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Biochemistry

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/58896
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

Summary

यहां, हम एक उदाहरण के रूप में साइटोक्रोम बो3 का उपयोग कर, एकल liposomes की लिपिड झिल्ली भर में प्रोटॉन स्थानांतरण के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एकल या एकाधिक एंजाइम युक्त एकल vesicles के लुमेन में विद्युत रसायन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, पीएच परिवर्तन का संयोजन, का पता लगाया जा सकता है और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया ।

Abstract

इलेक्ट्रॉन अंतरण श्रृंखलाओं के प्रोटॉन-पम्पिंग एंजाइम झिल्ली के पार प्रोटॉन स्थानांतरण के लिए रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं, एटीपी उत्पादन के लिए इस्तेमाल एक प्रोटॉन मकसद बल का निर्माण. झिल्ली प्रोटीन की उभयफिलिक प्रकृति उनके हैंडलिंग पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है, और प्राकृतिक लिपिड वातावरण में पुनर्गठन अपरिहार्य है जब प्रोटॉन translocation की तरह झिल्ली परिवहन प्रक्रियाओं का अध्ययन. यहां, हम विस्तार से एक तरीका है कि प्रोटॉन की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है झिल्ली रेडॉक्स एंजाइमों के तंत्र पम्पिंग, साइटोक्रोम एक उदाहरण के रूप में escherichia कोलाई से 3 बो ले । विद्युत रसायन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन क्विनोन पूल के रेडॉक्स राज्य को नियंत्रित करने और लुमेन में पीएच परिवर्तन की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प के कारण, लाइपोसोम के सैकड़ों एक साथ मापा जा सकता है, जबकि एंजाइम सामग्री एक एकल एंजाइम या liposome प्रति ट्रांसपोर्टर के लिए नीचे बढ़ाया जा सकता है । संबंधित एकल एंजाइम विश्लेषण एंजाइम कार्यात्मक गतिशीलता है कि अंयथा पूरी आबादी के व्यवहार से छिपा हो सकता है में पैटर्न प्रकट कर सकते हैं । हम स्वचालित छवि विश्लेषण के लिए एक स्क्रिप्ट का वर्णन शामिल हैं ।

Introduction

एंजाइम तंत्र और कैनेटीक्स के बारे में जानकारी आमतौर पर एनसेंबल या मैक्रोस्केल स्तर पर हजारों में एंजाइम जनसंख्या के साथ प्राप्त की है लाखों अणुओं के लिए, जहां माप एक सांख्यिकीय औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह ज्ञात है, तथापि, कि इस तरह के एंजाइमों के रूप में जटिल अणुओं उनके व्यवहार और आणविक एनसेंबल स्तर पर मनाया तंत्र में विषमजनन का प्रदर्शन कर सकते है हर अणु के लिए जरूरी वैध नहीं हैं । व्यक्तिगत अणु पैमाने पर ऐसी विचलन बड़े पैमाने पर पिछले दो दशकों के दौरान उभर तरीकों की एक किस्म के साथ एकल एंजाइमों के अध्ययन द्वारा पुष्टि की गई है1. विशेष रूप से, व्यक्तिगत एंजाइम गतिविधि की प्रतिदीप्ति जांच एंजाइमों गतिविधि2,3 की विषमजनन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है या तथाकथित स्मृति प्रभाव की खोज (उच्च एंजाइमों गतिविधि की अवधि कम की अवधि के द्वारा सफल गतिविधि और इसके विपरीत)4,5.

कई एकल एंजाइम अध्ययनों से यह अपेक्षा की जाती है कि एंजाइमों की सतह पर मैटीरियल या किसी अन्य तरीके से स्थिर रूप से निरंतर अवलोकन के लिए देखने के क्षेत्र में पर्याप्त समय तक रहने के लिए निर्धारित किया जाता है । लिपोसोम में एन्जाइम एन्कैप्सूलेशन एंजाइम स्थिरीकरण को सक्षम करने के लिए दिखाया गया है, जबकि सतह-एंजाइम या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन6,7के कारण किसी भी नकारात्मक प्रभाव को रोकता है । इसके अलावा, लिपोसोम अपने प्राकृतिक लिपिड बिलयर पर्यावरण8,9,10में एकल झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय संभावना प्रदान करते हैं ।

झिल्ली प्रोटीन का एक वर्ग, ट्रांसपोर्टरों, कोशिका झिल्ली भर में पदार्थों की एक दिशात्मक स्थानांतरण अभ्यास, एक व्यवहार है कि केवल अध्ययन किया जा सकता है जब प्रोटीन लिपिड bilayers में पुनर्गठन कर रहे हैं (जैसे, liposomes)11, 12,13. उदाहरण के लिए, प्रोटॉन translocation, प्रोकार्योटिक और यूकर्योटिक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के कई एंजाइमों द्वारा प्रदर्शित, एक प्रोटॉन उद्देश्य एटीपी संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया बल बनाने के द्वारा सेलुलर श्वसन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस मामले में, प्रोटॉन पंपिंग गतिविधि इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण करने के लिए युग्मित है, हालांकि इस प्रक्रिया की विस्तृत व्यवस्था अक्सर मायावी बनी हुई है ।

हाल ही में, हम इस संभावना का प्रदर्शन करने के लिए इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री के साथ फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अध्ययन करने के लिए प्रोटॉन पंप escherichia कोलाई के टर्मिनल ubiquinol ऑक्सीडेस के एकल एंजाइमों की गतिविधि (cytochrome बो3) लिपोसोम में पुनर्गठन14. यह ई से तैयार किए गए लिपोसोम के लुमेन में एक पीएच-संवेदी झिल्ली-अभेद्य फ्लोरोसेंट डाई के एनकैप्सुलेशन द्वारा प्राप्त किया गया था । कोलाई ध्रुवीय लिपिड्स (चित्रा 1a). प्रोटीन की मात्रा को अनुकूलित किया गया था ताकि अधिकांश लिपोसोम या तो कोई या केवल एक पुनर्गठन एंजाइम अणु (प्वासों वितरण के अनुसार) निहित हो । साइटोक्रोम बो3 के दो substrates लिपिड मिश्रण है कि liposomes और समाधान में (परिवेश) ऑक्सीजन का गठन करने के लिए ubiquinone जोड़कर प्रदान की गई । liposomes तो एक अर्द्ध पारदर्शी अल्ट्रा चिकनी सोने इलेक्ट्रोड, 6-mercaptohexanol के एक आत्म इकट्ठे monolayer के साथ कवर पर विरल adsorbed हैं । अंत में, इलेक्ट्रोड एक सरल स्पेक्ट्रोइलेक्ट्रोकेमिकल सेल (चित्रा 1b) के तल पर रखा गया है । क्विनोन फंक्शन पूल रेडॉक्स राज्य के विद्युत नियंत्रण एक flexibly ट्रिगर करने के लिए या किसी भी क्षण में एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए अनुमति देता है, जबकि पीएच संवेदनशील डाई के लिए liposomes के लुमेन के अंदर पीएच परिवर्तन की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा प्रोटॉन स्थानांतरण का एक परिणाम के रूप में एंजाइमों. एक दूसरे की प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करके, लिपिड-फ्लोरोसेंट डाई, आकार और मात्रा में व्यक्तिगत लिपोसोम का निर्धारण किया जा सकता है और इस प्रकार एंजाइम प्रोटॉन पंप गतिविधि का परिमाणन । इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने विशेष रूप से पाया कि साइटोक्रोम बो3 अणु एक सहज रिसाव अवस्था में प्रवेश करने में सक्षम हैं जो प्रोटॉन प्रेरक बल को तेजी से dissipates । इस लेख का लक्ष्य विस्तार में एकल liposome माप की तकनीक का परिचय है ।

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Protocol

1. एक लिपिड/uq-10/fdll मिश्रण की तैयारी

नोट: ई. कोलाई लिपिड ' liposomes तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और अच्छी तरह से ubiquinone-10 (एंजाइम सब्सट्रेट) और लंबी तरंग दैर्घ्य फ्लोरोसेंट डाई-लेबल लिपिड के साथ मिश्रित किया जाना चाहिए (लिपोसोम आकार निर्धारण के लिए) से पहले पुनर्गठन.

