Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון המולקולרי של פרוטון רוברטסונית על פני הממברנות השומנים של ליפוזומים יחיד, ציטוכרום בו3 כדוגמא. שילוב אלקטרוכימיה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, pH לשינויים לומן של שלפוחית אחת, המכילה יחיד או אנזים מרובים, ועוזרת שנותחו בנפרד.
Abstract
משאבות פרוטונים אנזימים של אלקטרון העברה שרשראות כמה תגובות חמצון-חיזור פרוטון רוברטסונית על פני הקרום, יצירת כוח המניע-פרוטון לייצור ATP. מהות קרום חלבונים amphiphilic דורש תשומת לב מיוחדת לטיפול שלהם, שיחזור לסביבה הטבעית השומנים היא הכרחית עבור לומדים תחבורה תהליכים קרום כמו טרנסלוקציה פרוטון. כאן, אנחנו פירוט שיטת שימש במשך החקירה של מנגנון משאבות פרוטונים של קרום אנזימים חמצון-חיזור, לוקח ציטוכרום בו3 Escherichia coli כדוגמה. שילוב של מיקרוסקופיית אלקטרוכימיה, קרינה פלואורסצנטית משמש כדי לקבוע את מצב חמצון-חיזור quinone בריכה וצג pH השינויים לומן. בגלל שהרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מאות ליפוזומים ניתן למדוד בו זמנית בעוד התוכן האנזים וניתן לשנותם אנזים יחיד או טרנספורטר לכל ליפוזום. ניתוח האנזים יחיד המתאימים יכול לחשוף דפוסים הדינמיקה פונקציונלי של אנזים זה ייתכן אחרת מוסתר על ידי ההתנהגות של כלל האוכלוסייה. אנו כוללים תיאור של קובץ script עבור ניתוח תמונות אוטומטית.
Introduction
מידע על מנגנונים אנזים וקינטיקה מתקבלת בדרך כלל על אנסמבל macroscale הרמה או עם אנזים אוכלוסייה באלפים מיליוני מולקולות, כאשר מידות מייצגים ממוצע סטטיסטי. זה ידוע, עם זאת, כי מקרומולקולות מורכבים כמו אנזימים עשוי להדגים הטרוגניות בהתנהגות שלהם, המנגנונים המולקולריים נצפתה רמה אנסמבל אינם בהכרח חוקיים עבור כל מולקולה. כזה סטיות בסולם מולקולה בודדת בהרחבה אושרו על ידי מחקרים של אנזימים יחיד עם מגוון רחב של שיטות המתעוררים במהלך שני העשורים האחרונים1. ראוי לציין, קרינה פלואורסצנטית גילוי של פעילות אנזים בודדים שימש לחקור הטרוגניות של אנזימים-פעילות-2,-3 או לגלות את אפקט זיכרון כביכול (תקופות של פעילות אנזימים גבוהה על ידי תקופות של לחץ נמוך פעילות ו ולהיפך)4,5.
מחקרים אנזים יחיד רבים דורשים כי האנזימים הם ותשמרו על פני השטח או קבוע במרחב בדרך אחרת להישאר מספיק זמן שם שדה הראייה להשגחה מתמדת. אנזים אנקפסולציה בתוך ליפוזומים הוכח להפעלת האנזים הנייח תוך מניעת כל השפעה שלילית בשל פני השטח-אנזים או חלבון אינטראקציות6,7. בנוסף, ליפוזומים מציעים אפשרות ייחודית ללמוד חלבוני ממברנה אחת שלהם השומנים הטבעיים bilayer הסביבה8,9,10.
מחלקה של קרום חלבונים, מובילים, תרגילים התקה כיוונית של חומרים על פני קרום התא, התנהגות שניתן רק ללמוד כאשר חלבונים הם מחדש לתוך השומנים bilayers (למשל, ליפוזומים)11, 12,13. לדוגמה, רוברטסונית פרוטון, הוצגו על ידי מספר אנזימים רשתות תחבורה אלקטרון prokaryotic ו האיקריוטים, ממלא תפקיד חשוב בנשימה תאית על ידי יצירת כוח המניע-פרוטון המשמש סינתזת ATP. במקרה זה, פרוטונים שאיבה פעילות זה משולב כדי העברת אלקטרונים, למרות מנגנון מפורט של תהליך זה לעיתים קרובות נותרת חמקמקה.
לאחרונה, להדגים את האפשרות זיהוי פלורסנט זוג עם אלקטרוכימיה ללמוד פרוטון שאיבה פעילות של אנזימים יחיד של מסוף ubiquinol אוקסידאז של Escherichia coli (ציטוכרום בו3) מחדש ליפוזומים14. . זה הושג על-ידי ומגעים צבע אטום-ממברנה רגיש pH פלורסנט לתוך לומן של ליפוזומים מקריסטלים של אי coli ליפידים קוטביים (איור 1 א'). כמות חלבון אופטימלי כך רוב ליפוזומים הכיל גם מולקולת אנזים משוקם אין או אחד בלבד (על פי התפלגות פואסון). שני מצעים של ציטוכרום בו3 נמסרו על-ידי הוספת ubiquinone לתערובת השומנים שיצרו ליפוזומים וחמצן (הסביבה) בתמיסה. ליפוזומים הם מכן בדלילות הספוחה על שקוף למחצה ultra-חלקה זהב אלקטרודה, מכוסה טפט שהורכב עצמית של 6-mercaptohexanol. לבסוף, האלקטרודה נטענה על החלק התחתון של תא spectroelectrochemical פשוטה (איור 1B). שליטה אלקטרוכימי של המדינה quinone בריכת חמצון-חיזור מאפשר אחד בגמישות להפעיל או להפסיק את התגובה אנזימטי בכל רגע, בעוד לצבוע רגיש pH משמשת כדי לעקוב אחר השינויים pH בתוך לומן של ליפוזומים כתוצאה פרוטון רוברטסונית מאת אנזימים. על-ידי שימוש ניתן לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית השני, השומנים מכורך הפלורסנט, גודל ונפח של ליפוזומים בודדים ובכך כימות של אנזים פרוטון שאיבה פעילות. בעזרת טכניקה זו, ובייחוד מצאנו כי ציטוכרום בו3 מולקולות מסוגלים להיכנס למצב הדליפה ספונטנית כי כלתה במהירות את הכוח המניע של פרוטון. המטרה של מאמר זה היא להציג את הטכניקה של ליפוזום יחיד מדידות בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תערובת ליפיד/UQ-10/FDLL
הערה: אי קולי ליפידים המשמש עבור ההכנה של ליפוזומים צריך להיות aliquoted ולערבב היטב עם ubiquinone-10 (סובסטרט) ושומנים ארוך באורך הגל פלורסנט התווית על-ידי צבע (לקביעת גודל ליפוזומים) לפני שיחזור.
