Qui, presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo molecolare della traslocazione di protoni attraverso le membrane del lipido di liposomi singoli, utilizzando citocromo bo3 come esempio. Combinando elettrochimica e microscopia a fluorescenza, le variazioni del pH in lumen del singole vescicole, contenenti singole o multiple enzima, possono essere rilevati e analizzati singolarmente.
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Articolo metodologico
Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Protone-pompaggio enzimi dell'elettrone trasferimento reazioni di ossidoriduzione Coppia catene alla traslocazione di protoni attraverso la membrana, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la produzione di ATP. La natura anfifilica delle proteine di membrana richiede particolare attenzione al loro trattamento, e la ricostituzione nell'ambiente naturale del lipido è indispensabile quando si studia i processi di trasporto di membrana come protone traslocazione. Qui, abbiamo dettaglio un metodo che è stato utilizzato per l'indagine sul meccanismo di pompaggio di protoni di enzimi redox della membrana, prendendo citocromo bo3 da Escherichia coli come un esempio. Una combinazione di microscopia di fluorescenza ed elettrochimica viene utilizzata per controllare lo stato redox dei cambiamenti di pH piscina e monitor del chinone in lumen. A causa della risoluzione spaziale di microscopia fluorescente, centinaia di liposomi possa essere misurati simultaneamente mentre il contenuto degli enzimi può essere scalato verso il basso per un singolo enzima o trasportatore a liposoma. L'analisi di rispettivo singolo enzima può rivelare modelli nella dinamica funzionale degli enzimi che potrebbe altrimenti essere nascosti dal comportamento dell'intera popolazione. Includiamo una descrizione di uno script per l'analisi di immagine automatizzato.
Introduzione
Informazioni sui meccanismi degli enzimi e cinetica sono ottenuti solitamente al livello ensemble o macroscala con popolazione di enzima in migliaia a milioni di molecole, dove misure rappresentano una media statistica. È noto, tuttavia, che le macromolecole complesse quali enzimi possono dimostrare eterogeneità nel loro comportamento e osservati a livello di insieme di meccanismi molecolari non sono necessariamente validi per ogni molecola. Tali deviazioni sulla scala singola molecola sono stati ampiamente confermati da studi di singoli enzimi con una varietà di metodi emergenti durante l'ultimo ventennio1. In particolare, rilevazione della fl....
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Protocollo
1. preparazione di una miscela di lipidi/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lipidi utilizzati per la preparazione dei liposomi dovrebbero essere aliquotati e accuratamente miscelati con ubiquinone-10 (enzima-substrato) e di lunghezza d'onda fluorescenti ha tingere-contrassegnati i lipidi (per determinare la dimensione liposomi) prima dei ricostituzione.
- Usando una siringa di vetro, trasferimento 200 µ l di brodo di cloroformio di lipidi polari estrarre da Escherichia coli (25 mg/mL) in fiale di vetro per rendere aliquote di 5 mg.
- Aggiungere 50 µ l di 1 mg/mL ubiquinone-10 (UQ-10; in cloroformio) per i li....
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Risultati
La qualità del coprioggetto oro-modificato (l'elettrodo) con una SAM di 6MH è controllata prima di ogni esperimento con la spettroscopia di impedenza elettrochimica. La Figura 2A Mostra rappresentative trame di Cole-Cole misurati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica prima e dopo i liposomi sono adsorbiti. Se la qualità di SAM è sufficiente, spettroscopia di impedenza dovrebbe dimostrare un comportamento capacitivo quasi puro risultante in una tr.......
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Discussione
Il metodo descritto è adatto per studiare protone pompaggio di proteine di membrana respiratoria che possono essere ricostituite in liposomi e sono in grado di scambiare elettroni con lo stagno del chinone. Protone attività di pompaggio può essere monitorato a livello di singolo-enzima utilizzando coloranti sensibili al pH (raziometrici) incapsulati nel lume liposoma (Figura 1A).
Il metodo si basa sulla capacità di ubiquinone (o altri chinoni), incorporato nel bil.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono la BBSRC (BB/P005454/1) per il sostegno finanziario. NH è stato finanziato dal programma VILLUM Foundation Young Investigator.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6-Mercapto-1-esanolo (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-idrossipirene-1,3,6-acido trisolfonico (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Supporto in alluminio (cella elettrochimica) | Su | 30x30x7 mm; diametro interno: 26 mm; diametro foro: 15 mm | |
| Elettrodo | filo di platino | ||
| Cloroformio | VWR Sostanze chimiche | 83627 | |
| E.coli lipidi polari | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in cloroformio |
| Epossidico | EPO-TEK | 301-2FL | epossidico a bassa fluorescenza |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Plugin richiesti: StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Es: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Cubo filtrante ("HPTS1")Chroma | Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Cubo filtrante ("HPTS2")Chroma | Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Cubo filtro ("Texas Red")Chroma | Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Lipidi marcati con colorante fluorescente (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC è stato utilizzato in questo lavoro (λ exc 595 nm; λ em 615 nm) |
| Lipidi marcati con colorante fluorescente (FDLL) (alternativa) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE può essere utilizzato come alternativa (λ ecc. 630 nm; λ em 651 nm) |
| Colonna di filtrazione su gel | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, per la purificazione aggiuntiva |
| delle proteine Vetrini coprioggetti | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Siringa in vetro | Hamilton | 1725 RNR | 250 &; L |
| Fiale di vetro | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | Capacità 1,75 mL |
| Oro | GoodFellow | 99,99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Elettrodo di riferimento al solfato di mercurio | Radiometro (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuga | Microscopio Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Nikon | Eclipse Ti | ||
| Microscopio Fotocamera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscopio Lampada | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscopio software | |
| di acquisizione n-Octyl β-D-glucopiranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Software di controllo potenziostato | |
| Obiettivo | Nikon | Plan Apo λ olio | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Software di tracciatura | |
| O-ring (cella elettrochimica) | Orinoko | Diametro interno: 16 mm; sezione trasversale: 1,5 mm | |
| Tubi di plastica | Eppendorf | 3810X | 1,5 mL |
| Microsfere di polistirene | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potenziostato | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potenziostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Software di scripting | Matlab | R2017a | Toolbox richiesti: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'Wafer |
| di silicio | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N< 100>P) | Ø 25 mm, 525 um di spessore |
| Cella in teflon (cella elettrochimica) | Su misura | Diametro esterno: 26 mm; diametro interno: 13,5 mm | |
| Superfici in oro ultrapiatto spellato sulle aste Tecnologie | per ornitorinco | AU.1000.SWTSG | Superfici alternative in oro ultrapiatto pronte all'uso (spessore inferiore a 100 nm su richiesta) |
| Puntali per micropipette sottili | Sarstedt | 70.1190.100 | o simili punte per gelloader 200 µ L |
| Ubichinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuga | Beckman-Coulter | L-80XP | con rotore Ti 45 |
| Bagno ad ultrasuoni | Fisher | Scientific FB15063 |
Riferimenti
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activ....
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Ristampe e permessi