  1. एक गिलास सिरिंज का उपयोग करना, 5 मिलीग्राम aliquots बनाने के लिए कांच की जीलों में escherichia कोलाई (25 मिलीग्राम/एमएल) से लिपिड ध्रुवीय निकालने के क्लोरोफॉर्म स्टॉक के २०० μl स्थानांतरण ।
  2. 1 मिलीग्राम/एमएल ubiquinone-10 (यूक्यू-10; क्लोरोफॉर्म में) के ५० μl को जोड़ने के लिए लिपिड को uq-10 का अंतिम अनुपात: रक्तदाब 1:100 (1% w/
  3. 1 मिलीग्राम की 20 μl जोड़ें (०.४% w/डब्ल्यू) एक लंबी तरंगदैर्ध्य फ्लोरोसेंट डाई लेबल लिपिड के लिए (fdll)-10 मिक्स ।
  4. क्लोरोफॉर्म विलयन को लघु भ्रुप द्वारा सजाना और एक कोमल नाइट्रोजन या आर्गोन प्रवाह के अंतर्गत क्लोरोफॉर्म का वाष्पन करना । क्लोरोफॉर्म के निशान को पूरी तरह से वैक्यूम के तहत कम से 1 एच के लिए वाष्पीकरण से निकालें ।
    नोट: लिपिड aliquots कई महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर एक निष्क्रिय वातावरण के तहत संग्रहित किया जा सकता है ।

2. साइटोक्रोम बो3 का पुनर्गठन

नोट: ईकोलाई से साइटोक्रोम बो3 की शुद्धि के लिए, rumbley एट अलसे प्रोटोकॉल का पालन करें । 15 natively-तह एंजाइम नमूनों की उच्च शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए, rumbley एट अल द्वारा वर्णित संबध शुद्धि कदम के बाद आकार-बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी जोड़ें. 15

  1. जोड़ें ३१२.५ μl के ४० मिमी mops-KOH/60 मिमी K2तो4, पीएच ७.४, लिपिड के एक aliquot के लिए/uq-10/fdll सूखी मिश्रण (5 मिलीग्राम, चरण १.४) और भंवर के साथ मिश्रण जब तक लिपिड फिल्म पूरी तरह से resuspended है, एक अल्ट्रासोनिक स्नान में उपचार के 2 मिनट के बाद ।
  2. 25 मिमी 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-ट्राइसल्पोनिक एसिड (hpts) के १२५ μl जोड़ें, एक पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई जिसे लिपोसोम के अंदर समझाया जाना चाहिए ।
  3. जोड़ें १३७.५ μl of २५० mM n-octyl β-D-glucopyranoside (ogp) सर्फैक्टेंट, मिश्रण भंवर और sonicate का उपयोग कर एक अल्ट्रासोनिक पानी स्नान में 10 मिनट के लिए सुनिश्चित करने के लिए सभी लिपिड सर्फेक्टेंट micelles में solubilized हैं । एक १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में फैलाव स्थानांतरण ।
    नोट: सर्फैक्टेंट के साथ घुलनबिलाइजेशन के बाद लिपिड के बादल निलंबन पारदर्शी हो जाना चाहिए ।
  4. साइटोक्रोम बो3 की आवश्यक राशि जोड़ें (नीचे दिए गए नोट देखें) और ५० μl (साइटोक्रोम बो3 समाधान प्लस पानी) की कुल मात्रा बनाने के लिए ultrapure पानी जोड़ें । एक रोलर मिक्सर पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    नोट: एकल एंजाइम की स्थिति के लिए विशिष्ट राशि है ०.१ – ०.२% (w/w प्रोटीन-से-लिपिड, यानी5-10 μg प्रोटीन), हालांकि यह तक बढ़ाया जा सकता है 1 – 2% (५० – १०० μg प्रोटीन की) यदि लक्ष्य केवल इलेक्ट्रोकेमिकल गतिविधि का पालन करने के लिए है (नीचे देखें). एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, साइटोक्रोम बो3 के बिना liposomes तैयार किया जा सकता है ।
  5. वजन 2x ५० मिलीग्राम और 2 एक्स १०० polystyrene microbeads के मिलीग्राम चार १.५ मिलीलीटर-ट्यूब कैप्स में और पैराफिन फिल्म के साथ बंद करने के लिए सुखाने को रोकने के ।
    नोट: उपयोग करने से पहले, पॉलीस्टाइरीन माइक्रोमोड्स को मेथनॉल, पानी से धोया जाना चाहिए और निर्माता के मैनुअल के अनुसार पानी में संग्रहित किया जाना चाहिए ।
    ध्यान दें: यदि एक पानी/माइक्रोबीड मिश्रण का उपयोग किया जाता है, तो पॉलीस्टाइरीन माइक्रोमोड्स को आसानी से कैप में एक विस्तृत टिप के साथ microbead के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है । पानी तो microbeads एक पतली टिप के साथ एक micropipette का उपयोग करने से हटाया जा सकता है ।
  6. जोड़ें 1अनुसूचित जनजाति५० पॉलीस्टाइरीन microbeads के पुनर्गठन मिश्रण (चरण २.४) में polystyrene microbeads के साथ टोपी डाल द्वारा १.५ मिलीलीटर-प्लास्टिक ट्यूब पर फैलाव के साथ और सेकंड के एक जोड़े के लिए एक छोटी स्पिन प्रदर्शन । पॉलीस्टाइरीन microbeads के लिए एक रोलर मिक्सर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए अधिशोषण 30 मिनटके लिए सर्फैक्टेंट ।
    1. पॉलीस्टाइरीन माइक्रोमोड्स और इनक्यूबेशंस के परिवर्धन को इस प्रकार दोहराएं: ६० मिनट की ऊष्मायन के लिए माइक्रोमोड्स के ५० मिलीग्राम जोड़ें; ६० मिनट की ऊष्मायन के लिए जोड़ें १०० microbeads के मिलीग्राम ; और १२० मिनट की ऊष्मायन के लिए १०० मिलीग्राम microbeads जोड़ें ।
      नोट: तय microbeads ऊपर समाधान के दौरान पारदर्शी बंद हो जाएगा चरण २.६ के रूप में प्रोटीओलिपोसोम का गठन कर रहे हैं ।
  7. पॉलीस्टाइरीन microbeads से एक पतली टिप के साथ एक micropipette का उपयोग कर प्रोटीओलिपोकुछ समाधान अलग । 20 मिमी mops-KOH/30 मिमी K2तो4, पीएच ७.४ (mops बफर) और एक Ti45 ultracentrifuge ट्यूब में हस्तांतरण के ९० मिलीलीटर में फैलाव पतला ।
  8. ultracentrifuge प्रकार का उपयोग कर फैलाव ४५ Ti रोटर पर १२५,००० एक्स जी (आरमैक्सपर) 1 ज के लिए प्रोटोलियोपोसोम गोली.
    नोट: छोटे अपकेंद्री ट्यूबों इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि बड़े बफर मात्रा में कमजोर पड़ने के अंतिम निलंबन में गैर-encapsulated hpts की एकाग्रता को कम करने में मदद करता है ।
  9. supernatant छोड़ें, 20 मिमी mops-KOH/30 मिमी कश्मीर2तो4, पीएच ७.४ बफर के साथ छर्रों कुल्ला (गोली resuspending के बिना) । rinsing बफर discarding के बाद, फिर से यह पतली टिप micropipette के साथ आगे और पीछे pipetting द्वारा mops बफर के ५०० μl में proteoliposomes निलंबित । फिर एक १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  10. १२,००० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रिप का मलबा हटाने के लिए निलंबन । एक नई शीशी में सुपरनाटैंट (पुनर्गठित प्रोलियोपोसोम) को स्थानांतरित करें ।
  11. पुनर्गठित प्रोलियोपोसोम का फैलाव 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात और 2 दिनों के भीतर उपयोग करें ।