- באמצעות מזרק זכוכית, µL 200 העברה של כלורופורם מלאי של ליפידים קוטביים לחלץ מ- Escherichia coli (25 מ"ג/מ"ל) לתוך מבחנות זכוכית לעשות 5 מ"ג aliquots.
- להוסיף 50 µL של 1 מ"ג/מ"ל ubiquinone-10 (UQ-10; ב כלורופורם) כדי ליפידים כדי להפוך את היחס הסופי של UQ-10: ליפידים בטחונות (1% w/w).
- הוסף 20 µL של 1 מ"ג/מ"ל (0.4% w/w) של זמן באורך הגל פלורסנט התווית על-ידי צבע ליפופרוטאין (FDLL) לתערובת ליפידים/UQ-10.
- Homogenize הפתרון כלורופורם מאת vortexing קצר, מתאדים רוב הכלורופורם תחת זרם עדין חנקן או ארגון. להסיר את עקבות כלורופורם לחלוטין על-ידי אידוי נוספות תחת ואקום במשך לפחות שעה.
הערה: השומנים aliquots ניתן לאחסן תחת אווירה אינרטי ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
2. שיחזור של ציטוכרום בו3
הערה: עבור הטיהור של ציטוכרום בו3 מ- e. coli, בצע את הפרוטוקול מ Rumbley ואח. 15 כדי להבטיח טוהר גבוהה של האנזים מקופלת מקורי דגימות, הוסף גודל הוצאת גזים לאחר השלב טיהור זיקה מתוארת על ידי. Rumbley et al. 15
- הוסף µL 312.5 של 40 מ מ מגבים-קו/60 מ מ K2כדי4, pH 7.4, כדי aliquot אחד של ליפידים/UQ-10/FDLL יבשים לערבב (5 מ"ג, שלב 1.4) ומערבבים עם מערבולת עד הסרט השומנים מלא resuspended, ואחריו 2 דקות של טיפול באמבט אולטראסוני.
- הוסף µL 125 של 25 מ מ 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic חומצה (HPTS), רגיש pH הפלורסנט שצריך להיות אנקפסולציה בתוך ליפוזומים.
- להוסיף 137.5 µL של n-אוקטיל-250 מ מ β-D-glucopyranoside (בווידאו) חומרים פעילי שטח, לערבב בעזרת מערבולת, sonicate באמבט אולטראסוני מים למשך 10 דקות להבטיח שכל ליפידים הם solubilized לתוך חומרים פעילי שטח הקזאין. להעביר את הפיזור לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ.
הערה: מעונן השעיית שומנים צריך להיות שקוף לאחר solubilization עם חומרים פעילי שטח. - להוסיף את הכמות הנדרשת של ציטוכרום בו3 (ראה להלן בהערה) ומוסיפים מים הנדסה גנטית כדי להפוך את הנפח הכולל של 50 µL (ציטוכרום בו3 פתרון בתוספת מים). דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מערבל רולר.
הערה: טיפוסי כמות אנזים אחד התנאים הוא 0.1-0.2% (w/w חלבון-כדי-השומנים, כלומר-5 – 10 µg של חלבון), למרות זאת ניתן להגדיל עד 1-2% (50 – 100 µg של חלבון) אם המטרה היא לבחון רק הפעילות אלקטרוכימי (ראו להלן). כפקד שלילית, ניתן להכין ליפוזומים ללא ציטוכרום בו3 . - שוקל 2 x 50 מ"ג ו 2 x 100 מ"ג של גרגרי פוליסטירן לתוך ארבע 1.5 mL-שפופרת כמוסות וסגור עם פרפין סרט כדי למנוע התייבשות.
שים לב: לפני השימוש, גרגרי פוליסטירן יש לחפוף מתנול, מים ומאוחסנים מים לפי הוראות היצרן.
הערה: אם תערובת מים/microbead, גרגרי פוליסטירן בנוחות ניתן להעביר את הכובע עם micropipette עם טיפ רחב. מים ואז ניתן להסיר את גרגרי באמצעות micropipette עם טיפ דק. - הוסף אתst150 מ"ג של גרגרי פוליסטירן לתערובת הכינון (שלב 2.4) על-ידי חבישת הכיפה עם גרגרי פוליסטירן ברכבת התחתית 1.5 mL-פלסטיק עם פיזור וביצוע סיבוב קצר לכמה שניות. דגירה-4 מעלות צלזיוס על מערבל רולר עבור גרגרי פוליסטירן לספוח את חומרים פעילי שטח למשך 30 דקות.
- חזור על תחילתה של גרגרי פוליסטירן ו incubations כדלקמן: להוסיף 50 מ"ג של גרגרי למשך 60 דקות של דגירה; להוסיף 100 מ ג של גרגרי למשך 60 דקות של דגירה; ולהוסיף 100 מ ג של גרגרי במשך 120 דקות של דגירה.
הערה: הפתרון מעל גרגרי שיוחסו יהפוך שקוף במהלך שלב 2.6 כפי proteoliposomes נוצרות.
- חזור על תחילתה של גרגרי פוליסטירן ו incubations כדלקמן: להוסיף 50 מ"ג של גרגרי למשך 60 דקות של דגירה; להוסיף 100 מ ג של גרגרי למשך 60 דקות של דגירה; ולהוסיף 100 מ ג של גרגרי במשך 120 דקות של דגירה.
- להפריד את הפתרון proteoliposome גרגרי פוליסטירן באמצעות micropipette עם טיפ דק. לדלל את הפיזור של 90 מ של 20 מ מ מגבים-קו/30 מ מ K2אז4, pH 7.4 (מאגר MOPS) להעביר צינור ultracentrifuge Ti45.
- Ultracentrifuge הפיזור באמצעות סוג 45 Ti הרוטור-125,000 g x (ב- rמקסימום) עבור h 1 כדי הצניפה את proteoliposomes.
הערה: צינורות צנטריפוגה קטנים יותר ניתן להשתמש למרות הדילול בכרך מאגר גדול מסייעת להפחית את ריכוז HPTS שאינו כמוס ההשעיה הסופי. - למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי עם 20 מ מ מגבים-קו/30 מ מ K2כדי4, pH 7.4 מאגר (ללא resuspending בגדר). לאחר השמטת המאגר השטיפה, מחדש להשעות את proteoliposomes ב µL 500 MOPS מאגר מאת pipetting זה הלוך ושוב עם קצה דק micropipette. ואז להעביר צינור פלסטיק 1.5 מ.
