Summary

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

Published: February 21, 2019
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo molecolare della traslocazione di protoni attraverso le membrane del lipido di liposomi singoli, utilizzando citocromo bo3 come esempio. Combinando elettrochimica e microscopia a fluorescenza, le variazioni del pH in lumen del singole vescicole, contenenti singole o multiple enzima, possono essere rilevati e analizzati singolarmente.

Abstract

Protone-pompaggio enzimi dell’elettrone trasferimento reazioni di ossidoriduzione Coppia catene alla traslocazione di protoni attraverso la membrana, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la produzione di ATP. La natura anfifilica delle proteine di membrana richiede particolare attenzione al loro trattamento, e la ricostituzione nell’ambiente naturale del lipido è indispensabile quando si studia i processi di trasporto di membrana come protone traslocazione. Qui, abbiamo dettaglio un metodo che è stato utilizzato per l’indagine sul meccanismo di pompaggio di protoni di enzimi redox della membrana, prendendo citocromo bo3 da Escherichia coli come un esempio. Una combinazione di microscopia di fluorescenza ed elettrochimica viene utilizzata per controllare lo stato redox dei cambiamenti di pH piscina e monitor del chinone in lumen. A causa della risoluzione spaziale di microscopia fluorescente, centinaia di liposomi possa essere misurati simultaneamente mentre il contenuto degli enzimi può essere scalato verso il basso per un singolo enzima o trasportatore a liposoma. L’analisi di rispettivo singolo enzima può rivelare modelli nella dinamica funzionale degli enzimi che potrebbe altrimenti essere nascosti dal comportamento dell’intera popolazione. Includiamo una descrizione di uno script per l’analisi di immagine automatizzato.

Introduction

Informazioni sui meccanismi degli enzimi e cinetica sono ottenuti solitamente al livello ensemble o macroscala con popolazione di enzima in migliaia a milioni di molecole, dove misure rappresentano una media statistica. È noto, tuttavia, che le macromolecole complesse quali enzimi possono dimostrare eterogeneità nel loro comportamento e osservati a livello di insieme di meccanismi molecolari non sono necessariamente validi per ogni molecola. Tali deviazioni sulla scala singola molecola sono stati ampiamente confermati da studi di singoli enzimi con una varietà di metodi emergenti durante l’ultimo ventennio1. In particolare, rilevazione della fluorescenza di attività enzimatica individuale è stato utilizzato per indagare eterogeneità di enzimi attività2,3 o scoprire l’effetto della cosiddetta memoria (periodi di attività di enzimi elevati è riuscito da periodi di bassa attività e viceversa)4,5.

Molti studi di singolo enzima richiedono che gli enzimi sono immobilizzati sulla superficie o nello spazio fisso in un altro modo per rimanere sufficientemente lunga nel campo visivo per osservazione continua. Incapsulamento di enzima nei liposomi è stato indicato per attivare immobilizzazione degli enzimi, evitando qualsiasi impatto negativo dovuto la superficie-enzima o proteina-proteina, interazioni6,7. Inoltre, liposomi offrono una possibilità unica per lo studio di proteine di membrana singola nel loro naturale dei lipidi bilayer ambiente8,9,10.

Una classe di proteine di membrana, trasportatori, esercita uno spostamento direzionale di sostanze attraverso la membrana cellulare, un comportamento che può essere studiato solo quando proteine sono ricostituite in lipidi bilayer (ad es., liposomi)11, 12,13. Ad esempio, traslocazione protonica, esibito da parecchi enzimi delle catene di trasporto dell’elettrone procariote ed eucariote, svolge un ruolo importante nella respirazione cellulare, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la sintesi di ATP. In questo caso, il protone attività di pompaggio è accoppiato per il trasferimento di elettroni, anche se il meccanismo dettagliato di questo processo spesso resta sfuggente.

Recentemente, abbiamo dimostrato la possibilità di rilevazione fluorescente coppia con elettrochimica per studiare protone pompaggio attività di singoli enzimi dell’ossidasi terminale ubiquinol di Escherichia coli (citocromo bo3) ricostituiti nei liposomi14. Questo è stato ottenuto mediante incapsulamento di un colorante fluorescente membrana impermeabile pH sensibili nel lumen di liposomi preparato da E. coli lipidi polari (Figura 1A). La quantità di proteina è stata ottimizzata in modo che maggior parte dei liposomi o contenuto nessuna o solo una molecola di enzima ricostituito (secondo la distribuzione di Poisson). I due substrati del citocromo bo3 sono stati forniti da aggiungere alla miscela di lipidi che formavano i liposomi e ossigeno (ambientale) in soluzione ubichinone. I liposomi sono quindi scarsamente adsorbiti su elettrodo d’oro ultra-liscio semi-trasparente, coperto con un monostrato auto-assemblato di 6-mercaptohexanol. Infine, l’elettrodo è montato sulla parte inferiore di una cella di Spettroelettrochimica semplice (Figura 1B). Elettrochimico controllo dello stato redox chinone piscina permette uno per attivare in modo flessibile o per fermare la reazione enzimatica in qualsiasi momento, mentre la tintura di pH sensibili viene utilizzata per monitorare le variazioni del pH all’interno del lume dei liposomi come conseguenza di spostamento di protoni dalla enzimi. Utilizzando che l’intensità di fluorescenza di un colorante fluorescente in secondo luogo, associati a lipidi, la dimensione e il volume dei liposomi individuali può essere determinato e così la quantificazione del protone di enzima attività di pompaggio. Utilizzando questa tecnica, abbiamo trovato in particolare che il citocromo bo3 molecole sono in grado di entrare in uno stato di perdita spontanea che si dissolve rapidamente la forza motrice protonica. L’obiettivo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica delle misurazioni singole liposoma in dettaglio.

Protocol

1. preparazione di una miscela di lipidi/UQ-10/FDLL Nota: E. coli lipidi utilizzati per la preparazione dei liposomi dovrebbero essere aliquotati e accuratamente miscelati con ubiquinone-10 (enzima-substrato) e di lunghezza d’onda fluorescenti ha tingere-contrassegnati i lipidi (per determinare la dimensione liposomi) prima dei ricostituzione. Usando una siringa di vetro, trasferimento 200 µ l di brodo di cloroformio di lipidi polari estrarre da Escherichia col…

Representative Results

La qualità del coprioggetto oro-modificato (l’elettrodo) con una SAM di 6MH è controllata prima di ogni esperimento con la spettroscopia di impedenza elettrochimica. La Figura 2A Mostra rappresentative trame di Cole-Cole misurati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica prima e dopo i liposomi sono adsorbiti. Se la qualità di SAM è sufficiente, spettroscopia di impedenza dovrebbe dimostrare un comportamento capacitivo quasi puro risultante in un…

Discussion

Il metodo descritto è adatto per studiare protone pompaggio di proteine di membrana respiratoria che possono essere ricostituite in liposomi e sono in grado di scambiare elettroni con lo stagno del chinone. Protone attività di pompaggio può essere monitorato a livello di singolo-enzima utilizzando coloranti sensibili al pH (raziometrici) incapsulati nel lume liposoma (Figura 1A).

Il metodo si basa sulla capacità di ubiquinone (o altri chinoni), incorporato nel…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono la BBSRC (BB/P005454/1) per il sostegno finanziario. NH è stato finanziato dal programma VILLUM Foundation Young Investigator.

Materials

6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

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