3. अर्ध-पारदर्शी गोल्ड इलेक्ट्रोड का निर्माण

नोट: चिकनी सोने की सतह एक 30 एनएम की एक अलग विधि टेंपलेट द्वारा प्राप्त की है-एक atomically चिकनी सिलिकॉन wafer से ९९.९९% सोने की मोटी परत । सोने की परत की छोटी मोटाई महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अर्द्ध पारदर्शी होना चाहिए प्रतिदीप्ति अवलोकन अनुमति देते हैं । सोने के वाष्पीकरण का विवरण (भौतिक वाष्प जमाव, pvd) कहीं और मिल सकता है16 और केवल टेम्पलेट-अलग करना यहाँ कवर किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, अल्ट्रा चिकनी सोने के चिप्स कहीं और खरीदा जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

  1. गोंद अप करने के लिए 9 ग्लास कवर फिसल जाता है (०.१७ मिमी मोटी) काफूर सोने की सतह पर द्वि-घटक कम प्रतिदीप्ति epoxy का उपयोग कर । 4 एच के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर गोंद का इलाज ।
  2. बस एक स्व के साथ संशोधन से पहले monolayer (चरण 4) इकट्ठे, कांच कवर एक ब्लेड के साथ सिलिकॉन वेफर्स से फिसल जाता है अलग । कवर स्लिप के पतले होने के कारण, कवर स्लिप को क्रैक न करने या कांच की स्लाइडों को तोड़ने पर ध्यान रखें ।

4. स्व के साथ सोने की सतह के संशोधन-इकट्ठे monolayer (सैम)

  1. 1 मिमी 6-mercaptohexanol (6mh) के 5 मिलीलीटर पानी समाधान तैयार करें ।
  2. डुबकी नए सिरे से अलग गोल्ड लेपित कवर फिसल जाता है (चरण ३.१) 6mh समाधान में और छोड़ 20 – 25 ° c रातोंरात (> 16 ज) सैम बनाने के लिए.
    नोट: thiol समाधान एक अप्रिय गंध है, तो एक बंद पोत जब सोने की लेपित कवर पर्ची incubating इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  3. अगले दिन, 6mh समाधान से सोने के लेपित कवर पर्ची निकालें, संक्षेप में पानी या मेथनॉल के साथ और फिर isopropanol के साथ धो लें । एक कोमल गैस के प्रवाह के तहत सूखी ।

5. प्रोतिओलिपोसोम गतिविधि का इलेक्ट्रोकेमिकल परीक्षण

नोट: एंजाइम की इलेक्ट्रोकेमिकल गतिविधि पहले एक बारीकी से पैक लिपोसोम परत पर सत्यापित किया जाता है (चरण 5) और कम आशय आवरण एक आशय प्रयोग में लिपोसोम (चरण 6) के लुमेन में पीएच परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।

  1. एक स्पेक्ट्रो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेल में गोल्ड-लेपित कवर स्लिप को इकट्ठा ( चित्रा 1देखें) । एक रबर हे अंगूठी द्वारा परिभाषित एक क्षेत्र के बाहर एक फ्लैट तार के साथ सोने के लिए संपर्क करें ।
  2. इलेक्ट्रोलाइट बफर समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कक्ष में संदर्भ और सहायक इलेक्ट्रोड रखें ।
    नोट: चर्चा अनुभाग में आगे चर्चा के रूप में, क्लोराइड के बिना संदर्भ इलेक्ट्रोड को विद्युत रसायन के दौरान Au (I) सीएल के गठन को रोकने के लिए पसंद किया जाता है । यहां, a hg/hg2तो4 (sat. कश्मीर2तो4) संदर्भ इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है और क्षमता मानक हाइड्रोजन इलेक्ट्रोड की तरह दिया जाता है (वह) ०.६५८ का उपयोग कर V बनाम वह hg के लिए/hg2SO4 (sat. कश्मीर2तो4) ।
  3. भागो विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (०.१ हर्ट्ज – १०० kHz) पर ओपन सेल क्षमता (ocp) सैम की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए क्षमता. प्रवेश करने के लिए प्रतिबाधा मूल्यों कन्वर्ट और 2πω द्वारा विभाजित करने के लिए एक कोल-कोल प्लॉट प्लॉट, जहां ω आवृत्ति है (निम्न संदर्भ देखें16,17,18 परिवर्तित करने और प्रतिबाधा की व्याख्या के बारे में जानकारी के लिए स्पेक्ट्रा).
    नोट: 6mh के कॉम्पैक्ट और घने sams को अर्ध-सर्कल कोल-कोल प्लॉट के करीब देना चाहिए और सीमा 2.5-3.0 μf/cm2 (चित्रा 2a) में समाई मान देना चाहिए । अर्द्ध वृत्त आकार या आउट-की-श्रेणी समाई मान से महत्वपूर्ण विचलन प्राप्त कर रहे हैं, तो इलेक्ट्रोड परिवर्तित करें ।
  4. स्कैन दरें १०० और 10 mV/s संभावित क्षेत्र में-०.३ – ०.८ V के साथ रिक्त चक्रीय वोल्टामोग्राम (cvs) चलाएँ । एक ठेठ CV (चित्रा 2b, डैश्ड लाइन) पर दिखाया गया है ।
    नोट: यह लगभग शुद्ध कपैसिटिव व्यवहार और महत्वपूर्ण faradaic वर्तमान की अनुपस्थिति का प्रदर्शन करना चाहिए, यहां तक कि परिवेश ऑक्सीजन की स्थिति के तहत यहां इस्तेमाल किया ।
  5. प्रोटीओलिपोसोम जोड़ें (०.५ मिलीग्राम/एमएल अंतिम लिपिड एकाग्रता, 1-2% (w/डब्ल्यू) साइटोक्रोम बो3 के लिए lipid के अनुपात) इलेक्ट्रोकेमिकल सेल करने के लिए और एक पिपेट के साथ थोड़ा मिश्रण. इलेक्ट्रोड सतह पर प्रोलियोपोसोम के अधिशोषण समाप्त होने तक रुको (कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट).
    नोट: 10 mV/s पर चक्रीय वोल्टामोग्राम (सीवीएस) प्रोटिओलिपोसोम सोखना प्रक्रिया का पालन करने के दौरान चलाया जा सकता है । अधिशोषण समाप्त हो गया है जब लगातार cvs बदलने बंद करो । CV तकनीकों के बारे में जानकारी निंनलिखित पाठ्यपुस्तकों में पाया जा सकता है । 19 , 20
  6. इस सेल को बफर सॉल्यूशन से कम से 10 बार बदलकर धो लें लेकिन इलेक्ट्रोड की सतह को पूरी तरह से सूखा छोड़ने से बचें ।
  7. ocp (चित्रा 2a, नीली रेखा) पर विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी भागो सोने इलेक्ट्रोड पर सैम की पुष्टि करने के लिए अपरिवर्तित रहता है और सीवीएस स्कैन दरों के साथ 10 और १०० mV/s उत्प्रेरक ubiquinol ऑक्सीकरण का निरीक्षण करने के लिए (और ऑक्सीजन की कमी) साइटोक्रोम द्वारा बो 3 इलेक्ट्रोकेमिकल क्विनोन की शुरुआत क्षमता में कमी के बारे में 0 वी बनाम वह) (चित्रा 2b) ।

6. enzymatic प्रोटॉन की जांच प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पंप