- Centrifuge המתלה למשך 5 דקות ב g x 12,000 לפנות את הפסולת. להעביר את תגובת שיקוע (proteoliposomes משוקם) לתוך בקבוקון חדש.
- פיזור proteoliposomes משוקם ב 4 ° C בלילה לאחסן ולהשתמש תוך יומיים.
3. ייצור של אלקטרודות זהב שקוף למחצה
הערה: חלק משטח זהב מתקבל על ידי שיטה הפשטת תבנית 30 ננומטר בעובי שכבה של זהב 99.99% פרוסות סיליקון מאגרי חלקה. עובי השכבה זהב קטנים חשוב מכיוון שזה חייב להיות שקופה למחצה כדי לאפשר הבחנה קרינה פלואורסצנטית. הפרטים של זהב אידוי (בתצהיר אדים הפיזי, PVD) ניתן למצוא במקום אחר16 , והוא היחיד תבנית-בנוכחות אחר מכוסה כאן. לחלופין, שבבי זהב ultra-חלקה ניתן לרכוש במקום אחר (ראה טבלה של חומרים).
- דבק עד 9 תלושי כיסוי זכוכית (0.17 מ מ עובי) על גבי משטח זהב המתאיידים באמצעות נמוך-זריחה דו קומפוננט. לרפא את הדבק ב 80 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
- לפני השינוי עם עצמי שהורכב חד שכבתי (שלב 4), לנתק את פתקי כיסוי זכוכית מ סיליקון עם להב. עקב דלילות שער גולשת, להיזהר בעת ניתוק של שער גולשת לא סדק או לשבור את השקופיות זכוכית.
4. שינוי פני השטח זהב עם עצמי שהורכב חד שכבתי (SAM)
- להכין 5 מ של תמיסת מים 1 מ 6-mercaptohexanol (6MH).
- טבלו מנותקת טרי מצופה זהב שער גולשת (שלב 3.1) 6MH פתרון ולהשאיר 20 – 25 ° C בלילה (> 16 h) כדי ליצור את סאם.
הערה: פתרונות תיול יש ריח לא נעים, כך לכלי סגור אמור לשמש כאשר המקננת בתגית מכסה מצופה זהב. - למחרת, הסר תגית מכסה מצופה זהב הפתרון 6MH, לשטוף בקצרה עם מים או מתנול ולאחר מכן עם אלכוהול איזופרופיל. יבש תחת זרם הגז עדינה.
5. אלקטרוכימי בדיקה של פעילות Proteoliposomes
הערה: הפעילות אלקטרוכימי של האנזים קודם מאומתים בשכבה ליפוזומים צפופים (שלב 5), הכיסויים שלפוחית התחתון נמצאים בשימוש שלפוחית אחת ניסוי למדידת pH לשינויים לומן של ליפוזומים (שלב 6).
- להרכיב בתגית מכסה מצופה זהב בתא אלקטרוכימי-ספקטרו (ראה איור 1). ליצור קשר למדליית הזהב עם חוט שטוחה מחוץ לאזור המוגדר על-ידי קונדום o-ring.
- להוסיף 2 מ"ל של הפתרון מאגר אלקטרוליט, הצב את הפניה ואלקטרודות עזר בתא.
הערה: כל עוד דנו במקטע דיון, הפניות אלקטרודות ללא כלוריד המועדפות כדי למנוע היווצרות Au (I) לקלרנית במהלך אלקטרוכימיה. הנה, כספית/Hg2אז4 (ישב. K2אז4) אלקטרודה הפניה משמשת ניתנת פוטנציאל לעומת אלקטרודת מימן סטנדרטי (היא) באמצעות V 0.658 vs היא כספית/Hg2אז4 (לווייני. K2אז4). - להפעיל עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה (0.1 הרץ – 100 kHz)-תאים פתוח פוטנציאליים את הפוטנציאל (מכ) כדי להעריך את האיכות של סאם. להמיר ערכי עכבה בקבלה, לחלק ב- 2πω כדי לתכנן מזימה קול-קול, איפה ω התדירות (ראה להלן הפניות16,17,18 לקבלת פרטים אודות המרת ופרשנות עכבה ספקטרה).
הערה: סאמס דחוס וצפוף של 6MH צריך לתת קרוב לחלקה קול-קול חצי עיגול, לתת קיבוליות ערכים בטווח 2.5 – 3.0 µF/cm2 (איור 2 א). אם סטייה משמעותית צורת חצי עיגול או קיבול מחוץ לטווח הערכים מתקבלים, לשנות את האלקטרודה. - לרוץ voltammograms מחזורית ריק (CVs) עם סריקה המחירים 100 ו- 10 mV/s באזור פוטנציאליים-0.3 – 0.8 V. קורות חיים אופייני מוצג על (איור 2B, קו מקווקו).
הערה: זה צריך להפגין התנהגות קיבולי כמעט טהור, היעדרות של זרם faradaic משמעותית, אפילו בתנאים חמצן סביבתי משמש כאן. - להוסיף סוללת proteoliposomes (ריכוז ליפידים סופי 0.5 מ"ג/מ"ל, 1-2% (w/w) יחס ציטוכרום בו3 השומנים) ומערבבים מעט עם פיפטה. המתן עד ספיחה של proteoliposomes על פני האלקטרודה סיים (30-60 דקות בטמפרטורת החדר).
הערה: ניתן להפעיל voltammograms מחזורית (CVs) ב mV 10/s במהלך ספיחה proteoliposomes לעקוב אחר התהליך. ספיחה מסתיים כאשר CVs רצופים תפסיקי להחליף. מידע על טכניקות קורות חיים ניתן למצוא בספרי הלימוד הבאות. 19 , 20 - לשטוף את התא על-ידי שינוי את בופר לפחות 10 פעמים אך להימנע מלהשאיר את השטח אלקטרודה יבש לחלוטין.
- הפעל את ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימי ג'ונס (איור 2 א, קו כחול) כדי לאשר שסאם על האלקטרודה זהב נותרת ללא שינוי ולסרוק CVs עם המחירים 10 ו- 100 mV/s להתבונן חמצון הקטליטי ubiquinol (וצמצום חמצן) על ידי ציטוכרום בו 3 -תחילת פוטנציאל של הפחתת quinone אלקטרוכימי על V 0 לעומת היא) (איור 2B).
6. זיהוי של פרוטון אנזימטי שאיבה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ
- לשנות את האלקטרודה זהב כמו שלב 5 אבל באמצעות 100 x פחות proteoliposomes לעומת שלב 5.5 (קרי, µg 5/mL). ללימודים אנזים יחיד, להפחית את לבושל ציטוכרום3 יחס השומנים 0.1-0.2% (w/w).
