadeia de ácidos graxos25, embora isto tem sido contradito em estudos com mais complexo lipídico composições26. Curiosamente, ubiquinona recentemente foi mostrada para melhorar a estabilidade de membrana27. Finalmente, detergentes residuais do processo de reconstituição de proteína podem influenciar a fuga de próton e, portanto, é importante remover detergentes tão completamente quanto possível usando microbeads poliestireno hidrofóbicos, diluição seguida por centrifugação e enxaguadela completa da célula eletroquímica depois que os proteoliposomes são adsorvidas na superfície. Se duvidoso, permeabilidade em lipossomas pode ser verificada seguindo a mudança de pH do lúmen (via HPTS) em resposta a um pH externo salto28.
Medição única enzima exigem lipossoma unilamelar e lipossomas menores são esperados para mostrar mudanças de pH mais rápido ou mais elevado quando diminui de volume do lúmen. Para conseguir isso, poliestireno microbeads são adicionados gradualmente em pequenas quantidades, levando a diminuição da frequência de formação de lipossomas. Em tais condições, formam-se pequenas lipossomas de tamanho homogêneo com um diâmetro médio de 70 nm e um índice de polidispersividade de 0,24 em nosso caso,14. HPTS também absorve sobre o poliestireno microbeads, redução da capacidade de poliestireno microbeads para adsorver detergente. Portanto, o excesso de poliestireno microbeads deve ser adicionado para compensar sua perda. Tratamento com poliestireno microbeads observou-se para reduzir a concentração de HPTS na suspensão de lipid-protein por cerca de um quarto (de 5 mM a 3-4 mM). No entanto, a concentração real de HPTS no lúmen do lipossoma poderia ser maior, desde que os lipossomas são formados mais cedo sobre o tratamento com poliestireno microbeads. Em vez de HPTS, podem ser usados outros corantes sensíveis ao pH. No entanto, é importante que o corante é membrana impermeável e ratiometric. Este último evita erros experimentais devido fotobranqueamento e quantidades variáveis de corante encapsulado.
Cálculos simples podem ser feitos para estimar se, estocàstica, a maioria dos lipossomas vazio contêm apenas uma molécula de enzima. Supondo que um diâmetro médio de lipossomas de 70 nm, um peso molecular de lipídios de 750 Da e uma área de lipídios de 0.65 nm2 nos dão uma massa de lipossomas de 5.2x10-17 g, ou seja, 9.6x1013 lipossomas por preparação (5 mg de lipídios). Em 0,1% do citocromo bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 10 moléculas de enzima13 estão presentes, correspondente a uma proporção de proteína: lipossoma 0.2. Usando uma distribuição de Poisson, um mais pode calcular que a probabilidade de encontrar uma molécula de enzima (17%) por lipossoma é dez vezes maior do que a probabilidade de encontrar mais de uma molécula (1,7%). Cálculos mais precisos podem ser feitos se as perdas de enzima e lipídios durante a reconstituição, determinado a partir de ensaios correspondentes são tidos em conta. Este último pode ser estimado a partir de um ensaio da proteína e medindo fluorescência FDLL de lipossomas preparados.
Uma vez que o protocolo é estabelecido e registam-se vestígios de enzima única, mais modificações do método é viável dependendo do objetivo. Um poderia pensar em uma adição de inibidor de enzima ou introdução de um ionóforo no sistema. Tenha cuidado para verificar se a adição de solventes utilizados para preparar ionóforo ou estoque de inibidor não influenciam o estado de SAM ou permeabilidade dos lipossomas.
A técnica conforme descrito aqui é limitada a um determinado grupo de enzimas que são os transportadores de prótons da membrana e quinona-conversão. O equipamento e condições experimentais como usado aqui foram otimizadas para a atividade enzimática do citocromo bo3. Aqui, o tempo de resolução é de 2-3 segundos, determinados pelo tempo de exposição e o tempo que leva para a torre alterar filtros. A duração do experimento é limitada por fotobranqueamento de tintura fluorescente e, assim, pela intensidade da luz. Anteriormente encontramos taxa de translocação de prótons média de citocromo bo3 ser 73 ± 2.2 prótons/s usando esta técnica, embora as actividades até 20 prótons/s foram detectadas. Para usar essas técnicas para enzimas com qualquer atividade mais ou menos, parâmetros de aquisição de imagem precisam ser adaptado (i. e., luz, tempo de exposição, a intensidade e a duração do experimento). No futuro, este método pode ser estendido para outro transporte de elétrons, próton bombeamento enzimas, um exemplo sendo complexo mitocondrial de condução eu. Outras enzimas podem exigir protocolos diferentes de reconstituição, e isso precisa ser otimizado para cada transporte diferente. Bombas de prótons que não são quinona-convertendo enzimas também podem ser estudado, por exemplo, orientada por ATP29, embora neste caso a translocação de prótons não pode ser acionada eletroquimicamente, mas a adição de um iniciador (por exemplo, ATP) é necessária. Neste último caso, não há nenhuma necessidade de usar uma lamínula de ouro-modificado. Além disso, desde que uma tintura fluorescente o íon-sensível e membrana impermeável apropriada é usada, esse método pode ser estendido para outras bombas iónicas, por exemplo, sódio e potássio.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o BBSRC (BB/P005454/1), apoio financeiro. NH foi financiado pelo programa VILLUM Foundation Young Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
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