  1. संशोधित गोल्ड इलेक्ट्रोड के रूप में चरण 5 लेकिन का उपयोग कर 100x कम प्रोओलिपोसोम ५.५ कदम की तुलना में (यानी, 5 μg/एमएल). एकल एंजाइम अध्ययन के लिए, साइटोक्रोम बो3 को लिपिड अनुपात 0.1-0.2% (w/
    नोट: लिपोसोम इलेक्ट्रोड सतह पर विरली अधिशोषण होगा एक आशय निगरानी को सक्षम करने से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा. इन एकल एंजाइम की स्थिति के तहत, इलेक्ट्रोड सतह पर एंजाइम की मात्रा एक उत्प्रेरक वर्तमान के अवलोकन के लिए अपर्याप्त है.
  2. विसर्जन तेल की एक बूंद के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तेल उद्देश्य (60x) पर इलेक्ट्रोकेमिकल सेल रखें । fdll प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करना, इलेक्ट्रोड सतह पर ध्यान केंद्रित. एकल लिपोसोम को सूक्ष्मदर्शी की भिन्न सीमा पर चमकीले धब्बे के रूप में दिखनी चाहिए । fdll प्रतिदीप्ति की एक छवि ले लो ।
  3. यह सत्यापित करने के लिए कि hpts प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से दृश्यमान है और पृष्ठभूमि से पहचाना जा रहा है (चुने हुए एक्सपोज़र समय पर, ६.४ चरण देखें) माइक्रोस्कोप पर hpts प्रतिदीप्ति फ़िल्टर सेट में से एक पर स्विच करें । प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि अगर यह मामला नहीं है ।
  4. कार्यक्रम माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर दो hpts फ़िल्टर सेट बारी से एक समय पर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करने के लिए (मेनू अनुप्रयोगों । निर्धारित करें/ कम से कम छवि अधिग्रहण के बीच देरी सेट करें । इस प्रयोग में, एक 1 एस एक्सपोजर और ०.३ एस देरी (बुर्ज आंदोलन के कारण) का उपयोग करें ।
    नोट: इन दो चैनलों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच का अनुपात बाद में हर समय बिंदु पर लिपोसोम के अंदर पीएच में परिवर्तित हो जाएगा । प्राप्ति की अवधि अपेक्षित pH परिवर्तन दर के अनुसार भिन्न हो सकती है; 5 min इस आलेख में उपयोग किया जाता है ।
  5. छवि अधिग्रहण के दौरान क्षमता को बदलने के लिए potentiostat की सेटिंग को समायोजित करें । उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में, निंनलिखित अनुक्रम का उपयोग करें: 0 – ६० s: कोई संभावित लागू नहीं (यानी ocp); ६० – १८० s:-०.२ V (vs SHE); १८० – ३०० s: ०.४ V (vs SHE). इस मामले में, केवल दूसरे चरण में लागू की क्षमता (-०.२ वी बनाम वह) कुशलतापूर्वक क्विनोन पूल को कम करने के लिए पर्याप्त है ।
  6. एक साथ समय पर छवियां अधिग्रहण (खुर्दबीन) और संभावित अनुक्रम (potentiostat) मैंयुअल रूप से एक ही बार में दोनों माप शुरू करके चलाते हैं ।
    नोट: प्रयोग एक ही इलेक्ट्रोड पर कई बार सतह पर एक अलग क्षेत्र के लिए माइक्रोस्कोप चरण ले जाकर दोहराया जा सकता है । अर्जियों के बीच की देरी सतह पर लिपोसोम के पूर्ण पीएच समानता का बीमा करने के लिए कम से 5-10 मिनट होना चाहिए । अलग durations और संभावित पैटर्न की जरूरत के आधार पर लागू किया जा सकता है, हालांकि इमेजिंग समय अधिग्रहण के दौरान hpts के photobleaching के कारण सीमित है ।

7. प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण

नोट: एक ठेठ प्रयोग एक समय कदम के साथ छवियों का एक सेट पैदा करता है (उदाहरण के लिए, २.६ s) दो चैनलों में से प्रत्येक के लिए, अर्थात्, (अवधि * 2/ एक एकल एंजाइम प्रयोग के दौरान दर्ज की गई ऐसी छवि सेट का एक उदाहरण अनुसंधान डेटा लीड्स रिपॉजिटरी21के माध्यम से पहुँचा जा सकता है । एक छवि उपचार फिजी का उपयोग करके कई कदम होते है (imagej) और उच्च स्तर के गणितीय विश्लेषण प्रोग्रामिंग भाषा सॉफ्टवेयर (henceforth स्क्रिप्टिंग सॉफ्टवेयर के रूप में संदर्भित, विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।

  1. फिजी का उपयोग करने के लिए अलग समय चूक फ़ाइल, छवियों को संरेखित करें और अलग चैनल और timeframes के रूप में बचाने के लिए ।
    1. फिजी के भीतर प्रदत्त bioformats आयातक का उपयोग करके समय व्यतीत फ़ाइल खोलें (मैक्रो आदेश: चलाएँ ("बायो-फ़ॉर्मैट आयातक")).
    2. संभव चरण आंदोलनों के लिए खाता करने के लिए पहले एक के लिए प्रत्येक फ्रेम संरेखित करने के लिए प्लगइन stackreg का उपयोग करें या अधिग्रहण के दौरान थर्मल बहाव हुआ (मैक्रो आदेश: भागो ("stackreg", "रूपांतरण = अनुवाद")).
    3. प्रत्येक चैनल के लिए अलग असम्पीडित छवि फ़ाइलें सहेजें और प्रत्येक समय चरण TIFF स्वरूप में किसी एकल फ़ोल्डर में है ।
    4. समय चूक फ़ाइल मेटाडाटा से प्रत्येक फ्रेम के लिए सटीक समय टिकटों निकालें और छवियों के रूप में एक ही फ़ोल्डर में एक सीएसवी-फ़ाइल के रूप में उन्हें बचाने के लिए । वैकल्पिक रूप से, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय टिकटों को निकालने और एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक सीएसवी-फ़ाइल में मैन्युअल रूप से बचाने के लिए ।
      नोट: छवियाँ और समय stamps के साथ फ़ोल्डर अब स्क्रिप्टिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा विश्लेषित किया जा करने के लिए तैयार है । 7.1.1 कदम । 7.1.4. एक फिजी स्क्रिप्ट का उपयोग automatized किया जा सकता है (एक स्क्रिप्ट समय चूक फ़ाइलों के बैच प्रसंस्करण के लिए अजगर में लिखा प्रदान की जाती है, का उपयोग करें "Ctrl-Shift-N" (Windows में), तो फ़ाइल । स्क्रिप्ट लोड करने के लिए खोलें) ।
  2. छवियों के automatized प्रसंस्करण के लिए पटकथा सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । सॉफ्टवेयर करने के लिए प्रदान की कोड लोड और अंत करने के लिए चलाएँक्लिक करें. जब संकेत दिया है, तो चरण ७.१ से छवियों वाले फ़ोल्डर का चयन करें ।
    नोट: विश्लेषण के लिए एक स्क्रिप्ट mlx-प्रारूप लाइव स्क्रिप्ट के रूप में प्रदान की जाती है, व्यापक टिप्पणियों के साथ, एक liposomes की पहचान करने के लिए, उन्हें 2 डी-गाऊसी समारोह के लिए फिट, उन्हें फिल्टर और समय के प्रत्येक बिंदु पर पीएच मूल्यों यों तो. निम्न उप-चरण स्क्रिप्ट द्वारा स्वचालित रूप से निष्पादित होते हैं ।
    1. स्मृति में एक ही प्रयोग के लिए सभी समय फ्रेम छवियों लोड ।
    2. एक ही चैनल के लिए औसत सभी छवियों (उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ चैनल का चयन करें) और औसत छवि का उपयोग करने के लिए सभी अधिकतम है कि एक liposomes के अनुरूप हो सकता है की पहचान.
    3. 2 डी-गाऊसी समारोह के लिए औसत छवि पर अधिकतम पहचान फिट और प्रत्येक liposome के लिए परिणाम फिट मापदंडों को बचाने (फिट liposome उदाहरण के लिए चित्रा 4a देखें) ।
    4. इस तरह के आकार, संचार और तीव्रता के रूप में अपेक्षित एकल liposomes मानदंड, के अनुसार अधिकतम फ़िल्टर. कि खराब शोर करने के लिए कम संकेत के कारण फिट हैं liposomes अस्वीकार, बारीकी से liposome पड़ोसी या भी छवि बढ़त के करीब जा रहा है.
    5. बाहरी फ़ाइल से समय टिकटों लोड और प्रत्येक समय सीमा छवि अलग से 2d-gaussian समारोह में प्रत्येक फ़िल्टर्ड liposome फिट ।
      नोट: समानांतर प्रोग्रामिंग और मल्टीकोर सीपीयू का उपयोग इस स्तर पर गणना की गति में काफी वृद्धि कर सकते हैं.
    6. लिपोसोम को फिर से समान मापदंड के अनुसार फ़िल्टर करें, जैसा कि चरण 7.2.4 में है लेकिन हर समय सीमा पर लागू किया जाता है ।
    7. हर बार कदम पर, दो चैनलों पर फिट 2d-गाऊसी समारोह से संलग्न संस्करणों के अनुपात के रूप में एक liposome के प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात को परिभाषित । दो hpts चैनलों से निर्धारित तीव्रता के अनुपात से पीएच मूल्यों की गणना और एक अंशांकन वक्र का उपयोग कर (चरण 8). प्लॉट जिसके परिणामस्वरूप ph-लाइपोसोम के लिए समय घटता है और जब क्षमता लागू होती है तो उनके पीएच परिवर्तन का निरीक्षण करते हैं ।