הערה: ליפוזומים דלילי לספוח על פני האלקטרודה הפעלת שלפוחית אחת פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בתנאים אלה יחיד-אנזים, כמות האנזים ותשמרו על פני האלקטרודה אינה מספיקה עבור הצפיה זרם קטליטי. - מניחים את סוללת על המטרה שמן (60 X) של מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עם טיפת שמן טבילה. באמצעות המסננים המתאימים עבור FDLL פלורסצנטיות, מתמקדים פני האלקטרודה. ליפוזומים יחיד צריך להופיע כתמים בהירים על גבול עקיפה המטרה/המיקרוסקופ. קח תמונה של זריחה FDLL.
- לעבור אחת מערכות סינון קרינה פלואורסצנטית HPTS על מיקרוסקופ כדי לוודא כי HPTS הוא ברור לעין, שקירב הרקע (זמן חשיפה שבחרת, ראה שלב 6.4). להגביר את עוצמת האור, אם זה לא המקרה.
- לתכנת את התוכנה מיקרוסקופ כדי לבצע ייבוא תמונות מתוזמן של לסירוגין שתי מערכות סינון HPTS (תפריט יישומים | Define/Run רכישת ND). הגדרת ההשהיה בין התמונה רכישות לכל הפחות. בניסוי זה, השתמש חשיפה של 1 ו- 0.3 s עיכוב (עקב תנועת צריח).
הערה: היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית-אלה שני ערוצים מאוחר יותר יומרו ל pH בתוך ליפוזומים בכל נקודה בזמן. משך הזמן של הרכישה יכולה להשתנות לפי שער שינוי pH הצפוי; 5 דקות משמשת במאמר זה. - התאם את ההגדרות של potentiostat כדי לשנות את הפוטנציאל במהלך רכישת התמונה. לדוגמה, בניסוי זה, להשתמש ברצף הבא: 0 – 60 s: אין פוטנציאל חלה (דהיינו עיקרון פתיחות/סגירות); 60 – s: 180-0.2 V (לעומת היא); 180-s: 300 0.4 V (לעומת היא). במקרה זה, רק פוטנציאל יישומי בשלב השני (-0.2 V vs היא) מספיקה ביעילות להפחית לבריכה quinone.
- להפעיל בו זמנית את רכישת תמונות מתוזמן (מיקרוסקופ) ואת הרצף פוטנציאליים (potentiostat) מאת באופן ידני החל שתי מדידות באותו זמן.
הערה: הניסוי שיכול לחזור על האלקטרודה באותו הזמן מספר על-ידי הזזת השלב מיקרוסקופ לאזור אחר על פני השטח. ההשהיה בין הרכישות צריך להיות לפחות 5-10 דקות כדי להבטיח equilibration pH מלאה של ליפוזומים על פני השטח. ניתן להחיל משכים שונים ודפוסי פוטנציאליים בהתאם הצורך, למרות הדמיה זמן מוגבל בשל photobleaching של HPTS במהלך הרכישה.
7. ניתוח של תמונות קרינה פלואורסצנטית
הערה: ניסוי טיפוסי מייצרת קבוצת תמונות בצעד זמן (למשל, 2.6 s) עבור כל אחד בין שני הערוצים, קרי, (משך * 2 / 2.6) תמונות. דוגמה כזו תמונה להגדיר שהוקלט במהלך ניסוי אנזים יחיד ניתן לגשת דרך מאגר מחקר נתונים לידס21. טיפול תמונה כוללת מספר שלבים באמצעות פיג'י (ImageJ) של אנליזה מתמטית ברמה גבוהה תכנות תוכנה לעברית (מעתה ואילך המכונה כמו scripting תוכנה, לפרטים, ראה טבלה של חומרים ).
- השתמש פיג'י להפריד זמן לשגות קובץ, ליישר תמונות ולשמור ערוצים נפרדים, מסגרת זמן.
- פתוח זמן לשגות קובץ באמצעות היבואנית Bioformats שרשמת פיג'י (פקודת מאקרו: לרוץ ("יבואן ביו-תבניות")).
- להשתמש את התוסף StackReg כדי ליישר כל מסגרת הראשונה על הבמה אפשרי תנועות או להיסחף תרמי אירעה במהלך רכישת (פקודת מאקרו: לרוץ ("StackReg", "שינוי = תרגום")).
- לשמור קבצי תמונה לא דחוסה נפרד עבור כל ערוץ, כל שלב זמן בתבנית TIFF בתוך תיקייה אחת.
- לחלץ את חותמות הזמן המדויק לכל אחת מהמסגרות המטא זמן לשגות קובץ ולשמור אותם כקובץ CSV באותה תיקיה כשל התמונות. לחלופין, חלץ חותמות זמן באמצעות רכישת תוכנה ולשמור ידנית לתוך קובץ CSV באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני.
הערה: התיקייה עם תמונות וחותמות זמן עכשיו הוא מוכן להיות מנותח על ידי תוכנת ה-scripting. צעדים 7.1.1. – 7.1.4. יכול להיות automatized באמצעות סקריפט פיג'י (קובץ script שנכתב ב פיתון עבור עיבוד אצווה של זמן לשגות קבצים ניתנת, להשתמש "Ctrl-Shift-N" (ב- Windows), אז קובץ | פתוח כדי לטעון את קובץ ה-script).
- השתמש בתוכנת ה-scripting עבור עיבוד automatized של התמונות. לטעון את קוד שסופק על התוכנה ולחצו על רוץ עד הסוף. כאשר תתבקש, בחר את התיקיה המכילה את התמונות מ שלב 7.1.
הערה: קובץ script עבור ניתוח מסופק בתבנית mlx התסריט בשידור חי, עם הערות נרחבות, כדי לזהות ליפוזומים יחיד, להתאים אותם לתפקד 2D-Gaussian, לסנן אותן ולכמת את ערכי ה-pH בכל נקודה של זמן. תת השלבים הבאים מתבצעות באופן אוטומטי על-ידי קובץ ה-script.- לטעון כל הזמן מסגרות תמונות עבור ניסוי יחיד לתוך הזיכרון.
- ממוצע של כל התמונות עבור ערוץ אחד (בחר הערוץ עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה ביותר), להשתמש בתמונה בממוצע כדי לזהות ערכים מרביים כל זה עשויה להתאים ליפוזומים יחיד.
- התאם ערכים מרביים שזוהה על התמונה בממוצע כדי 2D-Gaussian לתפקד ולהציל את הביא מתאים פרמטרים עבור כל ליפוזום (ראה איור 4A לדוגמה ליפוזום מצויד).