8. hpts प्रतिदीप्ति के एक अंशांकन वक्र प्रदर्शन

नोट: एक intravesicular पीएच के लिए hpts प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तित करने के लिए, एक अंशांकन वक्र पहले स्थापित किया जाना चाहिए कि खाते में इस तरह के सोने की संप्रेषण, फिल्टर गुणवत्ता, आदिके रूप में प्रयोगों की विशेष परिस्थितियों में ले जाएगा यह चरण केवल एक या दो बार किया जा करने के लिए है और अंशांकन डेटा सेटअप और माप पैरामीटर चरण 6 में समान रहने के रूप में लंबे समय के रूप में उपयोग किया जा सकता है ।

  1. (5 और ६.१ चरणों में वर्णित के रूप में साइटोक्रोम बो3 के बिना) विरल अधिशोषित liposomes के साथ एक इलेक्ट्रोड तैयार करें ।
  2. ०.१ मिलीग्राम की 2 μl जोड़ें/एमएल gramicidin समाधान इथेनॉल में 2 मिलीलीटर करने के लिए बफर की एकाग्रता १०० एनजी/एमएल बनाने के लिए ।
  3. दो hpts चैनलों के लिए दो प्रतिदीप्ति छवियों पर कब्जा ।
  4. 1 एम एचसीएल या 1 एम एच2तो4के छोटे aliquots के अलावा सेल के पीएच बदलें । एक मानक पीएच मीटर के साथ बफर के पीएच को मापने और दो hpts चैनलों के लिए दो प्रतिदीप्ति छवियों पर कब्जा ।
  5. चरण ८.४ पीएच श्रेणी 6 से 9 के लिए दोहराएं ।
  6. ७.२ से एल्गोरिथ्म का उपयोग करना, फिट, फिल्टर और हर पीएच पर व्यक्तिगत liposomes के औसत hpts प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना. सभी लिपोसोम पर एचपीटी अनुपात औसत लें ।
  7. परिणामी pH-अनुपात निर्भरता निम्न समीकरण के लिए फ़िट करें:
    Equation, जहां पीकेए, आरए और आरबीफिटिंग पैरामीटर हैं ।
  8. चरण 7.2.7 में व्यक्तिगत लिपोसोम के hpts अनुपात में परिवर्तित करने के लिए पीकेए, आरए और आरबीका प्रयोग करें । पीएच मान के लिए ।

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Representative Results

6mh के एक सैम के साथ सोने की संशोधित कवर स्लिप (इलेक्ट्रोड) की गुणवत्ता विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ प्रत्येक प्रयोग से पहले जाँच की जाती है । चित्रा 2a प्रतिनिधि कोल-कोल भूखंडों से पहले और बाद में इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग मापा जाता है adsorbed हैं । यदि सैम की गुणवत्ता पर्याप्त है, प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी एक अर्द्ध वृत्त कोल-कोल प्लॉट में जिसके परिणामस्वरूप एक लगभग शुद्ध कपैसिटिव व्यवहार का प्रदर्शन करना चाहिए. एक कोल-कोल प्लॉट में अर्ध-वृत्त का व्यास, इलेक्ट्रोड सतह की दोहरी परत धारिता के बराबर होता है, जो 2.5-3.0 μf/cm2 श्रेणी में होना चाहिए । ध्यान दें कि समाई लिपोसोम सोखना पर काफी परिवर्तन नहीं होना चाहिए, हालांकि समाई में मामूली वृद्धि देखी जा सकती है (उच्च लिपोसोम कवरेज, चित्रा 2a, नीचे) या प्रतिबाधा में एक मामूली बदलाव कम पर मनाया जा सकता है आवृत्तियों (कम liposome coverages, चित्रा 2a, ऊपर) ।

वैद्युत रसायन, प्रोटीओलिपोसोम में साइटोक्रोम बो3 की उत्प्रेरक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जहां चक्रीय वोल्टमामिति के साथ मापा उत्प्रेरक धाराओं ubiquinol-ऑक्सीजन oxidoreductase गतिविधि को प्रतिबिंबित । हालांकि, महत्वपूर्ण उत्प्रेरक धाराओं को केवल अधिशोषित प्रोतिओलिपोसोम की उच्च मात्रा में पता लगाया जा सकता है और सोने-संशोधित कवर स्लिप पर प्रोतिओलिपोसोम की बारीकी से पैक की गई परत की आवश्यकता है । चित्रा 2b पहले इलेक्ट्रोड के प्रतिनिधि चक्रीय वोल्टामोग्राम (सीवीएस) को दर्शाता है या तो कम या उच्च liposome कवरेज के साथ liposomes सोखना के बाद । रिक्त CV पर कोई faradaic वर्तमान मनाया जाता है क्योंकि नंगे सोने इलेक्ट्रोड द्वारा ऑक्सीजन की कमी सैम द्वारा अवरुद्ध है. जब सतह उच्च साइटोक्रोम बो3 सामग्री के साथ liposomes के साथ संतृप्त है (१.३% (w/इस मामले में), ऑक्सीजन की कमी के कारण एक स्पष्ट उत्प्रेरक लहर 0 वी की शुरुआत की क्षमता के साथ मनाया जाता है, यानी, ubiquinone की क्षमता कमी (चित्रा 2b, ब्लू लाइन) । ubiquinone पूल एंजाइम के लिए और एक इलेक्ट्रॉन मध्यस्थ के रूप में, एंजाइम से इलेक्ट्रोड सतह के लिए इलेक्ट्रॉनों स्थानांतरित करने के लिए प्राकृतिक सब्सट्रेट के रूप में दोनों कार्य करता है. हम ध्यान दें कि उच्च liposome कवरेज के तहत, व्यक्तिगत vesicles का कोई अंतर माइक्रोस्कोपी द्वारा संभव है और कम कवरेज एकल liposome अध्ययन के लिए आवश्यक है । कम liposome कवरेज पर (लेकिन लिपिड अनुपात करने के लिए उच्च प्रोटीन), उत्प्रेरक वर्तमान काफी कम है, पृष्ठभूमि से बमुश्किल अलग (चित्रा 2b, लाल रेखा) । ध्यान दें कि एकल एंजाइम शर्तों के तहत (लिपिड अनुपात करने के लिए कम प्रोटीन), उत्प्रेरक वर्तमान भी कम है और मज़बूती से मापा नहीं जा सकता.

चित्र 3 लिपोसोम की प्रतिदीप्ति छवियों को तीन भिन्न कडों पर इलेक्ट्रोड पर अधिशोषित दिखाता है । सभी छवियों समान प्रकाश और जोखिम की स्थिति में ले जाया गया और उनकी चमक को समान रूप से समायोजित किया गया था प्रत्यक्ष तुलना सक्षम करने के लिए. डाई युक्त-लिपोसोम उज्ज्वल धब्बे के रूप में छवियों पर दिखाई दे रहे हैं । छवि का केंद्रीय हिस्सा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर प्रकट करने के लिए मिनट के एक जोड़े के लिए photobleached था (हम ध्यान दें कि fdll अपेक्षाकृत photostable है और चित्र 3में पूरी तरह से photobleached नहीं है) । दो hpts चैनलों पर छवियों superimposable हैं, जहां दो चैनलों (410/535 और 470/535) के बीच अनुपात इस प्रयोग में प्रयुक्त पीएच ७.४ से मेल खाती है । लिपोसोम की एक बड़ी संख्या fdll चैनल के साथ दिखाई दे रहे हैं, जो लिपोसोम की उपस्थिति को इंगित करता है जिसमें कोई hpts नहीं होता है । hpts और fdll चैनलों के बीच का अंतर उच्च coverages पर अधिक स्पष्ट है, संभवतः क्योंकि उच्च liposome कवरेज पर, liposomes और फट या सतह पर फ्यूज होने की संभावना है ।

छवि विश्लेषण फ्रेम के संरेखण (पहले फ्रेम के खिलाफ) imagej, प्लगइन stackreg का उपयोग करने की आवश्यकता है । संरेखण अधिकांश स्थितियों में अपरिहार्य है क्योंकि नमूने का एक मामूली थर्मल बहाव आमतौर पर प्रयोग के टाइमस्केल के भीतर होता है, liposome निर्देशांक बदल रहा है । सभी आगे विश्लेषण एक पटकथा सॉफ्टवेयर कोड का उपयोग किया जाता है । यह कोड स्वचालित liposome पहचान करता है । जैसे-जैसे लिपोसोम का आकार अबे डिवर्तन सीमा से नीचे होता है, उनके प्रतिदीप्ति को वास्तविक liposome व्यास (चित्रा 4a) की तुलना में बहुत बड़ा एक बिंदु प्रसार समारोह के रूप में देखा जाता है । कोड एक 2d-गाऊसी समारोह (चित्रा 4a) के लिए दो चैनलों पर प्रत्येक आशय की प्रतिदीप्ति तीव्रता फिट बैठता है और उनके volumetric तीव्रता अनुपात है कि एक अंशांकन वक्र का उपयोग पीएच में परिवर्तित किया जा सकता है की गणना करता है । सभी समय फ्रेम पर इन कार्यों का प्रदर्शन करके, पीएच प्रयोग के टाइमस्केल के भीतर हर आशय के अंदर प्राप्त किया है (मूवी 1) । चित्रा 4b साइटोक्रोम बो3 सामग्री १.३% है जब एक ही छवि के भीतर सभी आशय पीएच परिवर्तन के medians से पता चलता है । पीएच (प्रोटॉन पंपिंग) में वृद्धि स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही है जब-०.१ और-०.३ वी के बीच एक संभावित लागू होता है, लेकिन 0 वी के लिए नहीं क्योंकि बाद में क्विनोन फंक्शन पूल को कम करने के लिए पर्याप्त नहीं है । जब साइटोक्रोम 3 सामग्री बहुत कम है (प्रोटीन के लिए-०.१%, चित्रा 4cके लिपिड अनुपात), औसत घटता खाली liposomes के उन लोगों से लगभग अप्रभेद्य हो (चित्रा 4c) । अंतर स्पष्ट हो जाता है जब यादृच्छिक liposomes के व्यक्तिगत पीएच निशान पर विचार (चित्रा 5, 6 और 7) । जबकि साइटोक्रोम के बिना liposomes बो3 शोर के संबंध में कोई महत्वपूर्ण पीएच परिवर्तन प्रदर्शित (चित्रा 7), liposomes का चयन एक वृद्धि दिखाने (प्रभुत्व) या पीएच की कमी है जब एक क्षमता लागू किया जाता है कि actives साइटोक्रोम बो3 (आंकड़े 6, ग्रे जोन) । लिपोसोम के बीच पीएच-निशान में स्पष्ट अंतर कम प्रोटीन-लिपिड अनुपात के अनुरूप है, जहां साइटोक्रोम बो3 केवल लिपोसोम गतिविधि के एक छोटे सबसेट में मौजूद है । कमी से अधिक पीएच वृद्धि की प्रसार पुनर्गठन विधि द्वारा समझाया गया है कि एक "जावक" एंजाइम अणुओं के अभिविन्यास (ca. ७५%). लिपोसोम का अंश जो एक पीएच परिवर्तन को प्रदर्शित करता है जब साइटोक्रोम बो3 से लिपिड अनुपात अधिक होता है (चित्रा 5) । नोट भी कुछ liposomes प्रोटॉन पंप बंद करो और संभावित आवेदन के अंत से पहले प्रोटॉन क्षय मोड में प्रवेश. हम साइटोक्रोम बो3 एक "रिसाव राज्य" में प्रवेश अणुओं, जो प्रोटॉन वापस liposome लुमेन14में प्रवाह की अनुमति देता है इस व्यवहार विशेषता ।

उनके फिटिंग और प्रोटॉन पंप/लीक दरों का निर्धारण सहित पीएच निशान के आगे विश्लेषण एक स्क्रिप्ट हम पहले प्रकाशित किया है का उपयोग किया जा सकता14,22 और अनुसंधान डेटा लीड्स भंडार से प्राप्त किया जा सकता है 23 , 24.