- לסנן את ערכים מרביים על פי הקריטריונים הצפוי ליפוזומים יחיד, כגון גודל, מעגליות ועוצמה. דחה ליפוזומים זה הינם מצוידים היטב בשל אות נמוכה לרעש, מקרוב השכנה ליפוזום או גם להיות קרוב לקצה התמונה.
- לטעון את חותמות הזמן של הקובץ החיצוני ובכושר כל ליפוזום המסונן לפונקציה 2D-gaussian על כל תמונה מסגרת זמן בנפרד.
הערה: השימוש תכנות מקבילי בריבוי ליבות CPU יכול לשפר באופן משמעותי את מהירות החישוב בשלב זה. - לסנן ליפוזומים שוב על פי הקריטריונים דומים כמו שלב 7.2.4 אבל שימושית לכל מסגרת זמן.
- על כל צעד הזמן, להגדיר יחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית ליפוזום כיחס של כרכים המוקפים פונקציית 2D-Gaussian מצויד בשני ערוצים. לחשב את ערכי ה-pH של היחס בין עוצמות מחילופי בין שני הערוצים HPTS ושימוש עקומת כיול (שלב 8). מגרש עקומות זמן-pH שהתקבל עבור ליפוזומים ולצפות pH שלהם לשנות הפוטנציאל מוחל.
8. ביצוע עקומת כיול של זריחה HPTS
הערה: כדי להמיר HPTS קרינה פלואורסצנטית יחס pH intravesicular, עקומת כיול תחילה יש ליצור, זה ייקח בחשבון מסוים התנאים של ניסויים כגון זהב להדמיה, מסנני איכות, וכו '. שלב זה חייב להתבצע רק פעם או פעמיים, נתוני הכיול יכול לשמש כל עוד הפרמטרים המדידות וההתקנה נשארים זהים בשלב 6.
- להכין אלקטרודה עם בדלילות הספוחה ליפוזומים (ללא ציטוכרום בו3 כפי שמתואר שלבים 5 ו- 6.1).
- להוסיף 2 µL של פתרון gramicidin 0.1 מ"ג/מ"ל אתנול 2 מ"ל המאגר כדי ליצור את ריכוז 100 ננוגרם למ"ל.
- לכידת שתי תמונות פלורסצנטיות עבור הערוצים HPTS שני.
- לשנות את ה-pH של התא על-ידי תוספת של aliquots קטן של 1 מ' HCl או 1 מ' H2אז4. למדוד את רמת החומציות של המאגר עם מד pH הרגיל, ללכוד שתי תמונות פלורסצנטיות עבור הערוצים HPTS שני.
- חזור על שלבים 8.4 עבור טווח pH 6-9.
- בעזרת האלגוריתם מ- 7.2, להתאים, לסנן, לחשב את היחס הממוצע של זריחה HPTS של ליפוזומים בודדים ב- pH בכל. להשתלט על יחס HPTS הממוצע על כל ליפוזומים.
- מתאים את התלות יחס pH-וכתוצאה מכך את המשוואה הבאה:
, איפה pK, R ו- Rbרבות פרמטרים. - השתמש pK, R ו- Rbכדי להמיר את היחס HPTS של ליפוזומים בודדים בשלב 7.2.7. ערכי ה-pH.
, איפה pK, R ו- Rbרבות פרמטרים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האיכות של תגית כיסוי זהב-לאחרונה (האלקטרודה) עם סאם של 6MH נבדק לפני כל ניסוי עם עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה. איור 2A מראה נציג קול-קול חלקות שנמדדו בשימוש עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה לפני ואחרי ליפוזומים הם הספוחה. אם האיכות של סאם מספיקה, ספקטרוסקופיה עכבה צריך להפגין התנהגות קיבולי כמעט טהור וכתוצאה מכך מגרש קול-קול חצי עיגול. הקוטר של מעגל חצי מגרש קול-קול שווה את קיבול שכבה כפולה של המשטח אלקטרודה, אשר צריכה להיות בטווח2 µF/ס מ 2.5-3.0. שימו לב: קיבול אל תשנה באופן משמעותי על ספיחה ליפוזומים, למרות עלייה קלה בקיבול יכול להיות שנצפו (בחלק התחתון של כיסוי, איור 2A, ליפוזומים גבוהה) או משמרת קלה ב עכבה יכול להיות שנצפו בנמוך תדרים (ליפוזום נמוך הכיסויים, איור 2A, למעלה).
אלקטרוכימיה ניתן לבדוק את פעילות קטליטית של ציטוכרום בו3 proteoliposomes, איפה זרמי קטליטי נמדד עם וולטמטריה משקפים פעילות oxidoreductase ubiquinol-חמצן. עם זאת, זרמי קטליטי משמעותי יכול להתגלות רק על כמויות גבוהות של proteoliposomes הספוחה, שכבה צפופים של proteoliposomes על תגית כיסוי זהב-לאחרונה יש צורך. איור 2B מדגים voltammograms מחזורית נציג (CVs) של האלקטרודה לפני ואחרי ליפוזומים ספיחה גם כיסוי ליפוזום נמוך או גבוה. זרם faradaic לא נצפית ב- CV ריק כי הפחתת חמצן על ידי האלקטרודה זהב חשופות חסומה על-ידי סאם כאשר השטח רווי ליפוזומים עם ציטוכרום גבוהה בו3 תוכן (1.3% (w/w) במקרה זה), גל ברור קטליטי עקב ירידה בחמצן נצפית עם פוטנציאל התפרצות של 0 V, קרי, את הפוטנציאל של ubiquinone הפחתה (איור 2B, הקו הכחול). הבריכה ubiquinone פועל כמו המצע הטבעי עבור האנזים והן בתור מתווך אלקטרון, העברת אלקטרונים האנזים פני האלקטרודה. נציין כי תחת כיסוי ליפוזום גבוהה, אין הבחנה של שלפוחית בודדים הינה אפשרית באמצעות מיקרוסקופ, כיסוי נמוך נדרשת ללימודים ליפוזום יחיד. -כיסוי ליפוזום נמוכה (אך חלבון גבוהה ליחס שומנים בדם), הזרם קטליטי פוחת באופן משמעותי, בקושי להבדיל בין הרקע (איור 2B, קו אדום). שימו לב כי בתנאים יחיד אנזים (חלבון נמוכה ליחס שומנים בדם), הזרם קטליטי אפילו. יותר נמוך, לא ניתן למדוד באופן מהימן.