Figure 1
चित्रा 1: विधि का सिद्धांत । (क) एकल एंजाइम गतिविधि निगरानी का सिद्धांत और (ख) इस कार्य में प्रयुक्त प्रायोगिक स्थापक की योजना एक cutaway के साथ कोशिका के आंतरिक भाग को प्रदर्शित करती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: लिपोसोम की विद्युत रासायनिक प्रतिक्रिया । (A) कोल-कोल भूखंड ओसीपी पर मापा जाता है (०.२२ V बनाम वह; काला वर्गित लाइन) liposomes से पहले और बाद में (१.३% w/w साइटोक्रोम बो3) 5 μg/ml (लाल वृत्त रेखा) और ५०० μg/एमएल (ब्लू सर्कल लाइन) की सांद्रता पर समाधान से सोखना । (ख) १०० mv/s (बायां पैनल) और 10 mv/s (दाएं पैनल) में एयू-सैम (ब्लैक डैश्ड लाइन) से पहले और बाद में लिपोसोम के चक्रीय वोल्टमोग्राम (१.३% w/w साइटोक्रोम बो3) 5 μg/एमएल (लाल रेखा) और ५०० μg/एमएल (ब्लू लाइन) की सांद्रता पर समाधान से अधिशोषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: लिपोसोम की प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी । विभिन्न सतह आवरण पर लिपोसोम की प्रतिदीप्ति छवियाँ: सतहों 5 μg/एमएल (शीर्ष पंक्ति), 20 μg/एमएल (मध्य पंक्ति) और ५०० μg/एमएल (नीचे पंक्ति) के एक liposomes समाधान के साथ 30 मिनट के लिए incubated । बायां स्तंभ 470/535 एनएम उत्तेजन/उत्सर्जन फ़िल्टर सेटअप (1st hpts चैनल) से मेल खाती है; मध्य स्तंभ-410/535 एनएम (2nd hpts चैनल); दायां स्तंभ-560/645 एनएम (fdll चैनल) । छवियों इज़ाफ़ा 90x (60x उद्देश्य और माइक्रोस्कोप द्वारा 1.5 x इज़ाफ़ा कैमरे से पहले), 1 एस एक्सपोजर और इसी तरह प्रकाश तीव्रता पर ले जाया गया । स्केल पट्टियां ५० μm के अनुरूप हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: liposome पहचान और पीएच परिवर्तन । (क) 3 डी-प्रतिदीप्ति छवि के एक भाग के एक ठेठ एकल liposome युक्त दृश्य । इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता एक बिंदु प्रसार समारोह (रंग सतह) है कि एक 2d-गाऊसी समारोह (काले जाल) के लिए फिट है के रूप में देखा जाता है । (बी डी) पीएच, एक छवि क्षेत्र के भीतर सभी vesicles के माध्य के रूप में प्रदर्शित (आम तौर पर कई सौ) अलग लागू क्षमता पर । 0-60 s से, कोई संभावित (ocp) लागू किया जाता है । ६० और १८० एस के बीच (ग्रे जोन) विभिन्न संभावितों को लागू किया गया: 0 वी (काला),-०.१ वी (लाल),-०.२ वी (ग्रीन),-०.३ वी (नीला) । १८० और ३०० एस के बीच, ०.४ वी बनाम। वह लागू किया गया था । साइटोक्रोम बो3 से लिपिड अनुपात (B) १.३%, (C) ०.१%, (D) 0% थे । अंश स्पष्टता के लिए ऑफ़सेट हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: पीएच १.३% एंजाइम वाले लिपोसोम के निशान । ७२ एकल liposomes के पीएच परिवर्तन के निशान, बेतरतीब ढंग से चयनित, साइटोक्रोम बो3 (१.३% w/w युक्त) मापा और एक प्रयोग के दौरान विश्लेषण किया । से 0-60 s, कोई क्षमता लागू किया जाता है (ocp); के बीच ६० और १८० एस (ग्रे जोन)-०.२ वी बनाम। वह १८० और ३०० एस के बीच, ०.४ वी बनाम। वह लागू किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6:०.१% एंजाइम वाले लिपोसोम का पीएच निशान । ७२ एकल liposomes के पीएच परिवर्तन के निशान, बेतरतीब ढंग से चयनित, साइटोक्रोम बो3 (०.१% w/w युक्त) मापा और एक प्रयोग के दौरान विश्लेषण किया । से 0-60 s, कोई क्षमता लागू किया जाता है (ocp); के बीच ६० और १८० एस (ग्रे जोन)-०.२ वी बनाम। वह १८० और ३०० एस के बीच, ०.४ वी बनाम। वह लागू किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: एंजाइम के बिना लिपोसोम का पीएच निशान । ७२ एकल liposomes के पीएच परिवर्तन के निशान, बेतरतीब ढंग से चयनित, साइटोक्रोम बो3 के बिना मापा और एक प्रयोग के दौरान विश्लेषण किया । से 0-60 s: कोई क्षमता लागू किया जाता है (ocp); के बीच ६० और १८० एस (ग्रे जोन)-०.२ वी बनाम। वह १८० और ३०० एस के बीच, ०.४ वी बनाम। वह लागू किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Movie 1
मूवी 1: एकल liposome पीएच परिवर्तन के एनिमेशन । (शीर्ष पैनल) दो hpts चैनलों पर एक liposome प्रतिदीप्ति के परिवर्तन (3 डी के रूप में दिखाया इसी क्षेत्र के सतह प्लॉट) प्रयोग के ३०० s के दौरान । अपचयी संभावित ६० s और १८० एस के बीच लागू किया गया था (नीचे पैनल) समय बनाम दो hpts चैनलों की volumetric तीव्रता अनुपात की इसी साजिश । गुटशील संभावित आवेदन के क्षेत्र ग्रे में छाया हुआ है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

पूरक फ़ाइलें. कृपया फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्णित विधि श्वसन झिल्ली प्रोटीन द्वारा पंप प्रोटॉन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है जिसे लिपोसोम में पुनर्गठन किया जा सकता है और क्विनोन फंक्शन पूल के साथ इलेक्ट्रॉनों का आदान-प्रदान करने में सक्षम है । प्रोटॉन पम्पिंग गतिविधि को liposome लुमेन (चित्रा 1a) में पीएच-संवेदी (ratiometric) रंजक का उपयोग करके एकल-एंजाइम स्तर पर मॉनिटर किया जा सकता है ।

विधि ubiquinone की क्षमता पर निर्भर करता है (या अन्य quinones), लिपिड bilayer में शामिल, एक सैम18के साथ संशोधित इलेक्ट्रोड के साथ विनिमय इलेक्ट्रॉनों के लिए. सोने इलेक्ट्रोड के गुण, एक सैम के साथ संशोधित, बहुत विशिष्ट हैं. liposomes सैम पर अधिशोषण की जरूरत है और सैम के लिए पर्याप्त पतली करने के लिए तेजी से इलेक्ट्रोकेमिकल ऑक्सीकरण और लिपोसोम में क्विनोन फंक्शन पूल की कमी को सक्षम होना चाहिए । महत्वपूर्ण बात, इलेक्ट्रोड और liposome के बीच बातचीत के लिए पर्याप्त कमजोर लिपिड झिल्ली की अखंडता ख़राब नहीं होना चाहिए. इसके अलावा, प्रयोगात्मक प्रणाली के विवरण के आधार पर, यह वांछनीय है अगर सैम सोने catalyzed साइड प्रतिक्रियाओं को रोकता है, इस तरह के ऑक्सीजन में कमी के रूप में. अंत में, सैम को संभावित खिड़की के भीतर स्थिर होने की जरूरत है । 6mh के उच्च गुणवत्ता वाले सैम के साथ संशोधित अल्ट्रा-फ्लैट गोल्ड इलेक्ट्रोड्स का उपयोग साइटोक्रोम बो3के मामले में इन आवश्यकताओं को पूरा करता है । atomically से सोने इलेक्ट्रोड अलग करना-फ्लैट सिलिकॉन वेफर्स एक अल्ट्रा के पास एक आदर्श सैम के साथ चिकनी सोने की सतह बनाता है के रूप में प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा द्वारा संकेत दिया । कृपया ध्यान दें कि हम 6mh से सैम को पानी में बनाते हैं । हम पहले के साथ sams पर सूचना दी 6mh में isopropanol16, लेकिन इन sams प्रदर्शन उच्च डबल परत समाई मूल्यों और प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा कि एक अधिक विषम सतह से संकेत मिलता है (यानी, अधिक दोष) एक कम प्रतिरोध के साथ. इसके अलावा, जब 6mh से sams एक पानी के समाधान से तैयार कर रहे हैं, कम पृष्ठभूमि ऑक्सीजन की कमी (सोने उत्प्रेरित ऑक्सीजन की कमी के कारण) एक इथेनॉल से गठित sams की तुलना में मनाया/isopropanol समाधान. इन सभी टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि पानी के समाधान में 6mh से sams कम दोषों के साथ एक उच्च गुणवत्ता है । उच्च गुणवत्ता sams भी अब ऐल्केन जंजीरों के साथ thiol-यौगिकों से गठन किया जा सकता है (जैसे, 1-hydroxy-decane-thiol), लेकिन इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण गतिकी सैम मोटाई बढ़ जाती है के रूप में धीमी हो जाते हैं.