איור 3 מראה תמונות זריחה של ליפוזומים הספוחה על האלקטרודות על שלושת הכיסויים השונים. כל התמונות צולמו בתנאים זהים האור וחשיפה, הבהירות שלהם היה מותאם באופן שווה כדי לאפשר השוואה ישירה. הצבע-המכיל-ליפוזומים גלויים על התמונות כמו כתמים בהירים. החלק המרכזי של התמונה היה photobleached במשך כמה דקות כדי לחשוף את הרקע רמת קרינה פלואורסצנטית (נציין כי FDLL הינה יחסית photostable ואינה photobleached לחלוטין ב איור 3). התמונות על שני ערוצים HPTS הן superimposable, שבו היחס בין שני הערוצים (410/535, 470/535) מקביל pH 7.4 השתמשו בניסוי זה. מספר גדול יותר של ליפוזומים גלויים עם התעלה FDLL, אשר מעיד על קיומם של ליפוזומים שיש אין HPTS אנקפסולציה. ההבדל בין הערוצים HPTS ו- FDLL מודגש יותר על הכיסויים גבוה יותר, אולי בגלל בכיסוי ליפוזום גבוהה, של ליפוזומים הם נוטים יותר פרץ או הפתיל על פני השטח.
ניתוח התמונה דורש את היישור של מסגרות (נגד המסגרת הראשונה) באמצעות ImageJ, תוסף StackReg. היישור הוא חיוני ברוב המקרים מאז סחיפה תרמית קלה של המדגם מתרחשת בדרך כלל בתוך ציר הזמן של הניסוי, שינוי הציון ליפוזום. כל ניתוח נוסף מתבצעת באמצעות קוד תוכנה scripting. קוד זה מבצע זיהוי ליפוזום אוטומטית. כמו הגודל של ליפוזומים הם מתחת לגבול עקיפה אבה, פלורסצנטיות שלהם נראה כמו נקודה להפיץ את הפונקציה הרבה יותר גדול מאשר הקוטר ליפוזום בפועל (איור 4A). הקוד מתאים את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כל שלפוחית על שני ערוצים לפונקציה 2D-Gaussian (איור 4A) ומחשב היחס הנפחי בעוצמה כי ניתן להמיר את ה-pH באמצעות עקומת כיול. על-ידי ביצוע פעולות אלה על כל הזמן מסגרות, ה-pH מתקבל בתוך כל שלפוחית בתוך ציר זמן של הניסוי (1 סרטים). איור 4B מציגה את medians של כל השינויים pH שלפוחית בתוך תמונה אחת כאשר התוכן בו3 ציטוכרום 1.3%. עלייה ב- pH (שאיבת פרוטון) היא בבירור מתי פוטנציאלי בין -0.1-0.3 V מוחל, אבל לא על 0 V מאז שהאחרון אינה מספיקה כדי להפחית לבריכה quinone. כאשר התוכן בו3 ציטוכרום הוא נמוך בהרבה (יחס חלבון-כדי-השומנים של 0.1%, איור 4C), העיקולים החציוני להפוך כמעט ולא מאלה של ריק ליפוזומים (איור 4D). ההבדל שמשטר כאשר בוחנים pH בודדים עקבות של ליפוזומים אקראי (איור 5, 6 ו- 7). בעוד ליפוזומים ללא ציטוכרום בו3 להציג ללא שינויים משמעותיים pH לגבי רעש (איור 7), מבחר של ליפוזומים להראות עלייה (דומיננטית) או ירידה של pH כאשר פוטנציאל להחיל את הפעילים ציטוכרום בו3 (6 דמויות, אזור אפור). ההבדל ברור ב- pH-רשמים בין ליפוזומים בקנה אחד עם היחס חלבונים שומנים בדם נמוכה, שם נמצא ציטוכרום בו3 רק נוכח תת קבוצה קטנה של פעילות ליפוזומים. השכיחות של עלייה pH מעל ירידה מוסבר על ידי שיטת שיחזור לזה טובות אוריינטציה "כלפי חוץ" של מולקולות האנזים (ca. 75%). השבר של ליפוזומים המציגים שינוי ה-pH מעלה כאשר ציטוכרום בו3 השומנים יחס גבוה (איור 5). שימו לב גם כי כמה ליפוזומים להפסיק את שאיבת פרוטון, להיכנס למצב פליטת פרוטון לפני הסוף של היישום פוטנציאליים. אנו מייחסים התנהגות זו ציטוכרום בו3 מולקולות הזנת הדליפה מדינה, אשר מאפשר פרוטונים לזרום בחזרה לתוך לומן ליפוזום14.
ניתוח נוסף של עקבות pH כולל שלהם מתאים והנחישות של פרוטון שאיבה/דולף המחירים יכול להיעשות באמצעות סקריפט ואנו ניתן להשיג מהמאגר לידס נתוני המחקר פורסמו בעבר14,22 23 , 24.
איור 1: העיקרון של השיטה. (א) עקרון ניטור פעילות אנזים יחיד, (ב) את הערכה של ההתקנה נסיוני בשימוש זה לעבוד עם שוט הסחה כדי להדגים חלק פנימי, פנימיות של התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אלקטרוכימי התגובה של ליפוזומים. (א) קול-קול חלקות נמדד ג'ונס (V 0.22 vs היא; ושחורה בריבוע) לפני ואחרי ליפוזומים (1.3% w/w ציטוכרום בו3) ספיחה של פתרונות בריכוזים של µg 5/mL (הקו האדום), 500 µg/mL (הקו הכחול). (ב) voltammograms מחזורית-mV 100/s (החלונית הימנית) ו- 10 mV/s (לוח הנכון) של Au-סם (קו מקווקו שחור) לפני ואחרי ליפוזומים (1.3% w/w ציטוכרום בו3) ספיחה מפתרונות ריכוזים של 5 µg/mL (הקו האדום), 500 µg/mL (קו כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זריחה מיקרוסקופיה של ליפוזומים. קרינה פלואורסצנטית תמונות של ליפוזומים-הכיסויים משטח שונים: משטחים הדגירה למשך 30 דקות עם פתרון ליפוזומים של 5 µg/mL (שורה עליונה), µg 20/mL (בשורה האמצעית) ו- µg/mL 500 (השורה התחתונה). בעמודה הימנית מקביל 470/535 nm עירור/פליטה מסנן ההתקנה (ערוץ HPTSst 1); העמודה האמצעית - 410/535 nm (ערוץ HPTSnd 2); בעמודה הימנית - 560/645 nm (ערוץ FDLL). התמונות צולמו בהגדלה 90 X (60 X אובייקטיבית, 1.5 X הגדלה על ידי המיקרוסקופ לפני המצלמה), חשיפה של 1 ועוצמת אור דומה. סרגלי קנה מידה מתאימות 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זיהוי ליפוזום ו- pH לשנות. (א) 3D-תצוגה של חלק של התמונה פלורסצנטיות המכיל של ליפוזום בודד אופייני. בעוצמתה פלורסצנטיות נראה כמו נקודה להפיץ את הפונקציה (צבע משטח) מצויד לפונקציה 2D-Gaussian (רשת שחורה). PH (B-D), להציג את החציון של כל שלפוחית בתוך שטח תמונה בודדת (בדרך כלל כמה מאות) על פוטנציאל יישומי שונים. מ 0-60 s, אין פוטנציאל מוחל (ג'ונס). בין 60 ל- 180 s (אזור אפור) הוחלו פוטנציאל שונים: 0 V (שחור), -0.1 V (אדום),-0.2 (ירוק), V-0.3 V (כחול). בין 180 ל- 300 s, 0.4 V vs. היא הונחה. ציטוכרום בו3 השומנים יחסי היו (B) 1.3%, (ג) 0.1%, (ד) 0%. העקבות הם קיזוז עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: pH עקבות של ליפוזומים המכיל 1.3% של האנזים. עקבות של pH לשנות של 72 יחיד ליפוזומים, שנבחרו באקראי, המכיל ציטוכרום בו3 (1.3% w/w) נמדד וניתח במהלך ניסוי אחד. מ 0-60 s, אין פוטנציאל הוא מיושם (מכ); בין 60 ל- 180 s (אזור אפור)-0.2 V vs. היא; בין 180 ל- 300 s, 0.4 V vs. היא הונחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: pH עקבות של ליפוזומים המכיל 0.1% של האנזים. עקבות של pH לשנות של 72 יחיד ליפוזומים, שנבחרו באקראי, המכיל ציטוכרום בו3 (0.1% w/w) נמדד וניתח במהלך ניסוי אחד. מ 0-60 s, אין פוטנציאל הוא מיושם (מכ); בין 60 ל- 180 s (אזור אפור)-0.2 V vs. היא; בין 180 ל- 300 s, 0.4 V vs. היא הונחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: pH עקבות של ליפוזומים ללא אנזים. רשמים של שינוי ה-pH של ליפוזומים יחיד 72, שנבחרו באקראי, בלי ציטוכרום בו3 נמדד וניתח במהלך ניסוי אחד. מ 0-60 s: אין פוטנציאל הוא מיושם (מכ); בין 60 ל- 180 s (אזור אפור)-0.2 V vs. היא; בין 180 ל- 300 s, 0.4 V vs. היא הונחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: אנימציה של שינוי ה-pH ליפוזום יחיד. (לוח העליון) שינוי פלורסצנטיות ליפוזום בערוצים שני HPTS (מוצג 3D-פני מגרש של האזור המקביל) במהלך 300 s של הניסוי. חותכות פוטנציאל הוחלה בין 60 s ו- 180 ס' (פאנל התחתונה) עלילה המתאימה של יחס נפח בעוצמה של שני ערוצים HPTS נגד הזמן. ה-zone של חותכות פוטנציאל היישום מוצלל באפור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
קבצים משלימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקבצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת מתאימה ללמוד פרוטון שאיבה על ידי חלבונים ממברנה הנשימה יכולה להיות מחדש לתוך ליפוזומים והם מסוגלים להחליף אלקטרונים עם הבריכה quinone. פרוטון שאיבה פעילות ניתן לנטר ברמת אנזים יחיד באמצעות צבעי רגיש pH (רציומטרי) במארז ליפוזום לומן (איור 1 א').
השיטה מתבססת על היכולת של ubiquinone (או קווינונס אחרים), שולבו על שכבה ליפידית, להחליף אלקטרונים עם אלקטרודות שופרת סאם18. המאפיינים של האלקטרודה זהב, שונה עם סאם, הן מאוד ספציפיות. ליפוזומים צריך לספוח על גבי את סאם וסאם צריך להיות דק מספיק כדי לאפשר חמצון מהיר אלקטרוכימי וצמצום של הבריכה quinone בתוך ליפוזומים. חשוב מכך, האינטראקציה בין אלקטרודה ליפוזום צריך להיות חלש מספיק שלא לפגום בשלמות קרום השומנים. יתר על כן, בהתאם הפרטים של מערכת ניסויית, רצוי אם SAM מונעת ריאקציות צדדיות מזורז-זהב, כגון הפחתת חמצן. בסופו של דבר, סאם צריך להיות יציב בתוך חלון פוטנציאליות בשימוש. השימוש של אלקטרודות זהב שטוח אולטרה ששינה עם סאם באיכות גבוהה של 6MH ממלא את הדרישות הללו במקרה של ציטוכרום בו3. בנוכחות אחר אלקטרודות זהב של מאגרי מי במול סיליקון יוצר משטח זהב של ultra-חלקה עם סאם אידיאלי ליד כמצוין על-ידי ספקטרום עכבה. אנא שימו לב כי אנחנו טופס את סאם מ 6MH במים. דיווחנו בעבר על סאמס עם 6MH אלכוהול איזופרופיל16, אבל אלה סאמס התערוכה ספקטרה עכבה להצביע על משטח הטרוגנית יותר וערכים שכבה כפולה קיבוליות גבוהה יותר (כלומר., פגמים נוספים) עם התנגדות נמוכה יותר. יתר על כן, כאשר סאמס מ 6MH מוכנים פתרון מים, הפחתת חמצן פחות רקע (עקב הפחתת חמצן מזורז זהב) הוא ציין בהשוואה סאמס נוצר פתרון אתנול/אלכוהול איזופרופיל. כל התצפיות הללו מציינים כי סאמס מ 6MH בתחום פתרונות המים יש איכות גבוהה יותר עם פחות פגמים. סאמס באיכות גבוהה יותר גם יכולים להיווצר מתוך תיול-תרכובות עם שרשראות אלקאן יותר (למשל, 1-הידרוקסי-decane-תיול), אבל קינטיקה העברת האלקטרונים להיות איטי כפי מגדילה עובי סם.
במהלך (ספקטרו) אלקטרוכימיה, כלורידים להימנע את בופר מאז הם אולי chemosorb על פני השטח זהב-פוטנציאל גבוה, אולי מתדרדר איכות סם. מאותה סיבה, אלקטרודה הפניה ללא כלוריד צריך להיות המועדפת.