(स्पेक्ट्रो) विद्युत रसायन के दौरान, क्लोराइड आयनों बफर समाधान में बचा जाना चाहिए क्योंकि वे उच्च क्षमता पर सोने की सतह पर chemosorb हो सकता है, संभवतः सैम गुणवत्ता बिगड़ती । एक ही कारण के लिए, एक क्लोराइड मुक्त संदर्भ इलेक्ट्रोड पसंद किया जाना चाहिए ।

एक और महत्वपूर्ण बिंदु liposomes की पृष्ठभूमि पारगम्यता प्रोटॉन के लिए है, जो प्रयोग के टाइमस्केल पर एंजाइमी प्रोटॉन स्थानांतरण का एक परिणाम के रूप में प्रोटॉन संचय की अनुमति के लिए काफी कम होना चाहिए. सटीक लिपिड रचना इस पारगम्यता को प्रभावित कर सकती है । हमारे काम में, हम उबिक्विनोन-10 के साथ पूरक ध्रुवीय ई. कोलाई लिपिड निष्कर्षों का उपयोग करते हैं । प्रोटॉन पारगम्यता फैटी-एसिड श्रृंखला की लंबाई25पर दृढ़ता से निर्भर दिखाया गया है, हालांकि यह अधिक जटिल लिपिड रचनाओं के साथ अध्ययन में विरोधाभास किया गया है26. दिलचस्प है, ubiquinone हाल ही में झिल्ली स्थिरता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है27. अंत में, प्रोटीन पुनर्गठन प्रक्रिया से अवशिष्ट डिटर्जेंट प्रोटॉन रिसाव को प्रभावित कर सकते हैं और इसलिए हाइड्रोफोबिक पॉलीस्टाइरीन माइक्रोमोड्स का उपयोग करके डिटर्जेंट को पूरी तरह से हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, अपकेंद्रीकरण के बाद कमजोर पड़ने और प्रोट्रोलिपोसोम के बाद विद्युत कोशिका की पूरी तरह से धोने की सतह पर adsorbed हैं । यदि संदिग्ध, liposome पारगम्यता लुमेन पीएच परिवर्तन का पालन करके सत्यापित किया जा सकता है (hpts के माध्यम से) एक बाहरी पीएच28कूद करने के लिए एक प्रतिक्रिया में ।

एकल एंजाइम माप की आवश्यकता होती है unilamelar लिपोसोम और छोटे liposomes तेजी से या उच्च पीएच परिवर्तन दिखाने के लिए के रूप में लुमेन की मात्रा कम हो जाती है की उम्मीद कर रहे हैं. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, पॉलीस्टाइरीन माइक्रोमोड्स को धीरे से छोटी मात्रा में जोड़ा जाता है जिससे लिपोसोम गठन की धीमी गति होती है । ऐसी स्थितियों में, सजातीय आकार के छोटे लिपोसोम ७० एनएम के एक औसत व्यास के साथ बनते हैं और हमारे मामले में14में से ०.२४ का एक polydispersity इंडेक्स है । hpts भी पॉलीस्टाइरीन microbeads पर adsorbs, पॉलीस्टाइरीन microbeads की क्षमता को कम करने adsorbs डिटर्जेंट । इसलिए, इसके नुकसान की भरपाई के लिए अतिरिक्त पॉलीस्टाइरीन माइक्रोमोड्स को जोड़ा जाना चाहिए । पॉलीस्टाइरीन microbeads के साथ उपचार के बारे में एक चौथाई से लिपिड प्रोटीन निलंबन में hpts एकाग्रता को कम करने के लिए मनाया गया (से 5 मिमी से 3-4 मिमी). हालांकि, liposome के लुमेन में वास्तविक hpts एकाग्रता उच्च हो सकता है के बाद से liposomes पॉलीस्टाइरीन microbeads के साथ इलाज पर जल्दी गठन कर रहे हैं । hpts के बजाय, अन्य पीएच-संवेदी रंजक इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि डाई झिल्ली-अभेद्य और अनुरामितिक है । उत्तरार्द्ध photobleaching और समझाया डाई की मात्रा बदलती के कारण प्रयोगात्मक त्रुटियों से बचा जाता है ।

सरल गणना का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है कि क्या, stochastically, गैर खाली liposomes के अधिकांश केवल एक एंजाइम अणु होते हैं. ७० एनएम के एक औसत liposome व्यास, ७५० दा की एक लिपिड आणविक वजन और ०.६५ एनएम2 के एक लिपिड क्षेत्र संभालने हमें 5.2 x10-17 जी, अर्थात्, 9.6 x1013 liposomes की तैयारी के प्रति एक liposome द्रव्यमान देता है (5 मिलीग्राम लिपिड की) । साइटोक्रोम बो3 के ०.१% से कम (मेगावाट = १४४ केडीए), 2x1013 एंजाइम अणुओं मौजूद हैं, एक ०.२ प्रोटीन के लिए इसी: liposome अनुपात. एक पायसन वितरण का उपयोग करते हुए, एक आगे की गणना कर सकते हैं कि संभावना एक एंजाइम अणु खोजने के लिए (17%) प्रति liposome एक से अधिक अणु खोजने के लिए संभावना की तुलना में दस गुना अधिक है (१.७%). अधिक सटीक गणना किया जा सकता है अगर इसी assays से निर्धारित पुनर्गठन के दौरान एंजाइम और लिपिड के नुकसान को ध्यान में रखा जाता है । बाद एक प्रोटीन परख से अनुमान लगाया जा सकता है और तैयार liposomes के fdll प्रतिदीप्ति को मापने के द्वारा ।

एक बार प्रोटोकॉल की स्थापना की है और एकल एंजाइम निशान दर्ज कर रहे हैं, विधि के आगे संशोधनों के उद्देश्य के आधार पर संभव है. एक एंजाइम अवरोधक के अलावा या प्रणाली में एक आयनधर की शुरूआत के बारे में सोच सकते हैं । ध्यान यह सत्यापित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि आयनोफोर या अवरोधक स्टॉक तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स के अलावा सैम या लिपोसोम की पारगम्यता को प्रभावित नहीं करते हैं ।

तकनीक के रूप में यहां वर्णित एंजाइमों के एक विशेष समूह है कि दोनों झिल्ली प्रोटॉन ट्रांसपोर्टर और quinone-परिवर्तित करने के लिए सीमित है । उपकरण और प्रयोगात्मक शर्तों के रूप में यहां इस्तेमाल किया साइटोक्रोम बो3के एंजाइमेटिक गतिविधि के लिए अनुकूलित किया गया । यहां, समय संकल्प 2-3 सेकंड है, जोखिम समय और यह बुर्ज के लिए लेता है समय से निर्धारित फिल्टर बदलने के लिए । प्रयोग की अवधि फ्लोरोसेंट डाई के photobleaching द्वारा सीमित है और, इस प्रकार, प्रकाश तीव्रता से । हम पहले से पाया है औसत प्रोटॉन स्थानांतरण साइटोक्रोम बो3 की दर ७३ ± २.२ प्रोटॉन/एस इस तकनीक का उपयोग कर, हालांकि 20 प्रोटॉन के लिए नीचे गतिविधियों का पता लगाया गया । या तो अधिक या कम गतिविधि के साथ एंजाइमों के लिए इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए, छवि अधिग्रहण मापदंडों (यानी, प्रकाश तीव्रता, जोखिम समय और प्रयोग की अवधि) अनुकूलित करने की आवश्यकता है । भविष्य में, यह विधि अन्य इलेक्ट्रॉन परिवहन ड्राइविंग प्रोटॉन पंप एंजाइमों की ओर बढ़ाया जा सकता है, एक उदाहरण mitochondrial मैं जा रहा है । अंय एंजाइमों अलग पुनर्गठन प्रोटोकॉल की आवश्यकता हो सकती है, और यह एक अलग ट्रांसपोर्टर के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी । प्रोटॉन पंपों कि quinone नहीं कर रहे है परिवर्तित एंजाइमों भी अध्ययन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए , एटीपी संचालित29, हालांकि इस मामले में प्रोटॉन स्थानांतरण इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रिगर नहीं किया जा सकता, लेकिन एक प्रारंभकर्ता के अलावा (जैसे, एटीपी) की आवश्यकता है. उत्तरार्द्ध मामले में, एक सोने संशोधित कवर पर्ची का उपयोग करने की कोई जरूरत नहीं है । इसके अलावा, बशर्ते कि एक उपयुक्त झिल्ली-अभेद्य और आयन-संवेदी फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग किया जाता है, इस विधि को अन्य आयनिक पंपों, जैसे सोडियम और पोटेशियम के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को वित्तीय सहायता के लिए bbsrc (BB/P005454/1) स्वीकार करते हैं । एनएच विलियम फाउंडेशन युवा अन्वेषक कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू १४४ साइटोक्रोम बो3 सिंगल एंजाइम प्रोटीओलिपोसोम पीएच-संवेदी डाई प्रोटॉन ट्रांसलोकेशन बायोइलेक्ट्रोकेमिस्ट्री
इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन
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Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

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