נקודה חשובה נוספת היא החדירות רקע של ליפוזומים כדי פרוטונים, אשר צריכה להיות נמוכה מספיק כדי לאפשר פרוטון הצטברות כתוצאה פרוטון אנזימטי רוברטסונית ציר הזמן של הניסוי. ההרכב המדויק השומנים עשויים להשפיע זה חדירות. בעבודה שלנו, אנו משתמשים קוטבי e. coli תמציות השומנים בתוספת ubiquinone-10. חדירות פרוטון הוכח להיות תלוי בחום אורך שרשרת חומצות שומן25, למרות זה סותר מחקרים עם קומפוזיציות מורכבות יותר שומנים בדם26. מעניין, ubiquinone לאחרונה הוכח כדי לשפר את יציבות הממברנה27. בסופו של דבר, דטרגנטים שיורית מההליך שיחזור חלבון יכול להשפיע על זליגת פרוטון, ומכאן חשוב להסיר חומרי ניקוי באופן מלא ככל האפשר באמצעות גרגרי פוליסטירן הידרופוביות, דילול ואחריו צנטריפוגה, שטיפה יסודית של תא אלקטרוכימי לאחר הספוחה הן proteoliposomes על פני השטח. אם בספק, חדירות ליפוזום ניתנת לאימות כמקורית על-ידי ביצוע שינוי ה-pH לומן (via HPTS) בתגובה קפיצה pH חיצוניים28.
אנזים יחיד מדידה דורשים ליפוזומים unilamelar ו ליפוזומים קטנים צפויים כדי להציג את השינויים מהר יותר או גבוה יותר pH כמו מתנמכים של לומן. כדי להשיג זאת, גרגרי פוליסטירן מתווספים בהדרגה בכמויות קטנות, המוביל אל קצב איטי של היווצרות ליפוזומים. בתנאים כאלה, ליפוזומים קטנים בגודל הומוגנית נוצרות בקוטר ממוצע 70 nm ואינדקס polydispersity של 0.24 במקרה שלנו,14. HPTS גם adsorbs על גרגרי פוליסטירן, הפחתת הקיבולת של גרגרי פוליסטירן כדי לספוח דטרגנט. לפיכך, יש להוסיף גרגרי פוליסטירן עודף כדי לפצות על אובדנו. טיפול עם גרגרי פוליסטירן נצפתה כדי להפחית את ריכוז HPTS ההשעיה חלבון השומנים על ידי כרבע (מ- 5 מ ל 3-4 מ מ). עם זאת, הריכוז HPTS בפועל בלומן של ליפוזום יכול להיות גבוה יותר מאז ליפוזומים נוצרים מוקדם על הטיפול עם גרגרי פוליסטירן. במקום HPTS, צבעי pH רגישים אחרים יכול לשמש. עם זאת, חשוב כי לצבוע היא ממברנה-אטום, רציומטרי. האחרון מונע שגיאות ניסיוני בשל photobleaching ואת כמויות משתנות של צבען שעברו אנקפסולציה.
ניתן לבצע חישובים פשוטים כדי להעריך אם, stochastically, רוב ליפוזומים ריקה להכיל מולקולת אנזים אחד בלבד. בהנחה של קוטר ליפוזום ממוצע של 70 nm, משקל מולקולרי השומנים של 750 Da ואזור השומנים של 0.65 nm2 נותן לנו מסה ליפוזום של 5.2x10-17 g, קרי, 9.6x1013 ליפוזומים לכל הכנה (5 מ"ג של שומנים בדם). ב- 0.1% של ציטוכרום בו3 (MW = 144 kDa), מולקולות האנזים13 עונה 2 פרק 10 נוכחים, המתאים יחס חלבון 0.2: ליפוזום. באמצעות התפלגות פואסון, אחד נוסף יכול לחשב את זה ההסתברות למצוא מולקולה אחת של אנזים (17 אחוז) לכל ליפוזום הוא גבוה פי 10 מאשר ההסתברות למצוא מולקולה יותר מפעם אחת (1.7%). ניתן לבצע חישובים מדויקים יותר אם התביעות של אנזים ושומנים במהלך בנייתו מחדש מחילופי מבחני המתאים נלקחים בחשבון. האחרון יכול להיות מוערך על שיטת, על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית FDLL של ליפוזומים מוכן.
ברגע בפרוטוקול נקבע אנזים יחיד עקבות נרשמים, עוד שינויים של השיטה הוא ריאלי בהתאם המטרה. ניתן לחשוב על תוספת מעכב אנזים או הקדמה של ionophore לתוך המערכת. צריך לקחת כדי לוודא כי תוספת של ממיסים להכין ionophore או מעכב המניות אינה משפיעה המדינה של סם או חדירות של ליפוזומים.
הטכניקה כפי שמתואר כאן מוגבל לקבוצה מסוימת של אנזימים כי הן ממברנה פרוטון מובילי quinone והמרה. הציוד והתנאים ניסיוני משמש כאן היו אופטימיזציה עבור הפעילות האנזימטית מתרחשת של ציטוכרום בו3. כאן, הפתרון זמן הוא 2-3 שניות, שקבע את זמן החשיפה ואת הזמן שלוקח הצריח להחליף מסננים. משך הניסוי הוא מוגבל על-ידי photobleaching של הפלורסנט ו, לכן, על-ידי עוצמת האור. אנחנו גילינו בעבר פרוטון ממוצע שיעור טרנסלוקציה של ציטוכרום בו3 להיות 73 ± 2.2 פרוטונים/s באמצעות טכניקה זו, למרות פעילויות עד 20 פרוטונים/s התגלו. לשימוש טכניקות אלו אנזימים בפעילות או פחות או יותר, התמונה רכישה פרמטרים צריכים להתאים (כלומר., אור בעוצמה, זמן החשיפה ומשך ניסוי). בעתיד, בשיטה זו ניתן להאריך כלפי אחרים תחבורה אלקטרון נהיגה פרוטון שאיבת אנזימים, למשל להיות מתחם מיטוכונדריאלי אני. אנזימים אחרים עשויים לדרוש פרוטוקולים שונים שיחזור, זה היה צריך להיות אופטימיזציה עבור כל טרנספורטר שונים. משאבות פרוטונים שאינם והמרה quinone אנזימים ניתן גם למד, למשל, מונחה-ATP29, אמנם במקרה זה רוברטסונית פרוטון לא יכול להיות מופעלות electrochemically, אך נדרשת תוספת של יזם (למשל, ATP). במקרה האחרון, יש צורך להשתמש תגית כיסוי זהב-השתנה. יתר על כן, ובלבד צבע פלורסנט ממברנה-אטום, רגיש יון מתאים משמש, בשיטה זו ניתן להרחיב אחרים משאבות יוניים, למשל, נתרן ואשלגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר את BBSRC (BB/P005454/1) עבור תמיכה כספית. מלון NH מומן על-ידי התוכנית חוקר צעיר קרן VILLUM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al.
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -M., Yeung, E. S.
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J.
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
